專利名稱：一種高密度培養多粘類芽孢桿菌的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵領域，更具體涉及一種高密度培養多粘類芽孢桿菌 {Paenibacillus polymyxa )的方法。
背景技術：
多粘類芽孢桿菌QPaenibacUIus polymyxa)是一種產芽孢的G+細菌，對人或動植物沒有致病性，可產生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶、植物激素、絮凝劑等多種生物活性物質， 兼有生物農藥和生物菌肥的作用，已廣泛應用于農業、工礦業及廢水處理等領域。美國環境保護署(EPA)已將其列為可在商業上應用的微生物種類之一，我國農業部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種。多粘類芽孢桿菌是一種植物根際促生細菌，一方面可以用作微生物肥料，促進植物生長、提高作物產量；另一方面，可以有效防治植物細菌性和真菌性土傳病害，對植物青枯病、番茄枯萎病、油菜腐爛病、黑松根腐病等多種植物病害具有很好的防治效果。傳統農業中化學農藥的過量使用不僅會增加農藥殘留量，同時導致了許多作物病蟲害的抗藥性，并對土壤、水體及生態環境造成污染。隨著社會的進步，人們生活水平的提高，對食品安全的意識不斷加強，在這種情況下應用高效、廣譜、安全、無毒的有益微生物進行植物疫病的防治越來越受到人們的重視。多粘類芽孢桿菌產生的多肽類抗菌物質對植物病原真菌具有很好的拮抗活性，且性質比較穩定，可用于多種植物病害的生物防治。因此， 多粘類芽孢桿菌是一類極具開發前景和應用價值的生防細菌。目前國內對多粘類芽孢桿菌的研究主要集中在菌種的篩選、分離鑒定、抑菌效果以及對發酵液化學成分的分析，而對于多粘類芽孢桿菌的發酵培養方面還罕見報道。

發明內容
本發明提供了一種高密度培養多粘類芽孢桿菌的方法，以提高多粘類芽孢桿菌的
菌體產量。本發明提供的高密度培養多粘類芽孢桿菌的方法，具體如下以多粘類芽孢桿菌 (.Paenibacillus polymyxa)為菌種，經活化后接種到發酵培養基中培養。發酵培養基為可溶性淀粉15-20g/L、蛋白胨20-25 g/L, NaCl 0.5-1.25 g/L、 Na2HPO4 0. 2-0. 5 g/L、CaCl2 0. 5-1. Og/L, ρΗ7· 0-8. 0 ；培養條件培養溫度 30_33°C、轉速 170-200r/min、裝液量 60-80mL/250mL ；接種量為 10-15% (v/v)，培養時間 18_20h。
更優選地，可溶性淀粉 17.5 g/L、蛋白胨 25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L、Na2HPO4 0.5 g/ LXaCl2 1. 0 g/L，pH7. 5 ；培養條件培養溫度 30°C、轉速 170r/min、裝液量 80mL/250mL ；接種量為10% (v/v)，培養時間18h。所述活化采用牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂 15g-20g，蒸餾水 IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C活化 24h。
經過以上條件優化，多粘類芽孢桿菌的細胞生物量可達5. 3X109cfu/mL,比優化前
3(3. 17X108cfu/mL)提高了 15. 72 倍。本發明的顯著優點多粘類芽孢桿菌是一種非常具有應用潛力的生物農藥和微生物肥料，但要實現商業化，還必須加強培養基及培養條件優化等方面的研究。本發明通過對培養基配方及培養條件的研究，為多粘類芽孢桿菌的工業化發酵生產以及進一步開發利用打下基礎。


圖1為多粘類芽孢桿菌的生長曲線；
圖2為不同碳源對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖3為可溶性淀粉添加量對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖4為不同氮源對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖5為蛋白胨添加量對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖6為不同無機鹽種類對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖7為培養基初始PH值對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖8為培養溫度對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖9為轉速對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖10為培養基裝液量對多粘類芽孢桿菌生長的影響； 圖11為接種量對多粘類芽孢桿菌生長的影響。
具體實施例方式以下實施例采用的多粘類芽孢桿菌為多粘類芽孢桿菌S-7 (參考文獻史應武等， 內生多粘類芽孢桿菌S-7對甜菜光合作用及產量和品質的影響.應用生態學報，2009，20 (3) =597-602.)，進一步描述本發明，但是本發明不僅限于此。實施例1
1.多粘類芽孢桿菌生長曲線的測定
將多粘類芽孢桿菌活化后，以5% (ν/ν)的接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH7. 0-7. 2)中，裝液量100mL/250mL， 在30°C、200r/min下培養，分別采用分光光度法和平板菌落計數法測定不同培養時間時的 OD600值和菌落數，以培養時間為橫坐標、分別以OD6tltl值和菌落數為縱坐標繪制生長曲線圖 (圖1)。由生長曲線確定多粘類芽孢桿菌的最佳培養時間為18h。2.多粘類芽孢桿菌的培養基配方優化
以牛肉膏蛋白胨液體培養基為基礎培養基，研究不同碳源、氮源、無機鹽對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響。培養條件接種量5% (v/v)，裝液量100mL/250mL，在30°C、200r/ min下培養18h。2.1碳源種類對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
分別以1%(表示g/100mL，以下類同)的蔗糖、環糊精、麥芽糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、葡萄糖為碳源，取代牛肉膏蛋白胨液體培養基中的牛肉膏，考察它們對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響，以碳源種類為橫坐標，0D_增長量為縱坐標作圖。圖2顯示，以可溶性淀粉為碳源時，多粘類芽孢桿菌的0D_增長量最大，為1. 184 ；而用乙酸鈉和葡萄糖作為碳源時，0D600增長量較小。綜合細胞生物量和培養基成本進行考慮，確定采用可溶性淀粉作為碳源。2.2碳源添加量對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
比較可溶性淀粉不同添加量對多粘類芽孢桿菌生長的影響，以碳源添加量為橫坐標， 0D_增長量為縱坐標作圖(圖3)。結果表明，隨著可溶性淀粉添加量的增加，0D_增長量也不斷提高，當碳源添加量為1. 75%時，多粘類芽孢桿菌的0D_增長量達到最高，為0.982。 隨之繼續增加可溶性淀粉的添加量，OD6tltl增長量緩慢下降。因此，確定多粘類芽孢桿菌可溶性淀粉的最適添加量為1.75%。2.3氮源種類對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
在碳源優化的基礎上，分別以1%的蛋白胨、磷酸二氫銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉為氮源，考察它們對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響，以氮源種類為橫坐標，OD600增長量為縱坐標作圖(圖4)。結果表明，多粘類芽孢桿菌利用蛋白胨作為氮源時，OD6tltl增長量最高，為0.942 ；而采用無機氮源時，細胞生物量相對較低，因此選取蛋白胨作為培養基的氮源。2.4氮源添加量對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
以蛋白胨添加量為橫坐標，以OD6tltl增長量為縱坐標，將菌懸液稀釋10倍后測定0D_ (圖5)。結果表明，隨著蛋白胨添加量的增加，OD6tltl增長量也隨之提高；當蛋白胨添加量為 2. 5%時，多粘類芽孢桿菌的OD6tltl增長量達到最高，為0. 679 ；隨后繼續增加蛋白胨的添加量，OD600增長量有所下降。因此，確定枯多粘類芽孢桿菌的蛋白胨添加量為2. 5%。2.5無機鹽種類對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
在碳源、氮源優化的基礎上，分別以0. 5%的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、鉬酸鈉、 硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵為無機鹽添加到培養基中，以無機鹽種類為橫坐標，0D_ 增長量為縱坐標，將菌懸液稀釋10倍后測定OD6tltl(圖6)，確定最佳無機鹽。結果表明，當以 NaCl、Na2HPO4和CaCl2作為無機鹽時，多粘類芽孢桿菌的OD6tltl增長量較大，分別為1. 101、 0. 825,0. 748，因此選擇NaCl、Na2HP04和CaCl2作為多粘類芽孢桿菌培養的最佳無機鹽。在確定最佳無機鹽種類的基礎上，進一步深入研究無機鹽的最適添加量及其相互作用。2. 6無機鹽添加量對多粘類芽孢桿菌細胞生物量的影響
不同的微生物生長所需的無機鹽種類和濃度不同。上述實驗結果表明，NaCl, Na2HPO4 和CaCl2對多粘類芽孢桿菌生長的影響較為明顯，因此以這三種鹽為考察因素設計正交試驗“(34)，對無機鹽配方進行優化。通過單因素試驗，初步確定上述無機鹽的較優水平分別為 NaCl 0%-0. 25%, Na2HPO4 0%-0. 1%、CaCl2 0%-0. 1%。
表1多粘類芽孢桿菌無機鹽優化正交試驗因素和水平表
權利要求
1.一種高密度培養多粘類芽孢桿菌的方法，其特征在于以多粘類芽孢桿菌(.Paenibacillus polymyxa)為菌種，經活化后接種到發酵培養基中培養；發酵培養基為可溶性淀粉15-20g/L、蛋白胨20-25 g/L, NaCl 0.5-1.25 g/L、Na2HPO4 0. 2-0. 5 g/L、CaCl2 0. 5-1. Og/L, ρΗ7· 0-8. 0 ；培養條件培養溫度 30_33°C、轉速170-200r/min、裝液量 60-80mL/250mL ；接種量為 10-15% (v/v)，培養時間 18_20h。
2.根據權利要求1所述的高密度培養多粘類芽孢桿菌的方法，其特征在于所述發酵培養基為可溶性淀粉17.5 g/L、蛋白胨25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L,Na2HPO40. 5 g/L、CaCl2 1. 0 g/L, ρΗ7· 5。
3.根據權利要求1所述的高密度培養多粘類芽孢桿菌的方法，其特征在于所述培養條件為培養溫度30°C、轉速170r/min、裝液量80mL/250mL ；接種量為10%( v/v)，培養時間18h。
4.根據權利要求1所述的高密度培養多粘類芽孢桿菌的方法，其特征在于所述活化采用牛肉膏蛋白胨培養基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g-20g，蒸餾水IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C 活化 24h。
全文摘要
本發明屬于微生物發酵領域，更具體涉及一種高密度培養多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)的方法，以提高多粘類芽孢桿菌的菌體產量。該方法以多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)為菌種，經活化后接種到發酵培養基中培養。經過優化，多粘類芽孢桿菌的細胞生物量可達5.3×109cfu/mL，比優化前(3.17×108cfu/mL)提高了15.72倍。本發明通過對培養基配方及培養條件的研究，為多粘類芽孢桿菌的工業化發酵生產以及進一步開發利用打下基礎。
文檔編號C12R1/12GK102559564SQ201210056279
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月6日 優先權日2012年3月6日
發明者嚴芬, 葉秀云, 李仁寬, 楊捷, 林娟, 陳曉紅 申請人:福州大學