專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲和種仁無酚棉花的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲和種仁無酚棉花的培育方法，屬棉花遺傳改良與生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
棉花是重要的纖維作物和經(jīng)濟(jì)作物。在收獲產(chǎn)品子棉中，皮棉占40%、種仁占 35 %、種殼占20 %、短絨占5 %。種仁除含有30 % -35 %植物油脂，還含有40 % -43 %優(yōu)質(zhì)蛋白。種仁榨油后的棉仁粉中，蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%以上，且富含人體必需的8種氨基酸，其蛋白含量和營養(yǎng)組成超過水稻、小麥、玉米和花生等子粒，因此種仁不僅是重要的植物油料來源，而且是世界上僅次于大豆的植物蛋白質(zhì)資源。然而，目前我國乃至全球大面積栽培的棉花品種主要是有酚棉，其植株體內(nèi)的棉酚對棉田害蟲具有生化抗性，同時種仁中含有的棉酚(gossypol)及其衍生物，人及非反芻動物食用后會損傷其生殖、血管和神經(jīng)系統(tǒng)， 引起雄性無精子、雌性流產(chǎn)等中毒現(xiàn)象。低酚棉(low gossypol cotton)是一種植株器官中無色素腺體的棉花種質(zhì)資源，其種仁中的棉酚含量低于聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定的食用標(biāo)準(zhǔn) (0. 04% )和國家標(biāo)準(zhǔn)(0. 02% )。低酚棉種仁可直接食用或飼用，以其榨油可生產(chǎn)高品質(zhì)的食用油，無需精煉，有利于棉子的綜合利用。迄今為止，國內(nèi)外已先后鑒定出gli、gl2、gl3、 gl4、gl5、gl6等6個與腺體形成相關(guān)的基因位點(diǎn)，但僅有g(shù)l2gl3和Gl2e這兩種純合基因型表現(xiàn)為植株無腺體、種仁低酚。1959年美國McMichael從愛字棉與霍皮棉的雜交后代中首次育成由雙隱性基因(gl2gl3)控制的無腺體棉花品種23B，其植株和種子無腺體，種仁可以直接食用。隨后世界主產(chǎn)棉國以該無腺體品種作為骨干親本，通過與優(yōu)良品種的雜交或回交開展低酚棉育種。傳統(tǒng)低酚棉品種的無腺體性狀是由兩對隱性基因(gl2gl3)控制的，容易受到有酚棉的花粉污染，從而引起低酚棉品種的混雜退化。1966年埃及學(xué)者Afifi等通過 32P誘變，培育出第一個顯性低酚海島棉品種Bahtim 110，成為全球顯性低酚棉花新品種選育的重要種質(zhì)資源。遺傳研究表明，Bahtim 110無腺體性狀受1對不完全顯性基因Gl/控制。隨后埃及、美國和中國等國通過陸地棉與海島棉雜交、回交將Bahtim 110顯性無腺體性狀轉(zhuǎn)育到陸地棉中，育成一系列顯性低酚的陸地棉品種(系)。
迄今為止，低酚棉新品種的選育及其應(yīng)用已有50多年歷史，然而低酚棉的推廣應(yīng)用一直未能形成規(guī)模。究其原因在于(一)低酚棉品種皮棉產(chǎn)量水平較低，一般比當(dāng)時推廣的有酚品種減產(chǎn)5%左右；(二)棉花植株無色素腺體，缺乏對棉花害蟲的抗性；(三)雙隱性低酚性狀易受有酚品種花粉的污染，種仁食用的安全性受到威脅；(四)低酚棉子棉酚含量低，老鼠危害嚴(yán)重導(dǎo)致種子的繁殖與保存困難；(五)低酚棉種仁的油用、食用功能未能開發(fā)，其綜合利用的產(chǎn)業(yè)鏈有待培育。然而，缺乏高產(chǎn)、顯性無酚、抗蟲品種是導(dǎo)致低酚棉無市場競爭力的主要原因之一。棉花聚合育種技術(shù)的建立以及高產(chǎn)、顯性低酚陸地棉品種 (系)和高強(qiáng)纖維、轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉品種(系)的育成，為選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗蟲、無酚棉花新品種提供了技術(shù)支撐和育種親本。江蘇是經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)省份，近十年來隨著子棉收購價格的跌宕起伏，棉花種植面積不斷減少，植棉比較效益低嚴(yán)重制約著棉花生產(chǎn)的恢復(fù)和發(fā)展。江蘇3又是紡織工業(yè)大省，2007年全省棉紡織工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模和紗線、棉布產(chǎn)量均居我國紡織大省前三位。自2004年以來，江蘇省每年紡織用棉量穩(wěn)定在70萬噸以上，按照總需求量的7% 計算非紡織用棉量，全省原棉的年需求量穩(wěn)定在75萬噸以上，然而同期全省皮棉總產(chǎn)僅達(dá)到35萬噸左右，供需缺口達(dá)40萬噸以上。選育并推廣種植高產(chǎn)、抗蟲、無酚棉花新品種，通過開發(fā)無酚棉種仁的食用油、食品和保健品功能，大幅度地增加植棉效益，從而提高棉農(nóng)的植棉積極性，確保我國糧食、原棉和食用油的供給安全。因此，發(fā)明一種高效的Bt抗蟲基因、GV顯性低酚基因的轉(zhuǎn)育、鑒定與選擇方法，聚合抗蟲、低酚、高產(chǎn)、高強(qiáng)纖維、抗病基因于一體，是本發(fā)明的宗旨。發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于針對棉花生產(chǎn)實(shí)踐中低酚品種易受有酚品種的花粉污染、缺乏對棉田害蟲和老鼠的抗性問題，通過遺傳改良途徑，采用有性雜交并結(jié)合標(biāo)記性狀的輔助選擇，聚合抗蟲、低酚、高產(chǎn)、高強(qiáng)纖維、抗病等優(yōu)良性狀，培育轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲、顯性低酚棉花新品種，開發(fā)利用低酚棉種仁的油用、食用功能，提高植棉經(jīng)濟(jì)效益，為棉花成功轉(zhuǎn)變?yōu)榧Z、棉、油兼用型農(nóng)作物提供品種支撐。
技術(shù)方案
本發(fā)明的內(nèi)容是一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲、種仁無酚棉花的培育方法，其特征在于
1)選用無腺體基因型為Gl2eGl/的高產(chǎn)低酚棉花品種湘棉18號為母本(早)與高強(qiáng)力纖維、抗棉鈴蟲品系蘇76149為父本(3)雜交配組；
2)種植F1群體，成熟期全部單株混收獲得F2 ；
3)種植F2、F3、F4，群體種植規(guī)模大于300株，三葉期通過對棉苗器官(主莖、子葉、真葉和葉柄)表面有、無色素腺體的鑒定，拔除有腺體棉苗，選擇無腺體棉苗；六葉期在幼嫩真葉表面用毛筆點(diǎn)涂2000ppm卡那霉素溶液，一周后觀察葉面是否出現(xiàn)黃白斑，淘汰呈現(xiàn)失綠斑的感卡那霉素植株，保留表現(xiàn)正常綠色的抗卡那霉素植株，成熟后全部單株混收；
4)在種植密度36，000株/公頃條件下，F(xiàn)5開始選擇單株結(jié)鈴數(shù)25個以上、平均鈴重> 5. 2克、衣分> 39%、抗卡那霉素的無腺體單株；
5)種植F6-F7各世代株系，以感蟲有酚品種蘇棉22號為對照
室內(nèi)棉鈴蟲抗性鑒定。
鑒于田間抗性鑒定易受環(huán)境條件的影響，抗蟲性鑒定采取室內(nèi)幼嫩葉片接蟲法。 于棉花蕾期在每個待鑒株系和對照品種群體中隨機(jī)采回20張主莖嫩葉(每株最多采1 片)，每培養(yǎng)皿放2張嫩葉，用脫脂棉包緊葉柄基部保濕，向每個培養(yǎng)皿中接齡期相同的棉鈴蟲低齡幼蟲6頭，7 后觀察統(tǒng)計死蟲數(shù)、活蟲數(shù)、活蟲齡期及葉片被害程度等。
參照束春娥等1997年制定的標(biāo)準(zhǔn)，將葉片被害程度分成3個等級，I級受害呈針頭狀不成片；II級受害成小片，不超過葉面積的1/4 ；III級被害成片，超過葉面積的 1/4。
將抗蟲性分成3個等級，高抗幼蟲校正死亡率> 80%，葉片被害成I級；中抗 幼蟲校正死亡率60%-79%,葉片被害成11級；低抗幼蟲校正死亡率< 59%，葉片被害成III級。測定中，若對照組幼蟲死亡率> 20%，則必須重新測定。
校正死亡率(％)=處理死亡笟二亡率χ ιοο% V , 100-對照死亡率
選擇抗性等級達(dá)到高抗、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的株系。
種仁棉酚含量檢測。
成熟期收獲植株無腺體、高抗棉鈴蟲株系子棉，自然曬干后軋花獲得棉子。采用夾鉗分離棉子殼和種仁，采用“飼料中游離棉酚的測定方法”(國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T13086-1991)檢測入選株系和對照品種的種仁游離棉酚含量。選擇棉酚含量低于無酚棉閾值0. 0004%的株系，即為所獲得的轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲、種仁無酚棉花的品系。
結(jié)合大田棉鈴蟲自然發(fā)生抗性篩選結(jié)果，在種植密度36，000株/公頃條件下， F6開始僅在腺體基因型Gl2eGl2e、高抗棉鈴蟲的小區(qū)選擇單株結(jié)鈴數(shù)25個以上、平均鈴重彡5. 2克、衣分彡39%，且纖維長度彡29mm,比強(qiáng)度彡28c N/tex、馬克隆值3. 7-4. 8的單株，獲得抗蟲、種仁無酚新品系“蘇研606”，其株高95-lOOcm，單株結(jié)鈴數(shù)25. 8-27. 2個，鈴重5. 4-5. 6克，衣分40. 77% ；纖維長度29. 70mm、比強(qiáng)度30. 6c N/tex、馬克隆值4. 5 ；種仁游離棉酚含量0. 000197%，達(dá)到無酚棉標(biāo)準(zhǔn)。
有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果是
采用高產(chǎn)、顯性低酚棉花品種湘棉18號作為親本之一，育成的抗蟲、無酚棉花新品種，其種仁無酚性狀受1對顯性基因Gl/控制。棉花屬蟲媒花，2對隱性基因gl2gl3控制的低酚棉品種，如果蜜蜂等昆蟲在開花期將有酚品種花粉帶到低酚品種柱頭上，當(dāng)代一部分棉子種仁表現(xiàn)有酚，種仁的食用安全性受到影響，隨即失去利用價值。而1對顯性基因 Gl/控制的低酚棉品種即使受蜜蜂自然傳粉的影響，當(dāng)代棉子種仁仍然表現(xiàn)無酚，克服了雙隱性低酚棉品種易受生物學(xué)混雜的弊端。
本發(fā)明在育種的低世代(F2 F4)群體中，分別采用與轉(zhuǎn)Bt基因抗棉鈴蟲、種仁無酚密切相關(guān)的標(biāo)記性狀抗卡那霉素、植株無腺體進(jìn)行間接選擇，結(jié)合南繁加代，能夠大幅度地提高選擇效率，縮短育種年限。而在育種的高世代(F6 F7)群體中，對基因型已經(jīng)純合的兩個目標(biāo)性狀轉(zhuǎn)Bt基因抗棉鈴蟲、種仁無酚直接進(jìn)行性狀鑒定，能夠集中精力對少量的株系開展自交純合、鑒定與選擇，實(shí)現(xiàn)育種效果的事半而功倍。
本發(fā)明方法育成的新品種聚合了雜交親本雙方的高強(qiáng)纖維、高產(chǎn)、抗棉鈴蟲、種仁無酚、抗病等特性，通過無酚種仁油用、食用和保健用功能的開發(fā)以及農(nóng)藥使用量的減少， 能夠大幅度地提高植棉經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民增收，在廣大棉區(qū)具有廣闊的應(yīng)用前旦ο


圖1收獲期抗蟲、無酚新品系蘇研606 (右)和感蟲、有酚品種蘇棉22號(左)種仁縱剖面電鏡視野中色素腺體(黑點(diǎn))分布比較。
圖2蘇研606選育過程具體實(shí)施方式
選擇親本
湘棉18號[張雪林，金林，曾昭云等.湘棉18號的選育初報，中國棉花，2000， 27 (10) 18-19]，高產(chǎn)、顯性低酚棉花品種，湖南省棉花研究所1995年育成，2000年通過湖南省品種審定定名。該品種全生育期123天，在種植密度36，000株/公頃條件下，株高 100-105cm,單株結(jié)鈴24. 5-26. 2個，單鈴重5. 7克，衣分42. 48 %。纖維上半部平均長度 28. 3mm，斷裂比強(qiáng)度29. 3cN/tex，馬克隆值5. 1。種仁游離棉酚含量0. 00304%，低于國家食用標(biāo)準(zhǔn)0. 02%，屬低酚棉類型。
蘇76149[吳巧娟，肖松華，劉劍光等.高品質(zhì)抗蟲棉花新種質(zhì)的培育，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008 (6) :42-44]，高強(qiáng)力纖維、抗棉鈴蟲棉花品系，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所2004年育成并定名。該品系全生育期135天，在種植密度36，000株/公頃條件下，株高95-lOOcm，單株結(jié)鈴21. 6-23. 8個，單鈴重6. 4克，衣分34. 89%。纖維上半部平均長度 32. 6mm,斷裂比強(qiáng)度40. OcN/tex,馬克隆值4. 2。棉鈴蟲幼蟲校正死亡率86. 05%,葉片被害成I級，高抗棉鈴蟲。種仁游離棉酚含量0. 35608%，高于國家食用標(biāo)準(zhǔn)0. 02%，屬有酚棉類型。
品種選育
2005年夏季在南京選用高產(chǎn)、低酚棉花品種湘棉18號為母本(早)與自育的高強(qiáng)力纖維、抗棉鈴蟲品系蘇76149為父本(3)雜交配組。當(dāng)年冬季在海南省三亞市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所野生棉種植園種植K。2006年春季在南京、當(dāng)年冬季在三亞、2007年春季在南京分別種植F2、F3、F4，群體規(guī)模大于300株，三葉期通過對棉苗器官(主莖、子葉、真葉和葉柄)表面有、無色素腺體的鑒定，拔除有腺體棉苗，選擇無腺體棉苗；六葉期在幼嫩真葉表面用毛筆點(diǎn)涂2000ppm卡那霉素溶液，一周后觀察葉面是否出現(xiàn)黃白斑，淘汰呈現(xiàn)失綠斑的感卡那霉素植株，保留表現(xiàn)正常綠色的抗卡那霉素植株，成熟后全部單株混收。2007 年冬季在三亞種植F5,群體規(guī)模300株以上，在種植密度36，000株/公頃條件下，成熟期選擇單株結(jié)鈴數(shù)25個以上、平均鈴重> 5. 2克、衣分> 39%、抗卡那霉素的無腺體單株56個； 單株皮棉樣品采用HVI900系列纖維品質(zhì)測定儀測定纖維品質(zhì)指標(biāo)，按照纖維長度> 29mm, 比強(qiáng)度> 28c N/tex、馬克隆值3. 7-4. 8的要求，決選獲得15個高強(qiáng)纖維、高產(chǎn)、抗卡那霉素、無腺體單株。2008年春季在南京、當(dāng)年冬季在三亞分別種植F6-F7株系，并以感蟲、有酚品種蘇棉22號(蘇審棉200204)作為對照。
室內(nèi)棉鈴蟲抗性鑒定抗蟲性鑒定采取室內(nèi)幼嫩葉片接蟲法，于棉花蕾期在每個待鑒株系和對照品種群體中隨機(jī)采回20張主莖嫩葉，每株最多采1片，每培養(yǎng)皿放2張嫩葉，用脫脂棉包緊葉柄基部保濕，向每個培養(yǎng)皿中接齡期相同的棉鈴蟲低齡幼蟲6頭，7 后觀察統(tǒng)計死蟲數(shù)、活蟲數(shù)、活蟲齡期及葉片被害程度；參照束春娥等1997年制定的標(biāo)準(zhǔn)， 將葉片被害程度分成3個等級，I級受害呈針頭狀不成片；II級受害成小片，不超過葉面積的1/4 ；III級被害成片，超過葉面積的1/4 ；將抗蟲性分成3個等級，高抗幼蟲校正死亡率> 80%，葉片被害成I級；中抗幼蟲校正死亡率60% -79%，葉片被害成II級；低抗 幼蟲校正死亡率< 59%，葉片被害成III級，測定中，若對照組幼蟲死亡率> 20%，則必須重新測定，選擇抗性等級達(dá)到高抗株系
6校正死亡種/。)=處理死亡亡率χ畫100-對照死亡率
種仁棉酚含量檢測成熟期收獲高抗棉鈴蟲的植株無腺體株系子棉，自然曬干后軋花獲得棉子，采用夾鉗分離棉子殼和種仁，采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T13086-1991“飼料中游離棉酚的測定方法”檢測入選株系和對照品種的種仁游離棉酚含量，選擇棉酚含量低于無酚棉閾值0. 0004%的株系，獲得轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲、種仁無酚棉花的新品系6個。
2009年春季以抗蟲、無酚新品系和蘇棉22號為供試材料，在江蘇省徐淮、沿海、沿江棉區(qū)進(jìn)行多點(diǎn)試驗，通過對產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、抗蟲、抗病和種仁棉酚含量等性狀的鑒定，獲得高強(qiáng)纖維、高產(chǎn)、抗蟲、無酚棉花優(yōu)良品系蘇研606。
通過以上方法育成的轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲、種仁無酚棉花新品系“蘇研606”，棉鈴蟲幼蟲校正死亡率89. 67 %，葉片被害成I級，高抗棉鈴蟲。種仁棉酚含量0. 000197 %，遠(yuǎn)低于國家食用標(biāo)準(zhǔn)0. 02%，達(dá)到無酚棉標(biāo)準(zhǔn)。在種植密度36，000株/公頃條件下，株高95-lOOcm， 單株結(jié)鈴數(shù)25. 8-27. 2個，鈴重5. 4-5. 6克，衣分40. 77% ；纖維上半部平均長度29. 70mm、 斷裂比強(qiáng)度30. 6c N/tex、馬克隆值4. 5。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲和種仁無酚棉花的培育方法，其特征在于1)選用無腺體基因型為G1/GV的高產(chǎn)、低酚棉花品種湘棉18號為母本早，與高強(qiáng)力纖維、抗棉鈴蟲品系蘇76149為父本J雜交配組；2)種植F1群體，成熟期全部單株混收獲得F2；3)種植F2、F3、F4，群體種植規(guī)模大于300株，三葉期通過對棉苗器官主莖、子葉、真葉和葉柄表面有、無色素腺體的鑒定，拔除有腺體棉苗，選擇無腺體棉苗；六葉期在幼嫩真葉表面用毛筆點(diǎn)涂2000ppm卡那霉素溶液，一周后觀察葉面是否出現(xiàn)黃白斑，淘汰呈現(xiàn)失綠斑的感卡那霉素植株，保留表現(xiàn)正常綠色的抗卡那霉素植株，成熟后全部單株混收；4)在種植密度36，000株/公頃條件下，F(xiàn)5選擇單株結(jié)鈴數(shù)25個以上、平均鈴重>5. 2 克、衣分> 39%、抗卡那霉素的無腺體單株；5)種植F6-F7各世代株系，以感蟲有酚品種蘇棉22號為對照室內(nèi)棉鈴蟲抗性鑒定抗蟲性鑒定采取室內(nèi)幼嫩葉片接蟲法，于棉花蕾期在每個待鑒株系和對照品種群體中隨機(jī)采回20張主莖嫩葉，每株最多采1片，每培養(yǎng)皿放2張嫩葉，用脫脂棉包緊葉柄基部保濕，向每個培養(yǎng)皿中接齡期相同的棉鈴蟲低齡幼蟲6頭，72h后觀察統(tǒng)計死蟲數(shù)、活蟲數(shù)、活蟲齡期及葉片被害程度；參照束春娥等1997年制定的標(biāo)準(zhǔn)，將葉片被害程度分成3個等級，I級受害呈針頭狀不成片；II級受害成小片，不超過葉面積的1/4 ；III級被害成片，超過葉面積的1/4 ；將抗蟲性分成3個等級，高抗幼蟲校正死亡率> 80%，葉片被害成I級；中抗幼蟲校正死亡率60% -79%，葉片被害成II級；低抗幼蟲校正死亡率< 59%，葉片被害成III 級校正死亡率(％)=處理死亡f=，亡率X100%100-對照死亡率選擇抗性等級達(dá)到高抗的株系；種仁棉酚含量檢測成熟期收獲植株無腺體、高抗棉鈴蟲株系子棉，獲得棉子，采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/ T13086-1991 “飼料中游離棉酚的測定方法”檢測入選株系種仁游離棉酚含量，選擇棉酚含量低于無酚棉閾值0. 0004%的株系，即為所獲得的轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲、種仁無酚棉花的品系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在種植密度36，000株/公頃條件下，F(xiàn)5同時選擇結(jié)鈴數(shù)25個以上、平均鈴重> 5. 2克、 衣分彡39%、纖維長度彡29mm,比強(qiáng)度彡28c N/tex、馬克隆值3. 7-4. 8、抗卡那霉素的無腺體單株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲和種仁無酚棉花的育種方法，屬于棉花育種領(lǐng)域。選用無腺體基因型為Gl2eGl2e的高產(chǎn)、低酚棉花品種湘棉18號為母本♀與高強(qiáng)力纖維、抗棉鈴蟲品系蘇76149為父本♂雜交配組獲得。本發(fā)明能夠快速聚合高強(qiáng)纖維、高產(chǎn)、抗病與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲、顯性無酚性狀，顯著地提高了選擇效率，縮短育種年限。育成棉花新品種不僅對棉鈴蟲、老鼠表現(xiàn)穩(wěn)定抗性，減少棉鈴蟲防治用藥2~3次，降低生產(chǎn)成本，棉種貯運(yùn)安全可靠；因不含棉酚及其類似物，種仁可作為人類食用油、食品和保健品的加工原料，每畝可為棉農(nóng)增加經(jīng)濟(jì)收入1750元，在我國廣大棉區(qū)具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號A01H1/02GK102499060SQ201110340099
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者劉劍光, 吳巧娟, 狄佳春, 肖松華, 許乃銀, 趙君, 陳旭升, 馬曉杰 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院