專利名稱：防治棉花枯黃萎病的合劑的制作方法
防治棉花枯黃萎病的合劑技術領域：
本發(fā)明涉及一種防治棉花枯黃萎病的生防復合菌劑BB1623，屬于植物保護技術領域。二、背景技術
棉花是世界上種植面積最大的工業(yè)原料作物，我國是世界產(chǎn)棉大國，棉花生產(chǎn)的興衰對國民經(jīng)濟的發(fā)展具有重大意義。目前世界上危害棉花生產(chǎn)的病害主要有棉花立枯病、炭疽病、棉鈴疫霉病、棉葉斑病、棉花枯萎病及棉花黃萎病等，其中以棉花枯萎病、黃萎病尤為嚴重。
棉花黃萎病(Cotton verticilIium wilt)是棉花生長過程中最具毀滅性的病害之一，其致病菌大麗輪枝菌(verticillium dahliae Kleb)，分類學上屬半知菌亞門淡色孢科輪枝菌，其特點是分布廣、危害重、寄主范圍寬、傳播途徑多、存活時間久，是一種極難防治的土傳病害，被稱為棉花的癌癥。自1914年首次在美國發(fā)現(xiàn)以來，此病害幾乎遍及全球各主要棉區(qū)。我國的棉花黃萎病在30年代就有報道，在國內(nèi)逐年蔓延擴展。1973年病田面積為統(tǒng)計面積的10%，1978年病田面積為統(tǒng)計面積的12%，1981年病田面積為統(tǒng)計面積的19.4%，不到十年的時間，發(fā)病面積增長約為一倍。1993年黃萎病在全國各主要產(chǎn)棉區(qū)爆發(fā)成災，重病田在200萬畝以上，損失皮棉200多萬擔，1995年黃萎病在黃淮棉區(qū)繼續(xù)大發(fā)生，90年代中期以后黃萎病在以新疆為主的西北內(nèi)陸棉區(qū)每年以較快的速度擴展，據(jù)不完全統(tǒng)計，該棉區(qū)的70% 80%棉田已有黃萎病出現(xiàn)，已經(jīng)成為當?shù)孛藁ㄉa(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一。
棉花枯萎病(Cotton fusarium wilt disease)是棉花生產(chǎn)上危害最大的檢疫性病害之一，主要由尖鐮孢萎蔫?；?Fsarium oxysporum f. sp. vasinfectum(Atk.) Synder and Hanen)病菌引起。自1891年在美國亞拉巴馬州第一次報道棉花枯萎病以后， 該病不僅廣泛蔓延至整個美國植棉帶，而且在世界各主要產(chǎn)棉區(qū)也相繼發(fā)生。我國在三十年代初期由于引進美棉未經(jīng)檢疫和種子消毒即分各地種植，隨同種子傳入的棉花枯萎病， 目前已擴展到全國大部分棉區(qū)，成為棉花生產(chǎn)中的嚴重病害問題。
目前防治棉花黃萎病、枯萎病的主要方法是培育抗病品種、使用化學藥劑和農(nóng)業(yè)措施、轉(zhuǎn)基因技術等，但防治效果都不理想或者存在潛在的危險?？共∑贩N往往較難獲得， 且黃萎病、枯萎病致病力變異大，抗性極易喪失。化學防治在棉花病害防治中發(fā)揮重要的作用，但受到四個因素限制目前高效低毒的殺菌劑農(nóng)藥品種較少；環(huán)境條件對防治效果影響很大，在環(huán)境條件適宜病原菌侵入和傳播時，防治效果不令人滿意；容易造成環(huán)境污染； 長期使用化學農(nóng)藥，病菌的抗藥性增強，導致使用頻率和用量逐年增加，形成了惡性循環(huán)。 并且目前還沒有選擇出防治黃萎病、枯萎病的理想化學試劑。農(nóng)業(yè)措施中比較有效的是輪作倒茬，尤其是水旱輪作，能夠有效的降低土壤中菌量，減少病害發(fā)生，但在實際中存在一定困難，一是棉花屬于高經(jīng)濟值作物；二是由于黃、枯萎菌的微菌核能夠在土壤中存活十幾到幾十年，短期輪作達不到預期目的；三是種植大多數(shù)非寄主植物不能減少微菌核在土壤中的數(shù)量，而且非寄主的根分泌物仍能為微菌核存活提供營養(yǎng)。自從1985年人類首次試種成功能夠抵御病蟲害的轉(zhuǎn)基因作物以來，全球共有40多個國家進行了 25000次試種。但轉(zhuǎn)基因存在潛在的風險性，廣泛推廣存在風險。
這種發(fā)展情況下，不少目光開始轉(zhuǎn)移到生物防治手段。生物防治與其他方法相比， 具有安全、有效、持久的特點，特別是避免了化學防治帶來的一系列問題。生防制劑對病害防治效果好，對人畜無毒，不污染環(huán)境，無殘留；對病蟲害的殺傷特異性強，不傷害天敵，有益生物，能保持生態(tài)平衡；生產(chǎn)原料和有效成分為天然產(chǎn)物易降解，可回歸大自然，保證可持續(xù)發(fā)展；可用生物技術和基因工程的方法對微生物進行改；多種因素和成分發(fā)揮作用， 病原菌難以產(chǎn)生抗藥性。據(jù)報道，黃萎病、枯萎病的生防真菌主要有木霉菌、粘帚霉，但效果不夠理想，主要原因是這些生防菌在寄主根際定殖能力差。黃萎病、枯萎病生防細菌中比較有前途的種類是嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌。一般說來，多種生防菌混合使用其效果比單一生防菌要好。另外，將生防菌劑和農(nóng)業(yè)栽培措施結合起來使用，可為生防菌提供一個良好的棲境，使其能盡量發(fā)揮其本身的防治潛能。三、發(fā)明內(nèi)容
技術問題
本發(fā)明目的是采用生物防治手段防治棉花危害較大的枯、黃萎病，通過拮抗酶活性檢測和溫室、大田試驗，篩選得到復合菌劑BB1623，合劑對棉花枯、黃萎病防效為70%以上。對無病植株的促生效果可達20%，對棉田增產(chǎn)效果在13% 50%。
技術方案
一種防治防治棉花枯、黃萎病的生防復合菌劑BB1623，含兩種細菌成分分別是短小芽孢桿菌CS23 (Bacillus pumilus)和枯草芽孢桿菌SM16 (Bacillus subtilis)，短小芽孢桿菌CS23 (Bacillus pumilus)，于2011年04月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 4735 ；枯草芽孢桿菌SM16 (Bacillus subtilis)于2009年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 3127。
生防復合菌劑BB 1623的制備方法為
1)將CS23和SM16菌株分別接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)180rpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；
2)當培養(yǎng)至OD值在0.5 0.8之間時，將CS23和SM16的種子菌液分別以1 100 體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，300C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時，發(fā)酵液 PH值維持在7. 0，溶氧量20%，通氣量5 7m3/小時，罐壓0. 05 0. IKPa0然后6000rpm 離心lOmin，每1000ml培養(yǎng)液獲得13 16g濕菌，每克濕菌含3 X 101° IO15個菌體，取濕菌與菌體保藏液按Ig 40ml配成兩種細菌單劑，再將兩種細菌單劑按照各菌活菌數(shù)量 (CFU/ml)比1 1配成混合制劑，合劑中活菌終濃度為1\108 1\10120 ^!111。
3) LB培養(yǎng)液配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為 7. 2 ；然后 121°C 滅菌 20min。
4) CS23菌株發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖2. Og/L,玉米粉4g/L，馬鈴薯粉4. 5g/L，蛋白胨3g/L，二水氯化鈣0. 2g/L，一水硫酸錳0. 2g/L，磷酸氫二鉀0. 2g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 7. 2 ；
SM16菌株發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖1. Og/L，玉米粉2. 5g/L，黃豆粉粉2. 5g/L，蛋白胨3g/L，二水氯化鈣0. lg/L，一水硫酸錳0. lg/L，磷酸氫二鉀0. 15g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 7. 2 ；
幻菌體保藏液
a.短小芽孢桿菌CS23菌體保藏液的制備pH6. 8,0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液，向其中加入Tween20至Tween20在緩沖液中的終濃度為0. 02mol/L即得菌體保藏液。
b.枯草芽孢桿菌SM16菌體保藏液的制備pH7. 0,0. 15mol/L的Tris緩沖液，向其中加入聚氧乙基脂肪酸酯至聚氧乙基脂肪酸酯在緩沖液中的終濃度為0. 01mol/L即得菌體保藏液。
有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對棉花枯、黃萎病病害開發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒有因化學農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于棉花的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支， 而且有利于棉花的出口貿(mào)易。
室內(nèi)孢子萌發(fā)試驗表明，生防合劑BB1623對鐮孢菌和大麗輪枝菌的分生孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用；棉花離體葉片試驗顯示，BB1623合劑對枯、黃萎病的控制有明顯作用；溫室試驗表明，BB1623合劑能有效控制枯、黃萎病對棉花的侵染，達到控制病情發(fā)生的效果；大田試驗表明，BB1623合劑能控制病情發(fā)生，防效保持在70% ；溫室和大田促生試驗發(fā)現(xiàn)，BB1623合劑能促進棉花植株前期的生長，提高產(chǎn)量。
該菌劑用濕菌與本實驗室的菌體保藏液(屬本實驗室已授權專利，專利號 ZL02112559. 7，公開專利號CN1358838，
公開日:2002年7月17日)按1 40 (g/ml)配成菌劑，可室溫保存2 3年。該復合菌劑可以稀釋后于棉花苗播種營養(yǎng)缽或移栽時澆灌施用。四具體實施方式
實施例1
菌株來源CS23由江蘇省揚州市黃瓜根圍土壤中分離得到；SM16由淮安試驗田的番茄健株根部土壤中分離得到。
菌株分離方法平板稀釋法(中國科學院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京科學出版杜，1985.)
菌株篩選依據(jù)水解五種酶活性(蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、嗜鐵素、 IAA 測定 Yang J. -H.，Liu H. X.，Zhu G. -M.，Xu L. -P.，Pan Y. -L.，and Guo J. -H. 2008. Diversity analysis of antagonists from rice associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases. Journal of Applied Microbiology. 104(1) :91 104.)和對棉花枯、黃萎病病菌拮抗活性的測定(對峙培養(yǎng)法，林福呈，李德堡.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理學報，2003，33 O) :174 177.)，通過細菌的賦值評估(Faltin等，2004)，最終選擇CS23和SM16作為本合劑的有效細菌成分。
菌株鑒定方法鑒定方法為16S r DNA基因片段序列測序。
鑒定結果見表1
表1 測序比對結果
權利要求
1.一種防治棉花枯、黃萎病的生防復合菌劑BB1623，含兩種細菌成分分別是短小芽孢桿菌CS23 (.Bacillus 腫iA/s)和枯草芽孢桿菌SM16 (.Bacillus仰力ii/is)，短小芽孢桿菌CS23 {Bacillus pumilus),于2011年04月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 4735 ；枯草芽孢桿菌mm (Baci Ilus subtil is)于2009年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 3127。
2.權利要求1所述的一種防治棉花枯、黃萎病的生防復合菌劑BB1623的制備方法，其特征在于，1)將權利要求1所述的菌株CS23和SM16分別接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)180rpm 振蕩培養(yǎng)，12 16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；2)當培養(yǎng)至OD值在0.5 0. 8之間時，將種子菌液以1 :100體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200 L發(fā)酵罐中，30°C 250 rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時，發(fā)酵液pH值維持在7. 0，溶氧量20%,通氣量5 7 m3/小時，罐壓0. 05 0. IKPa,然后6000 rpm離心10 min,每1000 ml培養(yǎng)液獲得13 16 g濕菌，每克濕菌含3 X 101° IO15個菌體，取濕菌分別與菌體保藏液按1 g :40ml配成菌株CS23和SM16單菌菌劑，再將兩種細菌單劑按照單菌活菌數(shù)量1 1 配成混合制劑BB1623，合劑中活菌總濃度為IX IO8 1012CFU/ml。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其中LB培養(yǎng)液及發(fā)酵培養(yǎng)液配方如下1)LB培養(yǎng)液氯化鈉10 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 2， 然后121°C滅菌20 min ；2)CS23發(fā)酵培養(yǎng)液麥芽糖2.0g/L,玉米粉4 g/L,馬鈴薯粉4. 5 g/L,蛋白胨3 g/ L, 二水氯化鈣0.2 g/L，一水硫酸錳0.2 g/L,磷酸氫二鉀.2 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 7. 2 ；SM16發(fā)酵培養(yǎng)液麥芽糖1.0 g/L,玉米粉2. 5 g/L,黃豆粉2. 5 g/L,蛋白胨3. 5 g/ L, 二水氯化鈣0.1 g/L，一水硫酸錳0.1 g/L,磷酸氫二鉀0.15 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 2 7.4；3)菌體保藏液a.短小芽孢桿菌CS23菌體保藏液的制備pH6.8,0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液中加入 Tween20至Tween20在緩沖液中的終濃度為0. 02mol/L即得菌體保藏液；b.枯草芽孢桿菌SM16菌體保藏液的制備pH7.0,0. 15 mol/L的Tris緩沖液中加入聚氧乙基脂肪酸酯至聚氧乙基脂肪酸酯在緩沖液中的終濃度為0. 01 mol/L即得菌體保藏液。
4.權利要求1 3之一所述的生防復合菌劑BB1623在防治棉花枯、黃萎病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治棉花枯黃萎病的生防復合菌劑BB1623，屬于植物保護技術領域。BB1623合劑由短小芽孢桿菌Bacilluspumilus(CS23)；枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis(SM16)組成。將兩種細菌單劑按照各菌活菌數(shù)量1:1配成混合制劑，合劑中活菌總濃度為1×108～1012CFU/ml。BB1623合劑對棉花枯、黃萎病防效為70%以上。對無病植株的促生效果可達20%，對棉田增產(chǎn)效果在13%～50%。該復合菌劑前期通過土壤處理防治枯、黃萎病，后期可以通過噴霧和根部處理同時使用來更好防治黃萎病。
文檔編號A01N63/00GK102524303SQ20111025493
公開日2012年7月4日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權日2011年8月31日
發(fā)明者劉紅霞, 王云鵬, 鄭麗, 郭堅華 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學