專利名稱：一株用于防治棉花黃萎病的假單胞菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物農藥技術領域，涉及一株用于防治棉花黃萎病的假單胞菌及其應用。
背景技術：
棉花黃萎病(cotton Verticillium wilt)是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的真菌性維管束系統病害，是棉花最嚴重病害之一。大麗輪枝菌的菌絲體能產生大量微菌核，這些微菌核在土壤中存活時間長，且寄主廣泛，傳播途徑多，嚴重威脅棉花生產，給我國棉花生產造成嚴重損失。迄今尚無有效的防治方法。棉花黃萎病為土傳維管束病害，防治困難，難以找到很好的抗源材料，因而多年來一直未能培育出高抗黃萎病的棉花新品種，研究開發的病害防治方法和藥劑亦難以達到理想的防治效果。植物內生細菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的細菌。被內生細菌感染的宿主植物(至少是暫時)不表現出外在病癥， 可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離，或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生。內生細菌主要分布于細胞間與維管束組織，廣泛存在于植物的果實、種子、胚、根、莖、葉中。內生細菌具有能增強宿主植物抗逆性的特性，研究者已經從棉花，水稻，小麥，茄子，馬鈴薯，可可等作物中篩選出許多拮抗病原菌的內生菌，并由此開發出一些植物生防菌劑。大量的研究事實證明了生防菌處理植物后能達到促進生長與病害防治的目的。我國在這方面的研究主要在小麥、棉花等作物病害防治。目前，隨著人們對無公害食品的要求和環境保護意識的日益增強，人們逐漸擺脫了防治病害完全依賴化學農藥的觀點，逐漸把生物防治與病害的綜合治理聯系起來，并成為其中重要組成部分。假單胞菌是活躍在植物根際的一類微生物，屬Plant Growth-promoting Rhizobacteria(PGPR) 一大類，假單胞菌的促生長作用機理一是產生活性物質或改善礦質營養直接促進植物生長；二是產生代謝物質或競爭作用抑制或阻礙根區病原微生物的發展，間接促進植物的生長。其生防作用機理包括有效的根部定殖、抗生作用、根際營養競爭 (特別是對鐵的競爭)、分泌降解微生物的酶和誘導植物抗性等。誘導植物抗病性是國際上近期興起的一個重要研究領域，利用植物誘導抗病性被認為是植物保護的新技術和新途徑。利用植物自身的防御系統來防病也是今后農藥發展的重要方向。研究開發既可以控制病害發生又能避免化學合成農藥過量應用對人、畜及環境所產生的負面效果的新型生物農藥產品，是國際上農藥研發的一個方向。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一株假單胞菌。本發明的另一目的是提供該菌株的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現
假單胞菌(Pseudomonas sp. ) 841P-3，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期:2011年12月13日，保藏號=CGMCC No. 5583。假單胞菌841P-3(CGMCC No. 558 形態特征如下革蘭氏陰性菌，極生鞭毛，可游動，(0. 5-1. 0) μ mX (1.1-3.0) μ m，單菌落具有擴散性，扁平而潮濕.各項理化分析結果如下熒光、需氧性、氧化酶、過氧化氫酶、明膠液化、硝酸鹽還原試驗、簡單碳源生長試驗、產、靛基質試驗、檸檬酸鹽試驗、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。肌醇和反消化為陰性.在42°C下，能生長PH5.7能生長。16SrDNA測序結果與假單胞菌科 (Pseudomonadaceae)中的假單胞菌屬同源性達到99. 7% .對氨芐青霉素、氯霉素，鏈霉素具有較強的抗性。最適PH為為7.2，最適培養溫度為28-301。最佳培養基成分蛋白胨 2g，瓊脂1. 5g，甘油lg，磷酸氫二鉀0. 15g，七水硫酸鎂0. 15g，蒸餾水IOOmL, PH7. 2。所述的保藏號為CGMCC No. 5583的假單胞菌841P-3在防治棉花黃萎病中的應用。有益效果本發明所述假單胞菌841P-3能強烈抑制棉花強致病性黃萎病菌系V107菌絲的生長和孢子萌發，使病原菌菌絲畸形，膨大，生長不正常，使病原菌孢子破裂，抑制孢子萌發。 且能夠誘導棉花的產生抗黃萎病性，處理后減少了病原菌對幼根和真葉的傷害。盆栽實驗驗證，841P-3菌株能促進棉花感病品種蘇棉9號出苗，對蘇棉9號，841P-3防治黃萎病V107 的效應為46. 9%。通過微生物發酵獲得大量假單胞菌841P-3菌株，且能產生誘導系統抗性，對人畜無毒，對農作物物毒害，綠色環保，防治棉花枯黃萎病效果顯著，具有良好的生物農藥開發前景。


圖1 841P-3細菌顯微照片。圖2 841P-3的劃線形態。圖3 841P-3對黃萎病菌V107的抑制作用。圖4 841P-3菌對V107菌絲生長影響。圖5 841P-3菌對V107孢子萌發的影響。圖6 841P-3菌提高幼根抵抗黃萎病V107的作用。圖7 841P-3菌提高蘇棉9號真葉抵抗黃萎病V107的作用。圖8 841P-3對蘇棉9號出苗率的影響。圖9 841P-3對蘇棉9號防治黃萎病V107的效果。生物材料樣品保藏信息假單胞菌(Pseudomonas sp. ) 841P-3，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2011年12月13日，保藏號=CGMCC No. 5583。
具體實施例方式實施例1假單胞菌841P-3的獲得1. 1細菌的分離取健康的現蕾期棉M-81M-1159花根，用滅菌刀取主根5 IOcm處，浸入70%酒精lmin，以1.05%次氯酸鈉對樣品表面滅菌，滅菌時間為15 18min，取經檢驗表面滅菌徹底的材料1. OOg于無菌研缽中，加滅菌的PBS緩沖液研磨，靜置15min后加緩沖液定容至 10mL，取Iml分離液梯度稀釋后取0. Iml涂布于制備的S2 (瓊脂18g，蔗糖10g，甘油10ml， 酪蛋白5g，碳酸氫鈉lg，MgSO4 ·7Η20 lg，K2HPO4 2. 3g，月桂酰基肌氨酸鈉1. 2g，去離子水定容至1L)培養基，用于假單胞菌屬的分離，平行三組，28°C下培養2 3天，計菌落數。根據菌落的形態、顏色、大小等挑取單菌落，反復劃線純化后接斜面保存，供測試鑒定。1. 2拮抗細菌的篩選1.2. 1平板對峙培養法以棉花黃萎病菌大麗輪枝菌V107(由江蘇農科院植保所提供)為指示菌，將1. 1 中分離到的細菌菌株采用平板對峙生長法進行拮抗性篩選。在長滿大麗輪枝菌菌絲的平板邊緣處用滅菌的打孔器打下直徑為6mm的菌餅，然后將菌餅貼于PDA平板中央，26 培養2天后，在距菌餅2cm處接種分離菌株，對照平板只接病原菌大麗輪枝菌菌餅，不點接篩選菌，28°C恒溫箱中培養3 5天，觀察待測菌株對大麗輪枝菌有無拮抗作用(圖3)，每菌株重復3次。選擇抑菌直徑大于Icm的菌株進入下一輪篩選。1.2.2平板擴散法菌株的制備將各供試菌株在LB平板上活化，挑取一環接種于含^ilLB培養液的試管中，28°C下170r/min振蕩培養Mh。大麗輪枝菌孢子懸浮液的制備取在PDA平板上活化的大麗輪枝菌V107菌絲塊， 接種于察貝克液體培養基中，25°C下120r/min恒溫搖床振蕩培養6天。用滅菌紗布濾去培養液中的菌絲，用無菌水將孢子濃度調為1 X loir1，備用。吸取制備好的大麗輪枝菌V107孢子懸浮液1ml，加入到熔化并冷卻到45°C左右的IOOmlPDA培養基(瓊脂含量為0.7% )中，混勻，傾覆在已凝固的PDA平板上，待上層培養基冷卻凝固后，在平板上打孔(直徑為6mm)，在每個孔內加入經平板對峙培養法初步篩選得到的優勢菌株的發酵液40 μ 1，以LB培養液作為空白對照，每處理設3個重復，將平板置于恒溫培養箱內培養3 后觀察是否可產生抑菌圈(圖幻。選擇抑菌圈最大，效果穩定的菌株，命名為841P-3。841P-3 革蘭氏陰性菌，極生鞭毛(圖1)，可游動，(0.5-1.0) μ mX (1. 1-3. 0) μ m,單菌落具有擴散性，扁平而潮濕(圖2)。各項理化分析結果如下熒光、需氧性、氧化酶、過氧化氫酶、明膠液化、硝酸鹽還原試驗、簡單碳源生長試驗、產H2S、 靛基質試驗、檸檬酸鹽試驗、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。肌醇和反消化為陰性.在42°C下，能生長PH5. 7能生長。16SrDNA測序結果與假單胞菌科(I^seudomonadaceae) 中的假單胞菌屬同源性達到99.7%，鑒定為假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)。假單胞桿菌 841P-3對氨芐青霉素、氯霉素，鏈霉素具有較強的抗性，最適PH為為7. 2，最適培養溫度為 ^-30°C，最佳培養基成分蛋白胨2g，瓊脂1.5g，甘油lg，磷酸氫二鉀0. 15g，七水硫酸鎂 0. 15g，蒸餾水100mL，PH7. 2。將該菌株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期:2011年12月13日，保藏號=CGMCC No. 5583。實施例2拮抗機理研究挑取對峙培養中拮抗菌假單胞桿菌841P_3(CGMCC No. 558 周圍的菌絲和收集拮抗菌處理周圍的孢子鏡檢觀察菌絲生長和孢子萌發情況。結果表明處于假單胞桿菌 841P-3 (CGMCCNo. 5583)周圍的大麗輪枝菌V107菌絲出現畸形，膨大，生長不正常，孢子破裂，孢子萌發受到抑制(圖4，5)。實施例3誘導抗性驗證3. 1提高棉花幼根抗性菌體懸浮液制備將假單胞桿菌841P-3 (CGMCC No. 5583)菌株接種在液體LB中， 37°C恒溫培養Mh，離心去上清，無菌水重懸，稀釋成0D_ = 0. 1的菌懸液。浸泡滅菌棉花種子30min后，28°C培養4 后，移到生長2天的接有大麗輪枝菌V107的PDA平板上，共培養7天后觀察傷害程度。結果表明假單胞桿菌841P-3(CGMCC No. 5583)浸種后的幼根傷害程度顯著小于用水處理的幼根，如圖6。3. 2提高葉片抗性用菌懸液濃度為OD6tltl = 0. 2假單胞桿菌841P-3 (CGMCC No. 5583)灌根處理長有 2片真葉的棉花植株4 后，取棉花真葉放在水瓊脂平板上接種病原菌大麗輪枝菌菌塊，
培養5天后觀察傷害程度和病斑大小。結果表明假單胞桿菌841P-3 (CGMCC No. 5583) 處理的真葉在接種大麗輪枝菌V107菌塊5天后，未出現傷害程度和病斑，而用水處理真葉出現大面積的傷害，如圖7。實施例4種子出苗率的觀察用濃度為OD6tltl = 0. 1的841P-3 (CGMCC No. 5583)菌懸液浸泡滅菌棉花種子30min 后，28°C培養4 后，然后播種于盛有滅菌營養土的營養盒中，每處理播種50粒種子，每處理設3次重復。15天后調查棉苗數量，結果表明假單胞桿菌841P-3 (CGMCC No. 5583)浸種后能提高棉花幼苗出苗率(表1，圖8)，比對照高出14%。表1. 841P-3對蘇棉9號出苗率的影響
供試菌株出苗數/總苗數出苗率/%
CK (清水)33/5066.0841Ρ-340/5080.0實施例5檢測假單胞菌對強致病性棉花黃萎病的防效菌體懸浮液制備。將假單胞桿菌841P-3 (CGMCC No. 5583)菌株接種在平板LB上， 30°C恒溫培養2d，離心去上清，無菌水重懸，稀釋成OD = 0. 1的菌懸液。棉花黃萎病菌擴繁活化大麗輪枝菌V107菌株，7d后用打孔器(直徑8mm)取同菌齡的菌餅接種于查貝克培養基下150mg/kg搖培7d后接種于滅菌后的麥粒培養基中， 室溫培養14d。取有拮抗作用的菌液浸泡滅菌棉花種子30minJ8°C培養48h的棉種播種于滅菌的蛭石中，生長10天后，移入盛放處理菌土(無菌土 麥粒培養基=1 6)的塑料杯內，每缽2株幼苗，每處理10盆，重復三次。無菌蛭石為對照。苗期調查記錄各處理株高，鮮重， 黃萎病的發病率和病情指數，并計算生防菌對棉花黃萎病的相對防病效果。病情指數統計方法按5級分類標準(0級，無病植株；1級，25%葉片發病的植株；2級，25% 50%葉片發病的植株；3 級，50% 75%葉片發病的植株；4級，75%以上葉片發病的植株)病情指數=Σ (級值X株數)4Χ總株數XlOO
防治效果(％ )=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數X 100結果表明假單胞桿菌841P-3 (CGMCC No. 5583)對棉花黃萎病有好的防治效果(表 2，圖9)，防治效果為46.9%。與CK相比株高和鮮重分多了 0.284cm和0. 177g。表2.拮抗菌防治棉花黃萎病的溫室盆栽效果
權利要求
1.假單胞菌(Pseudomonassp.) 841P-3，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期:2011年12月13日，保藏號=CGMCC No. 5583。
2.權利要求1所述的保藏號為CGMCCNo. 5583的假單胞菌841P-3在防治棉花黃萎病中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物農藥技術領域，涉及一株用于防治棉花黃萎病的假單胞菌及其應用。假單胞菌(Pseudomonas sp.)841P-3，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年12月13日，保藏號CGMCC No.5583。所述的保藏號為CGMCC No.5583的假單胞菌841P-3在防治棉花黃萎病中的應用。通過微生物發酵獲得大量假單胞菌841P-3菌株，且能產生誘導系統抗性，對人畜無毒，對農作物物毒害，綠色環保，防治棉花枯黃萎病效果顯著，具有良好的生物農藥開發前景。
文檔編號C12R1/38GK102533603SQ201210006218
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者唐燦明, 李順鵬, 趙明文, 韓琴 申請人:南京農業大學