本發明涉及一種低溫乳糖酶、該酶的產生菌及其制備方法。具體而言，本發明涉及一種由嗜冷桿菌(cryobacteriumsp.)新菌株lw097產生的、在較低的溫度下具有較高活性的乳糖酶，及其利用該微生物菌株制備低溫乳糖酶的生產方法，屬于微生物技術領域。

背景技術：

牛乳等大多數哺乳動物母乳中都含有乳糖。人類食用乳品中的乳糖后，主要由分布于小腸刷狀緣細胞膜上的乳糖酶根皮苷水解酶所水解，但亞洲人群由于遺傳背景和飲食差異等原因，90％以上的人乳糖酶缺乏，食用乳制品后乳糖不能被消化和吸收，產生腹痛、腹脹、惡心和嘔吐等乳糖不耐受的癥狀(husain2010)。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,ec3.2.1.23)，俗稱乳糖酶，能夠體外水解乳品中的乳糖，從而有效避免乳糖不耐癥患者由于自身乳糖酶缺乏而導致食用乳品產生的不良反應。此外，利用β-半乳糖苷酶水解乳制品中的乳糖，能夠同時克服煉乳、奶粉及冰淇淋等乳制品的乳糖析出問題，延長貨架期，提高乳制品的甜度。

目前用于分解乳品中乳糖的β-半乳糖苷酶主要來源于公認安全(gras)的克魯維酵母屬(kluyveromycessp.)和曲霉屬(aspergillussp.)的菌株(oliveiraetal.2011)，均屬于中溫乳糖酶。商品名為lactozym的β-半乳糖苷酶，即為來源于乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)的中溫β-半乳糖苷酶。該酶最適反應溫度為50℃，在低于20℃的低溫條件下水解乳糖的效率僅為常溫下的10％左右，其酶活還易受到ca2+和na+的抑制(wierzbicka-wosetal.2011)。實際生產若采用常溫水解，增大了牛乳腐敗變質的風險；而選擇低溫水解則使生產周期延長、成本增加，嚴重限制了低乳糖牛乳的產能并推高了生產成本。因此，為開發獲得更適合低溫條件下低乳糖牛乳生產的β-半乳糖苷酶，各國均試圖從各種低溫生境的微生物中分離獲得酶學特性滿足乳品低溫加工所需的低溫β-半乳糖苷酶。

由于每種微生物所產酶的特性通常存在差異，如酶的作用ph范圍和最適酶解ph、酶的作用溫度范圍與最適作用溫度以及酶的熱穩定性等，國際上對產低溫酶微生物的研究主要聚焦于南北極冰川及深海環境。

以下為目前低溫乳糖酶研究的主要菌種及其產生的乳糖酶的特性。

節桿菌屬(arthrobactersp.)的d2菌株，其產生的乳糖酶最適作用溫度為25℃，在10℃僅可保留40％酶活，50℃處理10分鐘基本失去活性(lovelandetal.1994)。

肉桿菌屬(carnobacteriumpiscicola)ba菌株，其產生的乳糖酶的最佳作用溫度為30℃，穩定性較差，需在添加10％甘油的溶液中保存，40℃處理10min完全失去活力(coombsandbrenchley1999)。

動性球菌屬(planococcus)菌株，其產生的乳糖酶最適ph為6.5，最佳作用溫度為42℃，55℃處理10min可以完全失去活力(sheridanandbrenchley2000)。

從南極蝦體內分離的假交替單胞菌屬pseudoalteromonassp.22b菌株，其產生乳糖酶最適溫度為6℃，其產生的乳糖酶的最佳作用溫度為40℃(ph6.0-8.0)，k+,na+,mn2+,mg2+對該乳糖酶有一定的激活作用，cu2+對該乳糖酶有抑制作用，ca2+對該乳糖酶無明顯抑制或激活作用(turkiewiczetal.2003)。

從南極干谷(antarcticdryvalley)土壤分離的節桿菌屬(arthrobacter)菌株，其產生的一種乳糖酶最佳作用溫度為18℃，0℃保留50％的酶活性，對熱敏感，37℃處理10min酶活消失。

黃桿菌屬flavobacteriumsp.4214菌株，其產生乳糖酶最適溫度為25℃，其產生的乳糖酶的最佳作用溫度為42℃，對25℃以上溫度較敏感(sorensenetal.2006)。

從節桿菌屬的arthrobacterpsychrolactophilusf2菌株，其產生的一種乳糖酶rbglap最佳作用溫度為10℃，ph8.0，50℃處理5min失去活性。

從新疆天山一號冰川分離的水生拉恩氏菌(rahnellaaquatilis)菌株14-1，其產生的乳糖酶的最適反應溫度為35℃，最適反應ph值為6.5-7.0(劉文玉2008)。

普魯蘭久浩酵母(guehomycespullulans)17-1菌株，其產生的乳糖酶的最佳作用溫度為50℃，最佳作用ph為4.0(songetal.2010)。

副球菌屬paracoccussp.32d菌株，其產生的乳糖酶的最佳作用溫度為40℃，最佳作用ph為7.5(wierzbicka-wosetal.2011)。

海旋菌屬的thalassospirasp.3sc-21，其產生的乳糖酶的最佳作用溫度為20℃，最佳作用ph6.5，45℃處理失去酶活。

從新疆天山一號冰川分離的拉恩氏菌屬rahnellasp.r3菌株，其產生乳糖酶的能力為3.01u/ml，該酶的最適作用溫度為25℃，最適ph為7.0，15℃時的酶活為最高酶活的92％，4℃時為31％(沈蓮蓮2013)。

技術實現要素：

針對目前國內外產低溫乳糖酶的菌株性能尚不能滿足低溫乳糖酶工業化生產技術的要求。本發明的目的在于提供一種低溫乳糖酶，產生該酶的微生物菌種及生產該低溫乳糖酶的方法。所述的低溫乳糖酶能在低溫條件下有效水解乳品中的乳糖，在經巴氏滅菌熱處理后可滅失其酶活性。

本發明通過對新疆天山冰川沉積層的土壤樣本進行微生物菌種的分離、培養和篩選，獲得一批耐低溫微生物菌株，并從中分離篩選出低溫乳糖酶產生菌株，編號為lw097，從而提供了一株低溫乳糖酶產生菌，其具有生產低溫乳糖酶的優良特性。

同時，本發明還提供了一種低溫乳糖酶，通過利用本發明的菌株經過本發明確定的具體發酵工藝而獲得。

本發明提供了一種低溫乳糖酶菌株，命名為lw097，其能夠產生低溫乳糖酶。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位：中國典型培養物保藏中心(cctcc)。地址：湖北省武漢市武昌區八一路珞珈山，郵編：430072，保藏日期是2017年1月9日，保藏號：cctccm2017015。該菌株培養溫度5～20℃，最適培養溫度16℃；優先生長于1/4tsb培養基表面(大豆肉湯水解物1.25g，酪蛋白水解物4.25g，氯化鈉0.5g，葡萄糖0.75g，磷酸氫二鈉0.425g，蒸餾水1000l)，經16℃培養72小時，菌落呈白色透明狀，菌落直徑1.2mm,依據微生物學鑒定有關方法，對該菌株的16srdna序列進行系統進化分析，確定lw097菌株屬于嗜冷桿菌屬(cryobacteriumsp.)。嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097可產低溫乳糖酶，在ph4.0～10.0,5～50℃范圍內均有作用，其最適酶解條件為溫度25～30℃，ph6.0。本發明進一步建立了菌種保藏、選育的系統工藝流程技術。

本發明的低溫乳糖酶產生菌cryobacteriumsp.lw097，其16srdna序列為<210>1。

將lw097的16srdna序列與genebank中的同源序列進行對比及進化分析，lw097的16srdna序列與cryobacteriumarcticumpamc27867的同源性達到99％，與多株cryobacterium屬菌株的同源性都達到99％以上，且對其同源序列進行進化分析，cryobacteriumsp.tmn-42(jx949938.2)與lw097分在同一分支，其系統進化關系如圖1所示，暫定該菌株為嗜冷桿菌cryobacteriumsp.lw097。

作為本發明低溫乳糖酶的產生菌種，既可為本發明所保護的菌株，也可為自然篩選的原始菌株，或為保護菌株通過自然變異或人工誘導變異的變異菌株，通過本發明所述的方法，均可實現本發明所闡述的技術效果。

作為上述變異菌株的研制方法，包括物理誘變，如紫外線輻射處理、鈷60輻照處理、離子注入處理、激光輻照處理等各種射線處理；化學誘變，如亞硝基胍(ntg)、硫酸二乙酯等化學誘變劑處理，用常規乳糖酶產生菌分離篩選培養基及方法優化篩選出生產性能優異的菌株。

作為本發明低溫乳糖酶的產生菌種，還可以是通過分子生物學技術，從原始菌株或誘導變異菌種中獲取該低溫乳糖酶基因，所獲取的低溫乳糖酶基因序列為<210>2；<210>3；<210>4；<210>5中的一種；以原核微生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，植物乳桿菌菌、乳酸乳球菌等，以真核微生物，如釀酒酵母、畢赤酵母、乳酸克魯維酵母等，作為基因受體菌，構建基因工程生產菌株，也可作為本發明的低溫乳糖酶產生菌種。

作為本發明的低溫乳糖酶產生菌種cryobacteriumsp.lw097，可采用如下方法對其進行保存、活化與篩選，及其搖瓶發酵獲得本發明的低溫乳糖酶。

本發明的低溫乳糖酶產生菌cryobacteriumsp.lw097采用常規的斜面傳代保存法，此方法是將本發明菌種接種于只要適合于細菌生長的斜面培養基表面，15～20℃培養3～4天，再于4℃下低溫保藏，可存放3個月左右，或是利用真空冷凍干燥法將本發明菌種制成干粉菌種，低溫或常溫保藏可達1年以上。

長期保藏的菌種在使用時按如下方法進行活化、篩選。將長期保藏的本發明菌種接種于1/4tsb培養基或其他適合于該細菌生長的培養基表面，15～20℃培養3～4天；本發明優先選用1/4tsb培養基表面(大豆肉湯水解物1.25g，酪蛋白水解物4.25g，氯化鈉0.5g，葡萄糖0.75g，磷酸氫二鈉0.425g，蒸餾水1000l)。再將培養后的菌種接種于乳糖酶篩選培養基上，其篩選培養基如下：大豆肉湯水解物1.25g，酪蛋白水解物4.25g，氯化鈉0.5g，葡萄糖0.75g，磷酸氫二鈉0.425g，瓊脂15g，蒸餾水1000l，x-gal0.01％，itpg0.1mm，經16℃培養72小時，生成藍色菌落。產生藍色菌落意味著菌株可產生乳糖酶。

利用經篩選出的本發明的實驗菌株進行發酵培養實驗，獲得本發明的低溫乳糖酶。在發酵培養過程中，可將斜面菌種直接接種于發酵培養基中，或是將菌株先進行液體增殖培養，再以5％～15％的接種量接種于發酵培養基中進行發酵培養。

作為培養基的營養源，可廣泛使用通常用于培養的營養源。只要是可作為碳源同化的碳化合物或者是含有該碳化合物的，微生物菌種可利用的、適合于發酵培養產生發明菌的低溫乳糖酶的碳源即可，例如，可使用淀粉、玉米粉、葡萄糖、麥芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。其用量依據其他營養源的選擇不同及培養條件的差異而有所不同，本發明中優選乳糖為最優碳源，其用量為4％。

作為氮源，只要是可作為氮源同化的氮化合物或者是含有該氮化合物的即可，例如，可用銨鹽、硝酸鹽、大豆粉、肉類提取物、玉米浸漬液、玉米漿、酵母膏等。其氮源的選擇和用量，可依據其他營養源的成分和用量的不同而不同，只要選適于本發明的低溫乳糖酶產生菌的培養及酶的產生即可。本發明中優選胰蛋白胨+酵母浸膏為最佳的氮源，其用量分別為1.5％和0.5％。

作為無機鹽類，可適當添加磷酸氫氨、磷酸二氫鉀等的磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽等的鹽類。培養條件依據培養基的組分多少而不同，但只要是適合于菌體培養產生本發明中的乳糖酶的條件即可。

通常，可選擇以下的條件進行培養。即，培養溫度為15～20℃，最好為16℃；培養時間約3～4天，只要在本發明的低溫乳糖酶的生產量達到最高時結束培養即可；培養基的ph可在6～8的生產范圍，特別是在7左右更適合于本發明乳糖酶的生產。經如上所述的培養，主要在菌體細胞內產生目的產物低溫乳糖酶。

從如上所得的培養液中采集低溫乳糖酶，可按照通常用于采集細胞內酶的方法，如反復凍融、乙酸乙酯處理、超聲波破碎、高速勻漿破碎等，進一步由離心、硫酸銨鹽析、超濾濃縮、冷凍干燥、色譜分離等，分離精制而進行。

即，可由下述方法獲得本發明的低溫乳糖酶：由過濾法或離心分離法從發酵液中分離得到菌體，對收集的菌體采用磷酸鹽緩沖液進行沖洗和重懸后，通過反復凍融法、超聲破碎法或高速勻漿破碎法，使酶從細胞內釋放出來，添加可溶性鹽類，使酶沉淀的鹽析法；添加親水性的有機溶劑，使酶活夾雜沉淀的有機溶劑沉淀法；使用離子交換樹脂等的吸附脫離法；凝膠過濾法；添加穩定輔助劑或不添加穩定輔助劑的噴霧干燥法；單獨或多個組合使用冷凍干燥等的分離或精制方法。

通過本發明如上的闡述，得到后面實施例進一步的驗證，得知本發明低溫乳糖酶的酶學特性。本發明菌株lw097產生的低溫乳糖酶最適酶解ph為6.0左右，在ph4～9范圍內可保持較高的酶活性；在5～50℃范圍內均有酶活性，其最適作用溫度在30℃左右；該低溫乳糖酶在低溫下的穩定性較好，對熱較敏感，20℃下保溫120min，其酶活仍可保持80％左右；金屬離子對低溫乳糖酶的活性具有一定的影響作用，其中k+對其酶學活性有一定的激活作用，cu2+、fe2+對其酶學活性有顯著的抑制作用，ca2+、zn2+、mn2+、mg2+、na+和fe3+對其酶學活性影響較小。

通過實施本發明具體的技術指標，實現本發明內容，可以達到以下有益效果。

本發明的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097及在微生物分類學上來說與其同等的菌株及其變異菌株，可有效地用于產生本發明的低溫乳糖酶。再有，本發明的優點在于，使用所述菌株制造具有上述性質的低溫乳糖酶的方法可有效的產生所述的低溫乳糖酶。

一種嗜冷桿菌菌株，其特征在于，所述嗜冷桿菌菌株cryobacteriumsp.lw097為以保藏號cctccm2017015保藏于中國典型培養物保藏中心的菌株。

一種低溫乳糖酶的生產方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、菌種活化：對權利要求1中所述的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097進行菌種活化培養；

b、產酶發酵：利用步驟a獲得的活化菌種進行產酶發酵培養，即可得到低溫乳糖酶。

a步驟中使用培養基a，所述培養基a按照質量體積比配得，乳糖1％～2％，酵母浸膏1％～2％，nacl0.5％～1％，胰蛋白胨0.5％～1％，蒸餾水溶解調整ph至6.8～7.2；活化培養的溫度為15～20℃，培養4～5天，制得活化的種子培養液。

將a步驟制得的種子培養液按照5～15％接種量接種于如下發酵培養基b中，培養基b按照質量體積比配得，乳糖1％～4％，胰蛋白胨4％～5％，酵母浸膏1％～2％，硫酸鎂0.03％～0.3％，磷酸二氫鉀0.003％～0.007％，氯化鈣0.009％～0.013％，硫酸錳0.0001％～0.0002％，硫酸亞鐵0.002％～0.005％，余量的水，ph為6.5～7.5，滅菌后，在16℃，150～300轉/分鐘下振蕩培養56h～60h，培養后，離心分離收集菌體，～70℃和50℃反復凍融3～5次后，離心分離收集上清獲得低溫乳糖酶粗酶液，該粗酶液產酶量可達5u/ml。

向所得的低溫乳糖酶粗酶液中加入硫酸銨，使其飽和度達到60％以上，靜置得到沉淀，將得到的沉淀加入磷酸鹽緩沖液中，磷酸鹽緩沖液溶解沉淀后，再以透析袋透析脫鹽，所得低溫乳糖酶的酶活力可達38u/ml。

附圖說明

圖1所示為基于本發明的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097的16srdna序列的進化分析拓撲結構圖。

圖2所示為以本發明的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097產生的低溫乳糖酶反應ph和相對酶活性關系的圖。

圖3所示為以本發明的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097產生的低溫乳糖酶反應溫度和相對酶活性關系的圖。

圖4所示為以本發明的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097產生的低溫乳糖酶在各溫度下處理殘余酶活性的圖。

圖5所示為以本發明的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097產生的低溫乳糖酶在各反應ph下處理殘余酶活性的圖。

圖6所示為各種金屬離子對本發明的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097產生的低溫乳糖酶酶活性的影響作用。

圖7所示為以鄰硝基苯(onp)為標準品，od值與鄰硝基苯(onp)含量之間的關系。

下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。

具體實施方式

實施例1：產低溫乳糖酶嗜冷桿菌(cryobacteriumsp.)菌株lw097的培養

將本發明的低溫乳糖酶產生菌lw097接種于添加0.01％x～gal，0.1mmiptg的1/4tsb平板培養基中，其中大豆肉湯水解物1.25g，酪蛋白水解物4.25g，氯化鈉0.5g，葡萄糖0.75g，磷酸氫二鈉0.425g，蒸餾水1000l，1.0kg/cm2蒸汽滅菌15分鐘。經16℃培養72小時，則本發明的產低溫乳糖酶菌的菌落呈藍色。

實施例2：產低溫乳糖酶嗜冷桿菌(cryobacteriumsp.)菌株lw097的發酵培養

將本發明的產低溫乳糖酶嗜冷桿菌(cryobacteriumsp.)菌株lw097接入種子培養基：乳糖10g，酵母浸膏10g，nacl4g，胰蛋白胨5g，蒸餾水1000ml，ph7.0，16℃培養4～5天；然后，以5％接種量接種于如下發酵培養基中。乳糖40g，磷酸二氫鉀0.05g，胰蛋白胨15g，氯化鈣0.11g，酵母浸膏5g，硫酸錳0.001g，硫酸鎂0.3g，硫酸亞鐵0.03g，ph7.0，250ml三角瓶中，每瓶裝50ml，1.0kg/cm2蒸汽滅菌15分鐘。16℃，200轉/分鐘下振蕩培養56h。培養后，離心分離收集菌體，～70℃和50℃反復凍融后，離心分離收集上清獲得低溫乳糖酶粗酶液，其產酶量可達6u/ml。向所得的低溫乳糖酶液中加入硫酸銨，使其飽和度達到60％，靜置沉淀，得到部分沉淀物，再以透析袋透析脫鹽，所得低溫乳糖酶的酶活力可達38u/ml。

實施例3：低溫乳糖酶酶活性的測定方法

采用比色測定法進行低溫乳糖酶活力的測定。以鄰硝基苯～β～d～半乳糖苷(onpg)為作用底物，以單位體積的單位酶液在單位時間內其酶解產物鄰硝基苯酚(onp)的生成量進行酶活力的計算。

酶活定義：在一定的條件下，1min水解onpg生成1μmolonp定義為1個酶活單位。根據標準曲線和420nm測定的od值計算onp含量。在上述條件下，1min水解onpg生成1μmolonp定義為1個酶活單位。具體方法如下：

a：onp標準曲線的繪制：取onp139.0mg(鄰硝基酚)標準品放入100ml容量瓶中，加95％乙醇10ml使之溶解，再用ph7.0的磷酸緩沖液定容至1000ml，配制成1mmol·l～1onp母液，分別吸取該溶液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml、12ml、14ml，分別加入到100ml的容量瓶中，用ph7.0的磷酸緩沖液定容后混勻，上述稀釋液每毫升分別含onp0.02μmol、0.04μmol、0.06μmol、0.08μmol、0.10μmol、0.12μmol、0.14μmol，以ph7.0的磷酸緩沖液為空白，在波長420nm處測吸光度，以吸光度值為縱坐標，以onp濃度為橫坐標繪制標準曲線，見圖7。

b：乳糖酶活性的測定：在微孔板中，向每孔加入含4mg/ml的50.0μl底物onpg(溶于0.1m磷酸緩沖液，ph7.0)的溶液a和50.0μl粗酶液，15℃下保溫15min后，加入200.0μl0.5m預冷碳酸鈉終止反應，產物鄰硝基苯酚(o～nitrophenyl，onp)在堿性環境下，顯黃色，于420nm波長處測定吸光值。測定酶活時，粗酶液用0.1m磷酸緩沖液適量稀釋，使od420值在0～0.8的線性范圍內)

c：酶活力的計算按如下公式：

e：酶活力值(u/ml)；od420：420nm波長處測定的吸光值；n：粗酶液稀釋倍數；t：粗酶液與底物反應的時間。

實施例4：作用ph對低溫乳糖酶酶活力的影響

作用ph和最佳ph測定，以onpg為底物，按前述的低溫乳糖酶活性測試方法進行測定。測定的ph分別為3～10范圍內的不同ph值條件下的酶活力e。以測定酶活力最高的ph下酶活值為對照，設定其相對酶活力100％，則作用ph與酶活性的關系如圖2所示。本發明菌株lw097產生的低溫乳糖酶在30℃下其最適酶解ph為6.0，在ph6～8范圍內可保持較高的酶活性。

實施例5：作用溫度對低溫乳糖酶酶活力的影響

作用ph和最佳ph測定，以onpg為底物，按前述的低溫乳糖酶活性測試方法進行測定。測定溫度范圍為5℃～60℃的不同溫度。以測定酶活力最高的溫度下的酶活值為對照，設定其相對酶活力100％，則作用溫度與酶活性的關系如圖3所示。在5℃～60℃的溫度范圍內，本發明菌株lw097產生的低溫乳糖酶均呈現酶活性，其最佳酶解溫度為30℃左右。在10～30℃的測定溫度范圍內具有良好的酶學特性，在20℃下可保持70％左右的相對酶活力、10℃下仍可保持60％以上的相對酶活力。

實施例6：低溫乳糖酶的熱穩定性

將實施例2得到的低溫乳糖酶液在30℃、ph6.0條件下保溫，然后按實施例3所述酶活性測定方法每隔20分鐘對其殘余酶活力進行測定。以未進行保溫處理的酶活力值未對照，設定其相對酶活力為100％，則此時的處理溫度和殘余活性的關系如圖4所示。本發明菌株lw097所產生的低溫乳糖酶在30℃以下具有較好的熱穩定性，30℃保溫120分鐘仍可保持60％左右的相對酶活力，具有較高的熱穩定性。

實施例7：低溫乳糖酶的ph穩定性

將實施例2所得的低溫乳糖酶粗酶液按1：1的比例分別與ph2～11的緩沖液混合，在4℃下保溫12h，然后將酶液調回到最適作用ph值(ph6.0)，在30℃下測定殘余酶活。以ph6.0下的酶活力測定值為對照，設定其相對酶活力為100％，此時的處理ph和殘余活性的關系如圖5所示。本發明菌株lw097所產生的低溫乳糖酶在ph6.0～ph8.0的范圍內保持穩定。

實施例8：金屬離子對低溫乳糖酶酶活力的影響作用

金屬離子對低溫乳糖酶的影響作用按上述酶活性測定法，在ph6.0的磷酸鹽緩沖液中添加ca2+、zn2+、cu2+、mn2+、mg2+、na+、k+、fe2+和fe3+，使其終濃度達到10mm。按實施例3所述酶活性測定方法進行測定。以未加入金屬離子的為對照，設定其相對酶活力為100％，則金屬離子對酶活力的影響作用如圖6所示。其中k+對其酶學活性有一定的激活作用，cu2+、fe2+對其酶學活性有顯著的抑制作用，ca2+、zn2+、mn2+、mg2+、na+和fe3+對其酶學活性影響較小。

實施例9：一種低溫乳糖酶的生產方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、菌種活化：對權利要求1中所述的嗜冷桿菌新菌株cryobacteriumsp.lw097進行菌種活化培養，得到種子培養液；

b、產酶發酵：利用步驟a獲得的活化菌種進行產酶發酵培養，即可得到低溫乳糖酶。

a步驟中使用培養基a，所述培養基a按照質量體積比配得，乳糖1％～2％，酵母浸膏1％～2％，nacl0.5％～1％，胰蛋白胨0.5％～1％，蒸餾水溶解調整ph至6.8～7.2；活化培養的溫度為15～20℃，培養4～5天，制得活化的種子培養液。

將a步驟制得的種子培養液按照5～15％接種量接種于如下發酵培養基b中，培養基b按照質量體積比配得，乳糖1％～4％，胰蛋白胨4％～5％，酵母浸膏1％～2％，硫酸鎂0.03％～0.3％，磷酸二氫鉀0.003％～0.007％，氯化鈣0.009％～0.013％，硫酸錳0.0001％～0.0002％，硫酸亞鐵0.002％～0.005％，余量的水，ph為6.5～7.5，滅菌后，在16℃，150～300轉/分鐘下振蕩培養56h～60h，培養后，離心分離收集菌體，～70℃和50℃反復凍融3～5次后，離心分離收集上清獲得低溫乳糖酶粗酶液，該粗酶液產酶量可達5u/ml。

向所得的低溫乳糖酶粗酶液中加入硫酸銨，使其飽和度達到60％以上，靜置得到沉淀，將得到的沉淀加入ph7.2～7.4的pbs磷酸鹽緩沖液中，磷酸鹽緩沖液溶解沉淀后，再以透析袋透析脫鹽，所得低溫乳糖酶的酶活力可達38u/ml。

<110>石河子大學

<120>一種產乳糖酶的嗜冷桿菌菌株及使用該菌株制備低溫乳糖酶的方法

<141>

<160>5

<210>1

<211>1487

<212>核苷酸序列

<213>嗜冷桿菌（cryobacteriumsp.lw097）

<220>

<221>misc_feature

<223>16srrna基因核苷酸序列

<400>1

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<210>2

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<220>

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<223>b-gal322乳糖酶基因核苷酸序列

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<212>核苷酸序列

<213>b-gal435乳糖酶基因

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<221>misc_feature

<223>b-gal435乳糖酶基因核苷酸序列

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atgagcgccgtgagcacggtctcgaccaacgagcatcgctgggtgcgctggcccgaggcgcacaccctcgccgacggcaccgagagcctgcccgccgacgccgcccgcatcggctacggcgccgactacaaccccgaacagtggcccgaagaggtctgggccgaagacatgcgcctgatgcgcgaggccggtgtcaacatcgtcagcgtcggcatcttctcctgggcgctgctgcagcccaccccggacagctgggatttcggttggctcgaccgcgccatcgatctgctgcacgccaacggcatcgccgtcgacctggccaccgccaccgccagcccgccgccgtggctcaccgagctgcacccggaggtgctgccggtgaaccgggtcggcgaaaccatctggcccggcggccgccagcagtggcgccccacctcaccggtgttccgccgctacgcgctggccctggtcgagaaaatggccgagcgctacgccaaccacccggccctgtcgatgtggcacatcagcaacgagctcggctgccacaacgtctacgacttctcggacgacgcggcagcggcgttccgcgcctggctcgaggcccgctacggcactctcaccgaactcaaccgggcctggggcaccgccttctggtcgcagaactacacctcctggaaccagatcctgccgccgcggctggccgcgacgcatccgaaccccacccagcagctcgacttcgcccggttctcgagcgacgccctcaagggctacctcgtcgccgagcgggagatcctgcgccagatcacgcccgacgtgccgatcaccaccaacttcatggtgatgggcgagtcccgcggcatggactacgccgactgggccggcgagatcgacctggtctccaacgaccactacctgctcgtggccgaccccgccgcgttcgaggagctgtcgttctcggccaacctcaccggccagatatccggccgggcgccgtggttcctgatggagcactccaccagcgccgtcaactggcagccggtgaaccaggccaaaacccccggccagctgcgccgggacagcctcacccacctggcccacggcgccgacgcgatctgcttcttccagtggcgccagtccttggccggcgccgagaagttccactccgcgatgctcccgcacgcgggggagaacagctcggtgttccgcagcgtcacccgcttcggcggcgaactcgcttccctggcagaggtcgccggcagccgcaccaagcaggcccgcatcggaatcctcttcgactgggactcctggtgggcctccgaactcgactcgcaccccaccgagctgctgcgctacaaggccgaggccatggcctggtacaccgccgcgctcaccattggcctgcaggccgacattgtgccggcccggtcggtgctgaacggtcacggcctcgccgggtacgacctcgtcatcgcgccgatgctctacatagtgccgcagccgctggcggatgccctggccgactacgcccgcaccggcggccacctggtggtcggcgtgttctccggcattgccgacgccgacgaccacatccaccccggcggttaccccggcgcgttccgcgagctgctcggcgtgcgcgccgaggagttcggcggcctgcagccgggccagaccgtcggcctgtccggcgacctgccggccgggtcaaccgggtcgctgctcacccacgacgtcaccgtggcctccgatgtccaggtgctcgcccgcttccaggacggcccgttccccggtgtgccggcggtgaccagccgcgtggtctcgaccgagtccggcggccgggccagcttcgtcgccacggtcctcgaccccgacgcgttggtggctttggtcggccggttcgccgccgccgcccacatcgtctcgccgctgccgagagacgcgcacggcatcgtgcagctcgccgtgcgccagtccgacgacatggactatctcttctacatcaaccactccgacaaggccgtgaccgtgccgctgggcaaggccgatggcacgctcgtggccgtcgacctcggcggcagcaccctcgccgcggactcgctcaccctcccggccaccggcgtcgccgtgctcggccgcgcccgaacggcggcctga

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<212>核苷酸序列

<213>b-gal2567乳糖酶基因

<220>

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<223>b-gal2567乳糖酶基因核苷酸序列

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<210>5

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<212>核苷酸序列

<213>b-gal436乳糖酶基因

<220>

<221>misc_feature

<223>b-gal436乳糖酶基因核苷酸序列

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