專利名稱：用于鑒定芽孢桿菌的通用引物以及使用它們的分類方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于芽孢 桿菌鑒定分類方法。具體涉及用于鑒定芽孢桿菌的通用引物，以及利用它們對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類鑒定的方法
背景技術(shù)：
芽孢桿菌(Bacillus)是一類廣泛存在于自然界、能形成芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。 不同種類的芽孢桿菌對(duì)人類的作用是不同的，有些是有益的，如某些枯草芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生用于作物病害生物防治的抑真菌物質(zhì)，地衣芽胞桿菌可以產(chǎn)生工業(yè)所需的酶類，蘇云金芽孢桿菌(BT)可以產(chǎn)生可作為微生物殺蟲劑的毒性蛋白。 而有些則是有害的，如炭疽芽胞桿菌能引起人類致死的炭疽病；蠟樣芽孢桿菌可以污染食品從而引起人類腹瀉。因此，在應(yīng)用之前對(duì)于芽孢桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確分類十分重要。芽孢桿菌屬(Bacillus)中的有些種之間親緣關(guān)系較近，形態(tài)特征相似， 如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)，萎縮芽孢桿菌(B. atrophaeus)，解淀粉芽孢桿菌 (B. amyloliquefaciens),地衣芽胞桿菌(B. Iicheniformis),短小芽孢桿菌(B. pumilus), 巨大芽孢桿菌(B. megaterium)，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B. firmus)，蠟樣芽孢桿菌(B. cereus)，蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)或炭疽芽胞桿菌(B. anthracis)等(Porwal等.PLoS 0ne2009(4)，4438)，利用現(xiàn)有方法有時(shí)難以進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。芽孢桿菌的分類鑒定方法主要有(1)形態(tài)和生理生化方法，此種方法因不同芽孢桿菌種之間形態(tài)和生理生化特征比較相似而難以對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分，存在準(zhǔn)確度不高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)(Ash，C 等.Letters in Applied Microbiology. 1991. 13，202-206)。(2) 16S rDNA序列對(duì)比方法，由于不同種的芽孢桿菌之間16S rDNA序列相似性極高(> 98% )， 對(duì)有些芽孢桿菌很難進(jìn)行準(zhǔn)確地歸類。(3)RAPD和AFLP擴(kuò)增標(biāo)記對(duì)比方法，此方法均存在操作復(fù)雜或分類結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)(Levy，H.等.(2010). The Challenge of Highly PathogenicMicroorganisms 191-198. Tourasse, N. J.等·(2010)·FoodMicrobiology)。
(4)利用gyrA、gyrB或rpoD基因等芽孢桿菌中普遍存在的、序列變異程度較高的 SHiH^T^/^^^ (Chelo, I. M.等.International journal of systematicand evolutionary microbiology. 2007. 57,276。Meintanis, C.等.Letters in applied microbiology. 2008. 46,395-401) 0其中g(shù)yrB基因已被廣泛地用于芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析和菌株鑒定(Bavykin，S. G.等· Journal of Clinical Microbiology. 2004. 42, 3711)，但該基因不能準(zhǔn)確地將蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)和蠟樣芽孢桿菌區(qū)分 (B. cereus) (Wang, L. Τ.等· International journal of systematic and evolutionarym icrobiology. 2007. 57，1846)。從上述可知，到目前為止，還沒有一種能將所有的芽孢桿菌種區(qū)分的方法，導(dǎo)致有些芽孢桿菌種之間難以區(qū)分，限制了有益芽孢桿菌的應(yīng)用或?qū)τ泻ρ挎邨U菌缺少明確的認(rèn)識(shí)。phoR和phoP (亦表示為ph0P/ph0R)是芽孢桿菌中普遍存在的一個(gè)雙因子調(diào)控系統(tǒng)，其中PhoR基因全長(zhǎng)1737bp，編碼一種組氨酸蛋白激酶，phoP基因全長(zhǎng)720bp，編碼一種受體蛋白，兩個(gè)基因之間存在8bp的重疊序列。在低磷環(huán)境下，phoR自身磷酸化并且將獲得的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到PhoP上，磷酸化的phoP調(diào)控下游基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人從枯草芽孢桿菌NCD-2菌株中克隆出phoP和phoR基因，在進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)意外發(fā)現(xiàn)，在芽孢桿菌屬內(nèi)不同種的菌株之間phoP/phoR雙因子調(diào)控系統(tǒng)基因序列 (指phoP和phoR兩個(gè)基因的全序列)存在較高的變異性，因此，本發(fā)明人提出將phoP/phoR 雙因子調(diào)控系統(tǒng)內(nèi)部的部分核苷酸序列用于芽孢桿菌的鑒定分類，本發(fā)明中用“phoPR”或 “phora基因”來表示所述的phoP/phoR雙因子調(diào)控系統(tǒng)的部分核苷酸序列。本發(fā)明目的在于提供一種用于鑒定芽孢桿菌的基因擴(kuò)增通用引物。本發(fā)明另一目的是提供利用上述基因擴(kuò)增通用引物對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類鑒定的方法。本發(fā)明第三目的是提供含有上述基因擴(kuò)增通用引物的芽孢桿菌分類鑒定試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明用于鑒定芽孢桿菌的基因擴(kuò)增通用引物，所述的基因擴(kuò)增通用引物由上游簡(jiǎn)并引物PhoPR-F和下游簡(jiǎn)并引物PhoPR-R組成，所述簡(jiǎn)并引物的核苷酸序列為phoPR-F 5' GG (G/C/T/A) TA (T/C) AAA (A/T/C/G) A (G/A) GAGGAGCC 3，(SEQID No: 1)，PhoI3R-R :5，TT (C/T) A (G/A) (C/T) TCATG (A/G) GA (A/C/G) ACATT 3，(SEQ IDNo 2)。上述用于鑒定芽孢桿菌的基因擴(kuò)增通用引物中所述的基因擴(kuò)增可以是PCR擴(kuò)增。利用上述基因擴(kuò)增通用引物對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類鑒定的方法，按照如下步驟進(jìn)行(1)以待測(cè)菌株的基因組DNA為模板，以上游簡(jiǎn)并引物phoPR-F和下游簡(jiǎn)并引物 PhoPR-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增所得的DNA片段進(jìn)行回收、純化、測(cè)序；其中所述的簡(jiǎn)并引物為phoPR-F :5，GG (G/C/T/A) TA (T/C) AAA (A/T/C/G) A (G/A) GAGGAGCC 3，(SEQID No: 1)；PhoI3R-R :5，TT (C/T) A (G/A) (C/T) TCATG (A/G) GA (A/C/G) ACATT 3，(SEQ IDNo 2)；(2)將步驟(1)測(cè)序所得待測(cè)菌株的phora基因的核苷酸序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(Nat ional Center for Biotechnologylnformation，簡(jiǎn)稱 NCBI)，網(wǎng)址;http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/Ruide)中所有芽孢桿菌的 phoP/phoR 基因的核苷酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，序列比對(duì)結(jié)果中與待測(cè)菌株序列相似性最高的菌株所屬的種，即為該菌株所屬的種。上述分類鑒定的方法步驟(2)中所述的序列比對(duì)結(jié)果，如果該菌株和某一菌株的序列相似性為100%，那么可能是相同菌株；如果序列相似性不是100%，就屬于新菌株。上述分類鑒定的方法步驟(1)中所述的PCR擴(kuò)增，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行，其反應(yīng)體系為10 XBuffer (+Mg2+) 5 μ l，dNTPs 8 μ 1, phoPR-F 1 μ l，phoPR-R 1 μ 1, 待測(cè)菌株基因組 DNA (約 IOng) 1 μ 1，rTaq DNA 聚合酶 1 μ 1，ddH20 33 μ 1 ；共 50 μ 1。上述分類鑒定方法步驟(1)中所述的PCR擴(kuò)增，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行，其 PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C 45s，48°C 45s，72°C lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 上述分類鑒定的方法步驟(2)中所述的序列比對(duì)是將擴(kuò)增所得的待測(cè)菌株的PhoI3R基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的芽孢桿菌的phoP/phoR基因序列通過 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行序列比對(duì)；對(duì)比結(jié)果中與待測(cè)菌株序列相似性最高的菌株所屬的種，即為該菌株所屬的芽孢桿菌的種。上述分類鑒定的方法步驟(1)中所述的PCR擴(kuò)增的DNA片段的回收和測(cè)序，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，然后純化、回收擴(kuò)增所得的目的片段；將回收的目的片段連接到PEASY-T質(zhì)粒載體上，再熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci的感受態(tài)細(xì)胞，選擇白色菌落，并以M13/RV-P為引物，通過PCR方法對(duì)白色菌落進(jìn)行驗(yàn)證，如果通過PCR方法能獲得大約1. 5kb的擴(kuò)增片段，則該白色菌落為正確的菌落；挑選經(jīng)過驗(yàn)證的菌落送交專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。所述的引物為M13 :5， cgacgttgtaaaacgacggccagt 3， (SEQ ID No 3)RV-P 5' ggaaacagctatgaccatgattac 3' (SEQ ID No 4)在應(yīng)用上述分類鑒定方法之前，也可以首先對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定、生理生化鑒定或者16s rDNA序列分析等，確定其是否為芽孢桿菌；在確定為芽孢桿菌后，再利用 phora基因序列進(jìn)行分類。上述分類鑒定的方法步驟(2)中，還可利用Clustal X軟件對(duì)2個(gè)以上的未知菌株的phora基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，比對(duì)過程中同時(shí)加入不同種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的PhoPR 基因序列；然后利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與待測(cè)菌株親緣關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株所對(duì)應(yīng)的種，即為該菌株所屬的種。所述的不同種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的ph#R基因序列可通過上述PCR方法擴(kuò)增、測(cè)序獲得； 亦可通過直接在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列。所述的Clustal X軟件是用于多序列比對(duì)的軟件。Clustal X軟件可從互連網(wǎng)上下載。Ijf^MEGA (Mo 1 ecu 1 ar Evolutionary Genetics Analysis, j^^J&itMi^^fr) 是研究分子進(jìn)化遺傳分析的軟件，用于序列比對(duì)、進(jìn)化樹的推斷、估計(jì)分子進(jìn)化速度、驗(yàn)證進(jìn)化假說等。MEGA軟件可從互聯(lián)網(wǎng)上下載。上述分類鑒定方法步驟(1)中所述的待測(cè)菌株基因組DNA的提取，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行，如堿裂解及苯酚-氯仿抽提法((SlBeyer 等.Microbiological research. 1995,150 179)。一種芽孢桿菌分類鑒定試劑盒，含有由SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的核苷酸序列組成的基因擴(kuò)增通用引物。該引物可用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式，上述芽孢桿菌分類鑒定試劑盒還包括dNTPs、 10XBuffer、rTaq DNA聚合酶和超純水。所述的基因擴(kuò)增通用引物phoPR-F和phoPR-R由人工合成。同現(xiàn)有的芽孢桿菌的鑒定方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)利用本發(fā)明通用引物進(jìn)行擴(kuò)增所得的DNA片段多態(tài)性非常豐富，通過它們對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類鑒定，能將所有的芽孢桿菌菌株進(jìn)行分類，其所得分類結(jié)果準(zhǔn)確，可靠性高；(2)本發(fā)明通用引物不僅能將芽孢桿菌菌株在種的水平 上進(jìn)行分類，而且還可進(jìn)行亞種水平的分類，即對(duì)同一種內(nèi)不同的菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，而用現(xiàn)有方法對(duì)有些種內(nèi)不同的菌株難以區(qū)分；(3)本發(fā)明分類鑒定方法簡(jiǎn)單、鑒定速度快，本發(fā)明方法鑒定一個(gè)新菌株只需要1-3天即可；而現(xiàn)有方法鑒定一個(gè)新菌株至少需要2周時(shí)間。


圖1為不同種的芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株phora基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜；其中M.DL2000 DNA marker, 1.枯草芽孢桿菌(B. subtilis) 168，2.萎縮芽孢桿菌 (B. atrophaeus)SB512,3.解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)FZB42，4.地衣芽孢桿菌(B. licheniformis) ATCC8480，5.短小芽孢桿菌(B. pumilus) ATCC7061，6.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B. firmus)NRS854，7.巨大芽孢桿菌(B. megaterium)899，8.蘇云金芽孢桿菌 (B. thuringiensis)HD2,9.賭樣芽孢桿菌(B. cereus)E33L。圖2為不同的芽孢桿菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜。其中1. NCD-2, 2. BAB-1,3.TQk-TΛ. XJT-7,5.HMB6246，6. HMB6241，7. HMB 6311,8. HMB6315，9. HMB6262, 10. HMB6243,11. HMB6236,12. HMB6283,13. HMB6256,14. SP-8-2，15. NZT-55，16.枯草芽孢桿菌168，17.解淀粉芽孢桿菌FZB42。圖3為利用phoPR基因?qū)Σ煌N的芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖4為利用16S rDNA序列對(duì)分類地位未知的芽孢桿菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖5為利用phoPR基因?qū)Ψ诸惖匚晃粗难挎邨U菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實(shí)施例方式以下以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但是不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。如無(wú)特別說明，以下實(shí)施例中所涉及的方法皆為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，具體可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》等。以下實(shí)施例中所用的rTaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物 (TaKaRa)公司，pEASY_T載體及大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其它分子生物學(xué)試劑購(gòu)自上海生工生物有限公司。實(shí)施例1 不同種的芽孢桿菌之間phoPR和gyrB基因多態(tài)性比較試驗(yàn)本試驗(yàn)中所涉及的9個(gè)代表性的芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別為菌株枯草芽孢桿菌(B. subtilis) 168,解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)FZB42,地衣芽胞桿菌(B. licheniformis) 14580，短小芽孢桿菌(B. pumilus) SAFR-032,韋氏芽孢桿菌(B. weihenstephanensis) KBAB4,賭樣芽胞桿菌(B. cereus) 03BB102,克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)KSM-K16，巨大芽孢桿菌(B. megaterium)DSM319和蘇云金芽孢桿菌 (B.thuringiensis)BMB1710本試驗(yàn)中對(duì)芽孢桿菌屬不同種的9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株分別用phoPR-F/phoPR-R引物和 gyrB-F/gyrB-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行測(cè)序和序列對(duì)比。按照如下方法進(jìn)行(1)菌株活化將芽孢桿菌菌株于LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基組成成分及其比例為每 IOOOml中胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g、瓊脂粉10g、其余為水)上活化。
(2)芽孢桿菌基因組DNA的提取將芽孢桿菌單一菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基中(其組成成分及其重量百分比為胰蛋白胨10%、酵母提取物5%，NaCl 5%，其余為水)，在30°C、150rpm條件下震蕩培養(yǎng)14h，取菌液Iml，12000rpm離心2min，收集菌體(沉淀)，菌體用TE緩沖液沖洗，并再次用TE緩沖液500 μ 1懸浮，然后加入溶菌酶50 μ 1 (50ng/ μ 1)，37°C溫浴40min，然后利用SDS-堿裂解法提取芽孢桿菌的基因組DNA(參見Beyer 等.Microbiologicalresearch. 1995,150 179)。(3) phoPR基因的PCR擴(kuò)增以芽孢桿菌的基因組DNA為模板，以phoPR-F (SEQ ID No 1)和phoPR-R (SEQ ID No 2)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳、回收、純化，再送上海生工進(jìn)行測(cè)序。其中PCR反應(yīng)體系為 10 XBuffer (+Mg2+) 5 μ 1，dNTPs 8 μ 1，引物 phoPR-F 1 μ 1，引物 phoPR-R 1 μ 1，步驟(2)所得的基因組 DNA (約 10ng)ly 1，rTaq DNA 聚合酶 1 μ 1，ddH20 33 μ1，*50μ1。PCR 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，48°C退火45s，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后 72°C鏈延伸 IOmin。 (4) gyrB基因的pCR擴(kuò)增以芽孢桿菌的基因組DNA為模板，以gyrB_F和gyrB-R 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳、回收、純化，再送上海生工進(jìn)行測(cè)序。其中 PCR 反應(yīng)體系為10XBuffer (+Mg2+) 5 μ 1，dNTPs 8 μ l,gyrB-F 1μ 1, 引 gyrB-R 1 μ 1，步驟(2)所得的基因組 DNA (約 IOng) 1 μ 1，rTaq DNA 聚合酶 1 μ 1，ddH20 33μ 1，共 50μ 1。PCR 反應(yīng)條件為95°C 預(yù)變性 5min ；94 °C 變性 45s，55 °C 退火 45s，72 °C 延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C鏈延伸lOmin。所述的gyrB_F和gyrB-R引物的核苷酸序列為gyrB-F 5' TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT 3，(SEQID No 5)； gyrB-R 5' TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC 3，(SEQ ID No 6)；(5)電泳檢測(cè)取5 μ IPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 μ 1 6 X Loading Buffer,混勻后加入含有瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，IOOV電壓電泳40min。電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠置于Gold View染料(購(gòu)自北京賽百盛有限公司)中染色30min，然后置于紫外檢測(cè)器下觀察(見圖 1)。簡(jiǎn)并引物表1不同種的芽孢桿菌之間phoP/phoR雙因子基因序列的序列相似性(％ )
^ p^—^^ffij^ft c%)~ΓΙ Yi [3 p [1 Γ Yi [8 |~9
號(hào)菌株名稱^------------------
Τ~ 解淀粉芽孢桿菌 FZS幻 10073.4 64.1 60.9 57.353.4 56.9 57.0 57.1
Τ~ 枯草芽孢桿菌 168"l00 65.2 62.5 60.554.0 58.9 “ 58.5 59.6—
地衣芽胞桿菌“ 100 62.9 59.655.7 57.8 57.4 57.7
T"短小芽孢桿菌 SAFR-032100 58.454.4 60.6 ~606~ 60.5
巨大芽孢桿菌 DSM3]9100"5 y 65.1 64J~ 65.6 ‘
" 克勞氏芽孢桿菌 KSM-Kl6—1θΓ~ 54.4 54.3
Τ"蘇云金芽孢桿菌ΒΜΒ17「— “100 92.廠92.2
Τ~蠟樣芽孢桿菌E33L"100 91.6
~9丨韋氏芽抱桿菌尤似^/丨丨丨100表2不同種的芽孢桿菌之間gyrB基因的序列相似性(％ )
權(quán)利要求
1.用于鑒定芽孢桿菌的基因擴(kuò)增通用引物，其特征在于所述的通用引物由上游簡(jiǎn)并引物和下游簡(jiǎn)并引物組成，所述的上游簡(jiǎn)并引物由SEQ ID No :1所示的核苷酸序列組成，所述的下游簡(jiǎn)并引物由SEQ ID No :2所示的核苷酸序列組成。
2.利用權(quán)利要求1所述的通用引物對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類鑒定的方法，按照如下步驟進(jìn)行(1)以待測(cè)菌株的基因組DNA為模板，以上游簡(jiǎn)并引物和下游簡(jiǎn)并引物為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增所得的DNA片段進(jìn)行回收、純化、測(cè)序，得phora基因序列；其中所述的上游簡(jiǎn)并引物由SEQ ID No 1所示的核苷酸序列組成，所述的下游簡(jiǎn)并引物由SEQ ID No 2所示的核苷酸序列組成；(2)將步驟(1)測(cè)序所得待測(cè)菌株的ph#R基因的核苷酸序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中所有芽孢桿菌的phoP/phoR基因的核苷酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，序列比對(duì)結(jié)果中與待測(cè)菌株序列相似性最高的菌株所屬的種，即為該菌株所屬的種。
3.按照權(quán)利要求2所述的分類鑒定的方法，其特征在于其步驟(2)中所述的序列比對(duì)是將擴(kuò)增所得的待測(cè)菌株的Phora基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的芽孢桿菌的phoP/ PhoR基因序列通過BLAST進(jìn)行序列比對(duì)；對(duì)比結(jié)果中與待測(cè)菌株序列相似性最高的芽孢桿菌菌株所屬的種，即為該菌株所屬的芽孢桿菌的種。
4.利用權(quán)利要求1所述的通用引物對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類鑒定的方法，按照如下步驟進(jìn)行(1)以待測(cè)菌株的基因組DNA為模板，以上游簡(jiǎn)并引物和下游簡(jiǎn)并引物為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增所得的DNA片段進(jìn)行回收、純化、測(cè)序，得phora基因序列；其中所述的上游簡(jiǎn)并引物由SEQ ID No :1所示的核苷酸序列組成，所述的下游簡(jiǎn)并引物由SEQ ID No :2所示的核苷酸序列組成；(2)利用ClustalX軟件對(duì)2個(gè)以上的未知菌株的phora基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)， 比對(duì)過程中同時(shí)加入不同種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的Phora基因序列；然后利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與待測(cè)菌株親緣關(guān)系最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株所對(duì)應(yīng)的種，即為該菌株所屬的種。
5.按照權(quán)利要求2、3或4所述的分類鑒定的方法，其特征在于其步驟(1)中所述的PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10XBuffer 5 μ l，dNTPs 8 μ l,phoPR-Fly l，phoPR-R 1μ 1，待測(cè)菌株基因組 DNA 1 μ 1，rTaq DNA 聚合酶 1 μ 1，ddH2033 μ 1 ；共 50 μ 1。
6.按照權(quán)利要求5所述的分類鑒定的方法，其特征在于其步驟(1)中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C 45s, 48°C 45s, 72°C lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
7.一種芽孢桿菌分類鑒定試劑盒，其特征在于含有由SEQ ID No :1和SEQID No :2所示的核苷酸序列組成的基因擴(kuò)增通用引物。
8.按照權(quán)利要求7所述的芽孢桿菌分類鑒定試劑盒，其特征在于還包括dNTPs、 10XBuffer、rTaq DNA聚合酶和超純水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于鑒定芽孢桿菌的通用引物，所述的通用引物由SEQID No1所示的核苷酸序列組成的上游簡(jiǎn)并引物和由SEQ ID No2所示的核苷酸序列組成的下游簡(jiǎn)并引物組成。本發(fā)明還公開了對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行分類鑒定的方法，即利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，再利用序列比對(duì)軟件在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，序列相似性最高的已知菌株所屬的種即為該菌株所屬的種。利用本發(fā)明通用引物能將所有的芽孢桿菌進(jìn)行分類，其分類結(jié)果準(zhǔn)確，可靠；其次，本發(fā)明通用引物不僅能將芽孢桿菌在種的水平上進(jìn)行分類，而且還可進(jìn)行亞種水平的分類；此外，本發(fā)明分類鑒定方法簡(jiǎn)單、鑒定速度快。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102226216SQ20111014232
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者李寶慶, 李社增, 郭慶港, 馬平, 鹿秀云 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所