專利名稱：一種短小芽孢桿菌及其在殺滅線蟲中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) 在殺滅線蟲中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲已知種類達(dá)70 多種，危害3000多種植物，每年造成損失巨大。化學(xué)殺線蟲劑自上個世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)以來， 在線蟲防治中發(fā)揮了重要作用。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)許多化學(xué)殺線蟲劑均有副作用， 造成環(huán)境污染，危害人體健康。相繼有不少被禁用或即將禁用。特別是植物寄生線蟲發(fā)生于作物根部，由于土壤環(huán)境的特殊性，必須大劑量施用才能保證其防效。而大劑量化學(xué)農(nóng)藥對地下水污染非常嚴(yán)重。因此，研究開發(fā)高效低毒低殘留殺線蟲劑已經(jīng)是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的重要課題。短小芽孢桿菌是一類非常重要的生防菌資源。目前國外主要將短小芽孢桿菌應(yīng)用于防治蔬菜的根部病害，我國也有用短小芽孢桿菌防治番茄灰霉病、黃瓜菌核病菌等植物病害的報道(李桂霞等，2009 ；于婷等，2009)。目前，尚未有任何過于短小芽孢桿菌殺根結(jié)線蟲的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對一株具有強(qiáng)殺線蟲活性的短小芽孢桿菌的研究，提供一種具有殺線蟲功能的短小芽孢桿菌^Bacillus pumilus)在殺滅殺線蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明通過研究測定短小芽孢桿菌的殺線蟲活性，能制備出高效的殺線蟲菌劑， 這對植物線蟲病害的生物防治具有重要的理論指導(dǎo)意義和實(shí)踐應(yīng)用價值。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方法是將短小芽孢桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，對其進(jìn)行殺線蟲藥效試驗(yàn)，測定其對全齒復(fù)活線蟲(Fanagrellus ret/iriras)、根結(jié)線蟲{Meloidogyne incognitaH 結(jié)線蟲蟲卵的殺蟲效果，確定其對線蟲的殺傷作用。本發(fā)明篩選到的一株對植物寄生線蟲具有很好殺蟲功能的短小芽孢桿菌為 Bacillus pumilusο短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株的形態(tài)特征為呈短桿狀，菌體大小 0. 58X2. Ium,具內(nèi)生芽孢，革蘭氏染色呈陽性。該菌株在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上菌落突起，邊緣光滑細(xì)膩，呈乳白色，直徑1. Imm 1.8mm ；在DSMZ88改良固體培養(yǎng)基上，菌落較小，呈白色，菌落表面較干燥，邊緣粗糙，不規(guī)則直徑為，1.5-2. 0mm。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的制備 短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的培養(yǎng)方法
1.試管種培養(yǎng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂13g，蒸餾水1000ml，pH6. 8 7. 2，將短小芽孢桿菌接種到該培養(yǎng)基上，25°C 37°C下培養(yǎng)Mh，獲得試管種；2.液體擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為每IOOOml蒸餾水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g， pH7. 2 7. 4，將短小芽孢桿菌試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝100ml，于 25°C 37°C下?lián)u床培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速150 250rpm。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)殺線蟲活性試驗(yàn)
1.制備全齒復(fù)活線蟲iPanagrellusredivivus)線蟲將/rei/irims線蟲接種于固體培養(yǎng)基上，經(jīng)活化處理后保存于4°C冰箱備用；將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml 離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲，用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μ 的線蟲懸浮液；
2.制備根結(jié)線蟲卵iia)及其蟲卵
取含根結(jié)線蟲的煙根，剪碎放入廣口瓶中，加入過氧乙酸溶液，振蕩3-5 min后倒入雙層篩上(上層篩60目，下層篩400目)，用無菌水反復(fù)沖洗后，得到根結(jié)線蟲卵及其成蟲； 短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)糸P. redivivus線蟲的活性測定 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后到平板，表面鋪一層玻璃紙，等量接入該菌懸液，37°C培養(yǎng)Mh (空白對照不接菌，每種培養(yǎng)基有三個重復(fù))；待菌苔長成后，接入AreiZiWt^s線蟲約500條/皿；1 觀察一次，連續(xù)觀察36h，每次隨機(jī)選取100條線蟲計算死亡率。短小芽孢桿菌pumilus) ^Wi結(jié)線電(Meloidogyne incognita) 蟲卵的活性測定
將該菌液加入6孔細(xì)胞板中每孔:3ml，分A、B兩組各三個重復(fù)，A組每孔菌液中加入根結(jié)線蟲卵100枚；B組每孔菌液中加入根結(jié)線蟲100條，以無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基分別加入線蟲卵和成蟲為對照各做3個重復(fù)，每24h觀察一次根結(jié)線蟲卵的變化；每1 觀察一次根結(jié)線蟲的變化，鑒定線蟲死亡的方法為在處理中加入1 5滴5%NaCl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的短小芽孢桿菌(feciBM pumilus)對A redivivus 線蟲具有較高的殺傷作用，36小時線蟲死亡率達(dá)100%。對根結(jié)線蟲也具有較好的殺傷作用，36小時線蟲死亡率96%，蟲體僵直。同時通過用該菌液處理根結(jié)線蟲卵，發(fā)現(xiàn)它能破壞卵殼，對蟲卵的正常孵化有一定的抑制作用。本發(fā)明的短小芽孢桿菌UaciBm ρ麗ilus、1siP. redivivus線蟲、根結(jié)線蟲和根結(jié)線蟲卵具有較好的殺傷效果，可以作為線蟲生防菌劑進(jìn)行開發(fā)。


圖1顯示處理線蟲降解情況。圖2顯示蟲體保持完好的對照線蟲。圖3顯示處理蟲卵破裂情況。圖4顯示保持完好的對照蟲卵。
具體實(shí)施例方式1、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的制備
短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)從野外獲得，具體的培養(yǎng)方法如下
1)試管種培養(yǎng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂13g，蒸餾水1000ml，pH6. 8 7. 2，將短小芽孢桿菌接種到該培養(yǎng)基上，25°C 37°C下培養(yǎng)Mh，獲得試管種；
2)液體擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為每IOOOml蒸餾水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g， pH7. 2 7. 4，將短小芽孢桿菌試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝100ml，于 25°C 37°C下?lián)u床培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速150 250rpm。2、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)殺線蟲活性試驗(yàn)
1)制備全齒復(fù)活線蟲iPanagrellusredivivus)線蟲將A rei/irims線蟲接種于固體培養(yǎng)基上，經(jīng)活化處理后保存于4°C冰箱備用；將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml 離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲，用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μ 的線蟲懸浮液；
2)制備根結(jié)線蟲(ifehii/o^j/^iflco卵ite)及其蟲卵取含根結(jié)線蟲的煙根，剪碎放入廣口瓶中，加入過氧乙酸溶液，振蕩3-5 min后倒入雙層篩上(上層篩60目，下層篩400 目)，用無菌水反復(fù)沖洗后，得到根結(jié)線蟲卵及其成蟲。3、短小芽孢桿菌{Bacillus pumilus)糸P. redivivus線蟲的活性測定
將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后到平板，表面鋪一層玻璃紙，等量接入該菌懸液，37°C培養(yǎng)Mh (空白對照不接菌，每種培養(yǎng)基有三個重復(fù))；待菌苔長成后，接入AreiZiWt^s線蟲約500條/皿；1 觀察一次，連續(xù)觀察36h，每次隨機(jī)選取100條線蟲計算死亡率。4、短小芽孢桿菌pumilus)結(jié)線^SMeloidogyne incognita) R 其蟲卵的活性測定
將該菌液加入6孔細(xì)胞板中每孔:3ml，分A、B兩組各三個重復(fù)，A組每孔菌液中加入根結(jié)線蟲卵100枚；B組每孔菌液中加入根結(jié)線蟲100條，在無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 (牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸餾水1000ml，pH7. 2 7. 4)分別加入線蟲卵和成蟲為對照各做 3個重復(fù)，每24h觀察一次根結(jié)線蟲卵的變化；每1 觀察一次根結(jié)線蟲的變化，鑒定線蟲死亡的方法為在處理中加入1 5滴5%NaCl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。5、試驗(yàn)結(jié)果
表1短小芽孢桿菌〈Bacillus pumilus)對P. redivivus線蟲的殺傷效果
權(quán)利要求
1.一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)在殺滅線蟲中的應(yīng)用。
2.一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的培養(yǎng)方法，其特征在于按以下進(jìn)行1)試管種培養(yǎng)將短小芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，25°C 37°C下培養(yǎng) Mh，獲得試管種；2)液體擴(kuò)大培養(yǎng)將短小芽孢桿菌試管種接種到液體培養(yǎng)基中，于25°C 37°C下?lián)u床培養(yǎng)Mh，轉(zhuǎn)速150 250rpm。
3.一種制備全齒復(fù)活線蟲iPanagrellus redivivus)及其蟲卵的方法，其特征在于按以下進(jìn)行1)將Aredivivus線蟲接種于固體燕麥培養(yǎng)基上，28°C下培養(yǎng)6天后，4°C保存?zhèn)溆茫?)將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心， 棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲，用無菌水將線蟲稀釋到含量為15條/μ 的線蟲懸浮液；3)制備根結(jié)線蟲(ifehii/o^j/^iflco卵ite)及其蟲卵取含根結(jié)線蟲的煙根，剪碎放入廣口瓶中，加入過氧乙酸溶液，振蕩3-5 min后倒入雙層篩上，上層篩60目，下層篩400 目，用無菌水反復(fù)沖洗后，得到根結(jié)線蟲卵及其成蟲。
4.一種權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌iBacillus pumilus)殺線蟲活性試驗(yàn)方法，其特征在于按以下進(jìn)行1)短小芽孢桿菌殺線蟲的活性測定將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，表面鋪一層玻璃紙，等量接入該菌株菌懸液，37°C培養(yǎng)Mh，對照不接菌，每種培養(yǎng)基有三個重復(fù)；待菌苔長成后，接入線蟲500條/皿，每1 觀察一次，連續(xù)觀察36h，每次隨機(jī)選取100條線蟲計算死亡率；2)短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)殺根結(jié)線蟲及其蟲卵的活性測定將該菌液加入6孔細(xì)胞板中每孔:3ml，分A、B兩組各三個重復(fù)，A組每孔菌液中加入根結(jié)線蟲卵100枚； B組每孔菌液中加入根結(jié)線蟲100條，在無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中分別加入線蟲卵和成蟲做對照，各做3個重復(fù)，每24h觀察一次根結(jié)線蟲卵的變化，每1 觀察一次根結(jié)線蟲的變化；鑒定線蟲死亡的方法為在處理中加入1 5滴5%NaCl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種短小芽孢桿菌及其在殺滅線蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明中應(yīng)用的具有殺線蟲功能的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)菌株的形態(tài)特征為呈短桿狀,菌體大小0.58×2.1um,具內(nèi)生芽孢,革蘭氏染色呈陽性。在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上菌落突起，邊緣光滑細(xì)膩，呈乳白色，直徑1.1mm～1.8mm；在DSMZ88改良固體培養(yǎng)基上，菌落較小,呈白色,菌落表面較干燥,邊緣粗糙，不規(guī)則,直徑為1.5-2.0mm。本發(fā)明按常規(guī)方法制備。即將短小芽孢桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，測定其對全齒復(fù)活線蟲(Panagrellusredivivus)、根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)及根結(jié)線蟲蟲卵的殺蟲效果。本發(fā)明的用短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)對P.redivivus線蟲、根結(jié)線蟲和根結(jié)線蟲卵具有較好的殺傷效果，可以作為線蟲生防菌劑進(jìn)行開發(fā)。
文檔編號A01N63/00GK102283253SQ20111025506
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者常壽榮, 徐潔, 王紹坤, 羅華元, 陶南 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所, 紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司