專利名稱：無菌培養黃粉蟲的方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種無菌培養黃粉蟲的方法。
背景技術：
黃粉蟲(Tenebrio moIitor L.)分類上屬鞘翅目、擬步行甲科、擬步甲族、擬步甲屬。它是一種大型倉貯害蟲，同時又是一種極具開發潛力的資源昆蟲。該蟲主要用作禽類和其它一些特種經濟動物(蝎子、蛤蚧、牛蛙、林蛙、鱉、蝎、蛇、蜈蚣、觀賞魚及鳥類等)的飼料，同時也用于開發保健食品或藥品(白耀宇，程家安，昆蟲知識，2003，40 (4):317-322)。黃粉蟲食性雜、食物來源廣、生活力強、易于人工飼養，作為病原真菌的誘捕昆蟲是一種理想的材料。賈春生等利用黃粉蟲分離土壤昆蟲病原真菌(賈春生，由士江，高文韜，昆蟲知識,2006，43 (2):260-261)，結果昆蟲病原真菌的總檢出率優于用大蠟螟誘集方法誘捕昆蟲病原真菌；李會平等用黃粉蟲誘集法分離球孢白僵菌(李會平，黃大莊，王曉紅，鄭建偉，蠶業科學，2006，32 (3):320-323)，也取得較好的效果。使用敏感昆蟲誘獲土壤中的昆蟲病原真菌，較容易得到致病性強的生防菌。但這種方法常常會受到供試昆蟲供給的制約。在利用黃粉蟲誘捕土壤病原真菌的實踐中，黃粉蟲自身攜帶病菌，也會導致黃粉蟲死亡，從而干擾了實驗的準確性。為避免黃粉蟲自身致病死亡，需要消除黃粉蟲自身攜帶的病菌。本發明采用無菌培養黃粉蟲的方法，構建無菌黃粉蟲材料，可應用到黃粉蟲生活史各個階段無菌材料的取材要求實驗中。

發明內容
本發明提供了一種無菌培養黃粉蟲的方法。該方法的操作步驟如下:(I)初代黃粉蟲材料的處理:選取生長健壯的黃粉蟲幼蟲，用無菌水進行表面清洗3次，用無菌濾紙片吸干蟲體上的水分，在75%消毒酒精中消毒5-15秒鐘，在無菌濾紙片上揮干酒精，處理好的幼蟲作為初代材料。(2)無菌麩皮培養基制備:取30g麩皮裝在500ml罐頭瓶內，封好瓶口，于0.llMPa，121°C滅菌 60min，冷卻備用。(3)黃粉蟲無菌培養:將步驟(I)中制備好的初代黃粉蟲按每瓶10只的量分別置于步驟(2)的無菌麩皮培養基罐頭瓶中，15-25°C培養至幼蟲化蛹。將蛹無菌操作轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，待蛹羽化后再轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，交配后的成蟲轉移至無菌鐵絲網篩內，篩子下面放一張無菌紙，收集成蟲產下的卵即為子一代卵。子一代卵置于無菌麩皮培養基中繼續培養至成蟲，篩選無菌蟲體，用同樣的方法產卵，為子二代卵。如此逐代稀釋，子二代卵培養至成蟲，檢測到的無菌率達90% ;子三代卵培養至成蟲，檢測到的的無菌率達95%;子四代卵培養至成蟲， 檢測到的的無菌率達100%。得到的無菌蟲體可以根據實驗需要，繼續培養至實驗需要的蟲齡。
(4)無菌成蟲的檢測和數量統計:將無菌培養的剛羽化的黃粉蟲成蟲分別無菌操作轉移至含水量50%的無菌新鮮麩皮培養基中，25°C培養10天，無微生物生長起來的蟲體為無菌。統計無菌成蟲數量，計算無菌率。本發明的關鍵點在于:黃粉蟲幼蟲消毒要充分，但需要控制好消毒時間，避免時間過長，將幼蟲殺死；培養溫度會影響黃粉蟲生長，適宜的培養溫度，能獲得健壯的黃粉蟲材料；無菌的獲得是通過飼養培養基的無菌和產卵條件的無菌，不斷稀釋蟲體本身所帶菌，所以培養、繼代、產卵的過程無菌操作要嚴格。以上關鍵點如能把握好，可以獲得健康無菌的黃粉蟲子代卵。本發明操作簡便，效果良好，可應用到無菌培養黃粉蟲生活史各個階段取材的實驗中。
具體實施方式
以下實例用于說明本發明，但不是對本發明的限制。實施例1:(I)初代黃粉蟲材料的處理:選取生長健壯的黃粉蟲幼蟲，用無菌水進行表面清洗3次，立即用無菌濾紙片吸干蟲體上的水分，在75%消毒酒精中消毒5秒鐘，在無菌濾紙片上揮干酒精，處理好的幼蟲作為父代材料。(2)無菌麩皮培養基制備:取30g麩皮裝在500ml罐頭瓶內，封好瓶口，于0.llMPa，121°C滅菌 60min，冷卻備用。(3)黃粉蟲無菌培養:將制備好的初代黃粉蟲按每瓶10只的量分別置于無菌麩皮培養基罐頭瓶中，15°C培養至幼蟲化蛹。將蛹無菌操作轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，待蛹羽化后再轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，交配后的成蟲轉移至無菌鐵絲網篩內，篩子下面放一張無菌紙，收集成蟲產下的卵即為子一代卵。子一代卵，置于無菌麩皮培養基中，培養至實驗需要的蟲齡。(4)統計無菌成蟲的得率為60%，比只經過無菌水蟲體表面處理的對照組得率提高 44%。實施例2:(I)初代黃粉蟲材料的處理:選取生長健壯的黃粉蟲幼蟲，用無菌水進行表面清洗3次，立即用無菌濾紙片吸干蟲體上的水分，在75%消毒酒精中消毒10秒鐘，在無菌濾紙片上揮干酒精，處理好的幼蟲作為父代材料。(2)無菌麩皮培養基制備:取30g麩皮裝在500ml罐頭瓶內，封好瓶口，于0.llMPa，121°C滅菌 60min，冷卻備用。(3)黃粉蟲無菌培養:將制備好的初代黃粉蟲按每瓶10只的量分別置于無菌麩皮培養基罐頭瓶中，20°C培養至幼蟲化蛹。將蛹無菌操作轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，待蛹羽化后再轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，交配后的成蟲轉移至無菌鐵絲網篩內，篩子下面放一張無菌紙，收集成蟲產下的卵即為子一代卵。子一代卵，置于無菌麩皮培養基中，培養至實驗需要的蟲齡。(4)統計無菌成蟲的得率為75%，比只經過無菌水蟲體表面處理的對照組得率提聞 59 % ο
實施例3:(1)初代黃粉蟲材料的處理:選取生長健壯的黃粉蟲幼蟲，用無菌水進行表面清洗3次，立即用無菌濾紙片吸干蟲體上的水分，在75%消毒酒精中消毒15秒鐘，在無菌濾紙片上揮干酒精，處理好的幼蟲作為初代材料。(2)無菌麩皮培養基制備:取30g麩皮裝在500ml罐頭瓶內，封好瓶口，于0.llMPa，121°C滅菌 60min，冷卻備用。(3)黃粉蟲無菌培養:將制備好的初代黃粉蟲按每瓶10只的量分別置于無菌麩皮培養基罐頭瓶中，25°C培養至幼蟲化蛹。將蛹無菌操作轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，待蛹羽化后再轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，交配后的成蟲轉移至無菌鐵絲網篩內，篩子下面放一張無菌紙，收集成蟲產下的卵即為子一代卵。子一代卵，置于無菌麩皮培養基中，培養至實驗需要的蟲齡。(4)統計無菌成蟲的得率為98%，比只經過無菌水蟲體表面處理的對照組得率提聞 82 % ο
權利要求
1.一種無菌培養黃粉蟲的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括: (1)初代黃粉蟲材料的處理:選取生長健壯的黃粉蟲幼蟲，用無菌水進行表面清洗3次，用無菌濾紙片吸干蟲體上的水分，在75%消毒酒精中消毒5-15秒鐘，在無菌濾紙片上揮干酒精，處理好的幼蟲作為父代材料。
(2)無菌麩皮培養基制備:取30g麩皮裝在500ml罐頭瓶內，封好瓶口，于0.1lMPa,121°C滅菌60min，冷卻備用。
(3)黃粉蟲無菌培養:將制備好的初代黃粉蟲按每瓶10只的量分別置于無菌麩皮培養基罐頭瓶中，15-25°C培養至幼蟲化蛹。將蛹無菌操作轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，待蛹羽化后再轉移至新鮮無菌麩皮培養基中，交配后的成蟲轉移至無菌鐵絲網篩內，篩子下面放一張無菌紙，收集成蟲產下的卵即為子一代卵。子一代卵，置于無菌麩皮培養基中，培養至實驗需要的蟲齡。
(4)無菌成蟲的檢測和數量統計:將無菌培養的剛羽化的黃粉蟲成蟲分別無菌操作轉移至含水量50%的無菌新鮮麩皮培養基中，25°C培養10天，無微生物生長起來的蟲體為無菌。統計無菌成 蟲數量 。
全文摘要
本發明涉及一種無菌培養黃粉蟲的方法。其操作步驟主要包括(1)初代黃粉蟲材料的處理；(2)無菌麩皮培養基制備；(3)黃粉蟲無菌培養；(4)無菌成蟲的檢測和數量統計。使用本發明所提出的無菌培養黃粉蟲的方法，達到蟲體不帶菌，生長健壯。本發明操作簡便，效果良好，可應用到黃粉蟲生活史各個階段無菌材料的取材要求實驗中。
文檔編號A01K67/033GK103098762SQ201110360999
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者徐玲, 陳自宏 申請人:保山學院