專利名稱：一株用于防治棉花黃萎病的芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術領域，涉及一株用于防治棉花黃萎病的芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
由大麗輪枝菌(Verficillium dahliae)引起的黃萎病是棉花的主要病害，對棉花產(chǎn)量和品質(zhì)均造成極大影響。對于棉花黃萎病的防治，國內(nèi)外在抗病育種、農(nóng)業(yè)措施和化學防治等方面均做了大量工作，棉花黃萎病為土傳維管束病害，防治困難，難以找到很好的抗源種質(zhì)資源，因而多年來一直未能培育出高抗黃萎病的棉花新品種，研究開發(fā)的病害防治方法和藥劑亦難以達到理想的防治效果。目前生物防治被認為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ挠行Х乐畏椒ㄖ弧４罅康难芯渴聦嵶C明了生防菌處理植物后能達到促進生長與病害防治的目的。篩選大麗輪枝菌的拮抗細菌用于生物防治，或從拮抗菌中分離抗菌蛋白，克隆抗病基因，是獲得抗病植株的有效手段，而獲得高拮抗活性的菌株是生物防治的基礎。我國在這方面的研究主要在小麥、棉花等作物病害防治上。目前，隨著人們對無公害食品的要求和環(huán)境保護意識的日益增強，人們逐漸擺脫了防治病害完全依賴化學農(nóng)藥的觀點，逐漸把生物防治與病害的綜合治理聯(lián)系起來，并成為其中重要組成部分。植物內(nèi)生細菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的細菌。被內(nèi)生細菌感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在病癥，可通過嚴格表面消毒的植物組織中分離。內(nèi)生細菌主要分布于細胞間與維管束組織，廣泛存在于植物的果實、種子、胚、根、莖、葉中。內(nèi)生細菌具有能促進植物生長，增強宿主植物抗病性的特性， 且因定殖在植物體內(nèi)，能躲避外界環(huán)境和和農(nóng)藥的傷害，與根際細菌相比有更多優(yōu)勢。在植物病害生防細菌中，芽孢桿菌是最易從土壤和植株中分離得到，并表現(xiàn)出較好防病作用的一類重要細菌。它是一類嗜溫好氧或兼性厭氧、能產(chǎn)生耐熱抗逆內(nèi)生孢子的桿狀細菌。由于這類細菌產(chǎn)生的芽孢對高熱、強酸、紫外線、電磁輻射和一些化學藥品有著很強的耐受力，其胞外分泌液中含有蛋白酶、淀粉酶、脂酶等酶類及其他活性代謝產(chǎn)物，因此，這類細菌以芽孢形態(tài)廣泛存在于各種自然環(huán)境中，可以在一些惡劣的環(huán)境中生存，且能分解利用環(huán)境中一些其它微生物難以分解的礦物質(zhì)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，芽孢桿菌在防病的穩(wěn)定性、與化學農(nóng)藥的相容性等方面表現(xiàn)出其他種屬細菌所沒有的優(yōu)勢，加之易于制成粉劑， 便于儲藏運輸，利于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，具有很好的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一株用于防治棉花黃萎病的芽孢桿菌。本發(fā)明的另一目的是提供該芽孢桿菌41B-1的應用。本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Baclillus subtilis) 41B-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委
3員會普通微生物中心，保藏日期2011年12月13日，保藏號CGMCC No. 5582。菌株41B-1分離于陸地棉抗病品系選系R104的根系內(nèi)部。經(jīng)菌落和形態(tài)的顯微觀察、染色反應、常規(guī)生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析，該菌株與枯草芽孢桿菌 (Bacillus subfilis sfrain 2Re5)的同源性達到99. 0%，鑒定為枯草芽孢桿菌株。該菌株形態(tài)特征如下革蘭氏染色陽性，鞭毛多根，長X寬為(0.65-1.0) μ mX (3.0-4. 5) μ m, 41B-菌落圓型，芽孢使孢囊膨大，形狀隆起，不光滑，中間褶皺，邊緣成波浪狀，有菌膜(圖 1)。淀粉水解、需氧性試驗、硝酸還原試驗、過氧化氫酶反應、V-P試驗、利用糖類(D—葡萄糖、L 一阿拉伯搪、D —木糖、D —甘露醇等)產(chǎn)酸和產(chǎn)氣試驗均為陽性，卵磷脂試驗、吲哚陰性，10% Nacl生長、pH 5. 7能生長，最適pH為7. 0，最適培養(yǎng)溫度為37°C，最佳培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，酵母提取物5g, Nacl 10g，蒸餾水1000ml, pH 7. 0。所述的保藏號為CGMCC No. 5582的枯草芽孢桿菌41B-1在防治棉花黃萎病中的應用。有益效果本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌菌株41B-1 (CGMCC No. 5582)能強烈抑制棉花強致病性黃萎病菌Hn-3菌絲的生長。該菌株代謝液產(chǎn)物對黃萎病菌Hn-3的孢子和菌株生長有強的抑制作用，10倍稀釋的發(fā)酵液對黃萎病菌Hn-3菌絲生長的抑制率為97.6%，發(fā)酵液與黃萎病菌Hn-3孢子液等體積培養(yǎng)Mh，孢子基本不萌發(fā)。抗菌物質(zhì)具有有水溶性、熱穩(wěn)定性、酸沉淀、及醇溶性等特點，初步鑒定為脂肽類抗生素。盆栽實驗驗證，41B-1(CGMCC No. 5582) 菌株能促進棉花感病品種蘇棉9號出苗，對蘇棉9號，41B-1防治黃萎病Hn-3的效應為 60.9%。通過微生物發(fā)酵可獲得大量枯草芽孢桿菌菌株41B-1 (CGMCC No. 5582)菌株及抑菌有活性代謝物質(zhì)。芽孢桿菌對人畜無毒，對農(nóng)作物無毒害，綠色環(huán)保，且防治棉花黃萎病效果顯著，具有良好的生物農(nóng)藥開發(fā)前景。


圖1，41B_1的單菌顯微照片及劃線形態(tài)；A :41B-1的單菌顯微照片，B :41B_1菌落劃線形態(tài)。圖2，41B_1對黃萎病菌的抑制作用。圖3，41B_1的無菌發(fā)酵液對黃萎病菌菌絲生長的影響。圖4，41B_1的無菌發(fā)酵液對黃萎病菌孢子萌發(fā)的影響。圖5，41B_1發(fā)酵液中表面活性素的提取及對黃萎病菌的抑制作用。其中，1為氯仿甲醇(65 1)抽提物(即脂肽類抗生素)，2為發(fā)酵液上清，3為甲醇4為未經(jīng)處理的發(fā)酵液。圖6，41B_1對蘇棉9號出苗率的影響。圖7，41B_1對蘇棉9號防治黃萎病的效果。生物材料樣品保藏信息枯草芽孢桿菌(Baclillus subtilis) 41B-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期:2011年12月13日，保藏號=CGMCC No. 5582。
具體實施例方式實施例11. 1細菌的分離取生長健康的現(xiàn)蕾期的棉花抗病品系R104的主根，用滅菌過的刀片取主根5 IOcm處，浸入70%酒精lmin，以1. 05%次氯酸鈉對樣品表面滅菌，滅菌時間為15 18min， 取經(jīng)檢驗表面滅菌徹底的材料1. OOg于無菌研缽中，加滅菌的PBS緩沖液研磨，靜置15min 后加緩沖液定容至10ml，取上面制備的Iml分離液在搖床上劇烈振蕩30min后于80°C的水浴中，保持15 20min。然后用無菌水進行梯度稀釋后涂布LB平板，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h左右，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落，純化后接斜面保存進入初篩程序。1. 2平板擴散法篩選拮抗細菌1. 2. 1. 1菌株的制備將1. 1中分離的所有菌株，在LB平板上活化，挑取一環(huán)接種于含細1 LB培養(yǎng)液的試管中，28°C下170r/min振蕩培養(yǎng)Mh。1. 2. 2. 2棉花黃萎病菌孢子懸浮液的制備取在P DA平板上活化的大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb) Hn_3 (下文稱棉花黃萎病菌Hn-3)菌絲塊，接種于察貝克液體培養(yǎng)基中，28°C下120r/min恒溫搖床振蕩培養(yǎng)6天。用滅菌紗布濾去培養(yǎng)液中的菌絲，用無菌水將孢子濃度調(diào)為IX IO7Hir1備用。吸取制備好的棉花黃萎病菌Hn-3孢子懸浮液anl，加入到熔化并冷卻到45°C左右的100ml PDA培養(yǎng)基中，混勻，傾覆在已凝固的PDA平板上，待上層培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板上打孔(直徑為6mm)，在每個孔內(nèi)加各供試菌株培養(yǎng)液30 μ 1，以LB培養(yǎng)液作為空白對照，每處理設3個重復，將平板置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 后觀察是否可產(chǎn)生抑菌圈 (圖幻，選擇抑菌直徑大，效果穩(wěn)定的株菌，命名為41B-1。該菌株形態(tài)特征如下革蘭氏染色陽性，鞭毛多根，長X寬為(0. 65-1. 0) μ mX (3. 0-4. 5) μ m。41B-1菌落圓型，芽孢使孢囊膨大，形狀隆起，不光滑，中間褶皺，邊緣成波浪狀，有菌膜(圖1)。淀粉水解、需氧性試驗、 硝酸還原試驗、過氧化氫酶反應、V-P試驗、利用糖類(D —葡萄糖、L 一阿拉伯搪、D —木糖、 D 一甘露醇等)產(chǎn)酸和產(chǎn)氣試驗均為陽性，卵磷脂試驗、吲哚陰性，10% Nacl生長、pH 5. 7 能生長。最適PH為7.0，最適培養(yǎng)溫度為37°C。最佳培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，蒸餾水1000ml，pH 7.0。經(jīng)16S rDNA序列分析，菌株41B-1與枯草芽孢桿菌(Bacillus subfilis sfrain 2Re5)的同源性達到99. 0%，鑒定為枯草芽孢桿菌株。將該菌株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2011年12月 13 日，保藏號CGMCC No. 5582。實施例2草芽孢桿菌41B-1 (CGMCC No. 5582)拮抗機理研究2. 1枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備用牙簽提取41B_1(CGMCC No. 5582)單菌落到液體LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，蒸餾水1000ml,pH 7. 0)，37°C，12h，后按1 %接種量接種到新鮮LB培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)48h，將上述枯草芽孢桿菌菌液，經(jīng)離心(lOOOOr/min，20min)后，取上清用0. 22 μ m的濾膜過濾得到該菌的無菌發(fā)酵液，密封后置于冰箱內(nèi)待用。2. 241B-1 (CGMCC No. 5582)發(fā)酵液對黃萎病菌Hn_3菌絲生長的抑制作用取2. 1中制備的41B-1 (CGMCC No. 5582)無菌發(fā)酵液，按不同比例與冷卻45°C左右的PDA培養(yǎng)基均勻混合，凝固后在平板中央接種黃萎病菌Hn-3菌塊，對照加LB。每處理 3個重復，28°C培養(yǎng)7天，測菌塊菌落直徑，計算抑菌率，無菌水作對照，結果表明10倍稀釋的發(fā)酵液對黃萎病菌Hn-3菌絲生長的抑制率為97. 6%，200倍稀釋后抑制直徑仍能達到 37. 3% (表 1，圖 3)。表1.代謝液不同稀釋比例的拮抗效果
_CK_0.5:100_1:100_2:100直徑(cm)L85ΓΤ 075065
抑制率 ％_0_3Λ3_59,5_64.92. 341Β-1 (CGMCC No. 5582)發(fā)酵液對黃萎病孢子萌發(fā)抑制作用制備黃萎病菌Hn-3孢子懸液(方法同1. 2. 2. 2)，取等體積孢子懸液與 41B-1 (CGMCC No. 5582)無菌發(fā)酵液，震蕩培養(yǎng)7d，LB作對照，檢測孢子的萌發(fā)情況，結果表明培養(yǎng)24h后處理孢子基本不萌發(fā)，圖4。實施例3發(fā)酵液中拮抗物質(zhì)初步性狀的測定3. 1熱穩(wěn)定性取2. 1 中制備的 41B_1(CGMCC No. 5582)無菌發(fā)酵液，分別經(jīng) 40°C，60°C，80°C， 100°C水浴30min，，以未經(jīng)水浴處理的發(fā)酵液為對照，采用平板擴散法檢測其對棉花黃萎病菌Hn-3的抑菌活性，結果表明拮抗物質(zhì)具有強的熱穩(wěn)定性(表2)。表2.不同溫度對拮抗物質(zhì)抑菌活性的影響
溫度rc)CK406080100抑菌直徑(cm)01. 51. 21.丄1. 03. 2對pH的穩(wěn)定性取2. 1中制備的41B-1 (CGMCC No. 5582)無菌發(fā)酵液，將其pH值分別調(diào)為5. 0， 7. 0，10. 0和12. 0。以未經(jīng)處理的41B-1 (CGMCC No. 5582)無菌發(fā)酵液為對照，采用平板擴散法檢測其對棉花黃萎病菌Hn-3的抑菌活性，結果表明抑菌物質(zhì)的最適pH范圍為7-10，偏酸或偏堿拮抗性均有所減弱。當PH值為7. 0時，活性最大，抑菌直徑為1. 70，高于未處理粗提液PH為8. 8抑菌直徑為1.63。pH值小于3時，有沉淀析出(表3)。表3.不同pH下抑菌物質(zhì)活性變化
pH 5. 07. 08. 8 (CK)10. 012. 0抑菌直徑(cm) 1. 131. 701. 631. 631. 16實施例4發(fā)酵液中脂肽類抗生素的提取及抗性鑒定用牙簽提取41B-1 (CGMCC No. 5582)單菌落到液體LB培養(yǎng)基，37°C，12h，按2%接種量接種到新鮮LB培養(yǎng)基，28°C震蕩培養(yǎng)48h，12000，4°C，離心20分鐘，取上清用5M HCl 調(diào)pH至2.0，然后輕微攪動池或過夜。離心，用有機物氯仿甲醇(65 1)抽提沉淀，抽提物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機相，得到的即為41B-1 (CGMCC No. 5582)脂肽類抗生素，用PH8. 0的無菌水溶解過濾除菌后檢查抑菌活性，以41B-1 (CGMCC No. 5582)無菌發(fā)酵液作為陽性對照，觀察氯仿甲醇陽5 1)抽提物(即脂肽類抗生素)、發(fā)酵液上清、甲醇、未經(jīng)處理的發(fā)酵液對黃萎病菌的抑菌效果。結果顯示41B-1(CGMCC No. 5582)脂肽類抗生素對棉花黃萎 病菌有強的抑菌作用，與CK 一樣，而HCl沉淀后所得的上清液沒有抑菌活性(圖5)。實施例MlB-I (CGMCC No. 5582)對棉花黃萎病菌的防治效果5.1種子出苗率的觀察菌體懸浮液制備將41B-1 (CGMCC No. 5582)接種在液體LB中，37°C恒溫培養(yǎng)Mh， 離心去上清，無菌水重懸，稀釋成OD = O. 1的菌懸液。用41B-1 (CGMCC No. 5582)細菌懸浮液 浸泡表面滅菌的蘇棉9號棉花種子Mh，然后播種于盛有滅菌營養(yǎng)土的營養(yǎng)盒中，每處理播 種50粒種子，每處理設3次重復。15天后調(diào)查棉苗數(shù)量，結果表明41B-1 (CGMCC No. 5582) 浸種后能提高棉花幼苗出苗率(表4，圖6)，比對照高出18%。表4. 41B-1對蘇棉9號出苗率的影響
權利要求
1.枯草芽孢桿菌(Baclillussubtilis)41B-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年12月13日，保藏號CGMCC No. 5582。
2.權利要求1所述的保藏號為CGMCCNo. 5582的枯草芽孢桿菌41B-1在防治棉花黃萎病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術領域，涉及一株用于防治棉花黃萎病的芽孢桿菌及其應用。枯草芽孢桿菌(Baclillus subtilis)41B-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年12月13日，保藏號CGMCC No.5582。所述的保藏號為CGMCC No.5582的枯草芽孢桿菌41B-1在防治棉花黃萎病中的應用。枯草芽孢桿菌41B-1(CGMCC No.5582)對人畜無毒，對農(nóng)作物無毒害，綠色環(huán)保，防治棉花黃萎病效果顯著，具有良好的生物農(nóng)藥開發(fā)前景。
文檔編號C12N1/20GK102443559SQ20121000616
公開日2012年5月9日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權日2012年1月10日
發(fā)明者唐燦明, 李順鵬, 趙明文, 韓琴 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學