一種培養人臍帶間充質干細胞的方法
【專利摘要】本發明涉及一種培養人臍帶間充質干細胞的方法。它包括如下步驟：取新鮮采集的人臍帶，清洗，放入臍帶保護液中2-8℃保存備用；取浸泡在臍帶保護液中不超過48小時的人臍帶，清洗，再依次置臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500U/mL和3500-4500U/mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50U注射用兩性霉素B的甲硝唑注射液中進行浸洗，最后再清洗后置于一次性無菌培養皿中進行備用，然后分離，培養至細胞融合度達80-90%即得。本發明能避免動物血清及動物來源的試劑帶來的潛在的危險性；48小時內均可用于臍帶間充質干細胞的培養，可操作性強；可大大減少因霉菌、厭氧菌污染造成的間充質干細胞分離培養不合格的幾率。
【專利說明】一種培養人胳帶間充質干細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種培養人臍帶間充質干細胞的方法。
【背景技術】
[0002]干細胞是一種未分化的細胞，有兩個基本特性，一是具有自我復制能力，二是能分化成一種以上的功能細胞，根據分化潛能的大小，干細胞一般分成三類，第一類是全能干細胞(totipotent stem cell)，其可以分化為功能一致的全能細胞，可以發育為胎兒；第二類是多潛能干細胞(pturipotent stem cel),它能夠分化為身體中的每種細胞類型,但是不能形成胎盤或胎兒發育所必需的支持組織。由于多潛能干細胞的分化潛能不是“全體”的，因此不將這種細胞稱為“全能”，而且它們不是胚胎。多潛能干細胞進一步特化為多能(multiPotent)干細胞,其專用于分化為特定功能特化的特定種系的細胞。多能干細胞能夠分化為它們所源自的組織中含有的細胞類型；例如血液干細胞只能夠分化為紅血細胞、白血細胞和血小板。胚胎干細胞(Embryonic stem cell)具有廣泛的潛能,能生成除胎盤外的機體所有的組織細胞；第三類是成體干細胞(aduit stem cell)是一種將擁有終生自我復制(identical copies)和自我更新(self-renewal)能力的未分化細胞，它分布于不同的組織，并可演變成為各種類型的資質細胞。干細胞的分類，主要分為造血干細胞及非造血干細胞。造血干細胞主導血液、免疫方面的疾病，來源例如臍帶血；非造血干細胞則以細胞分化與修復為主，可應用于中風、糖尿病、老年癡呆等再生醫學，來源有臍帶、胎盤、乳牙等。
[0003]間充質干細胞(mesenchymal stem cell MSC)是可形成多種細胞類型的多能干細胞。間充質干細胞(MSC)最早在骨髓中發現，隨后還發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。鑒于間充質干細胞具有多向分化潛能、能支持造血和促進造血干細胞植入、調節免疫以及分離培養操作簡便等特點，正日益受到人們的關注。間充質干細胞的應用范圍也越來越廣泛。目前國內外已開展了`多項臨床應用研究，主要疾病類型包括骨關節炎疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反應(GVHD)，脊髓損傷及退行性神經系統疾病和糖尿病等。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題在于提供一種培養人臍帶間充質干細胞的方法。
[0005]為解決本發明的技術問題，本發明采用的技術方案如下:
一種培養人臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于:它包括如下步驟:
(1)取新鮮采集的人臍帶，清洗，放入臍帶保護液中2-8°C保存備用，所述的臍帶保護液是在AIM-V培養基中加入青霉素鈉和硫酸鏈霉素得到的，其中青霉素鈉和硫酸鏈霉素在臍帶保護液中的終濃度分別為100-200 U/mL和100-200 U /mL ；
(2)取浸泡在臍帶保護液中不超過48小時的人臍帶，清洗，再依次置臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液中進行浸洗，最后再清洗后置于一次性無菌培養皿中進行備用；(3)將無菌清洗過的人臍帶剪成肉糜狀，加入AIM-V培養基，置分離管中用全自動組織分離器進行分離，得臍帶組織勻漿；
(4)將全自動組織分離器處理好的臍帶組織勻漿進行離心，棄上清，收集下層，置于培養瓶中，然后向其中加入無血清培養基，置于36-38°C、飽和濕度、體積分數為5%的CO2孵育箱中培養，至觀察到瓶壁上形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，則獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞混合液，然后經離心，即可獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞，再經傳代培養至細胞融合度達80-90%即得。
[0006]按上述方案，所述步驟(I)中的臍帶保護液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素預先溶解后再加入到AIM-V培養基(治療級)中得到的；所述步驟(2)中青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素按一定量加入0.9%氯化鈉注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制是將注射用兩性霉素B先用0.9%氯化鈉注射液溶解后，再和特定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人臍帶在青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗時間均為8-12min。
[0007]按上述方案，所述步驟(I)和步驟(2)中的清洗均為0.9%氯化鈉注射液清洗。
[0008]按上述方案，所述的步驟(4)為培養5-6天后，取出未貼壁的上層置另一新培養瓶中，向原培養瓶和新培養瓶中均加入無血清培養基繼續培養，并每隔3-4天換液一次，待培養10-15天后即可獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞；
然后將原培養瓶和新培養瓶中的培養基完全移出，往原培養瓶和新培養瓶中加入質量百分數為0.25%的重組動物胰蛋白酶 的磷酸鹽緩沖液浸沒貼壁細胞，放入36-38°C培養箱保溫消化7-9分鐘，當觀察到貼壁細胞圓縮，且已經脫離瓶底后，加入消化液同等體積的無血清培養基終止消化，然后轉移至離心管中，離心棄上清，吹勻沉淀在離心管底部的細胞，再根據4000-6000個細胞/cm2接種到培養瓶中，并向培養瓶中補充無血清培養基，置36-38°C、飽和濕度，體積分數為5%的CO2孵育箱中培養，每3-4天全量換液一次，至貼壁細胞彼此融合，且融合度達80-90%，即得人臍帶間充質干細胞，在有需要時，可重復上述操作進行多代細胞培養擴增。
[0009]按上述方案，所述T25培養瓶可放置不超過5g的人臍帶經全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進行培養；所述T75培養瓶可放置10-15 g的人臍帶經全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進行培養；所述T175培養瓶可放置30-35 g的人臍帶經全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進行培養；
所述T25培養瓶中需要的無血清培養基的體積為6-8mL ;所述T75培養瓶中需要的無血清培養基的體積為20-25mL ;所述T175培養瓶中需要的無血清培養基的體積為30_35mL。
[0010]人臍帶間充質干細胞的分離制備首先要求臍帶組織具有一定的活性，一般為保證臍帶組織的活性，需要對臍帶進行及時處理，而這也給實際應用帶來了障礙。本發明通過將新鮮采集的臍帶置于臍帶保護液中保存，即可達到對臍帶中殘留的微生物殺菌的作用，又能維持臍帶組織的活性的目的。使用本發明的臍帶保護液2-8°C進行保存的臍帶在48小時內均可用于出臍帶間充質干細胞的培養，這給實際制備生產帶來了極大的可操作性。
[0011]除此，本發明在對臍帶進行無菌清洗時，除使用青霉素鈉和硫酸鏈霉素的氯化鈉溶液進行無菌處理外，本發明還特別結合臍帶的自身污染特點，尤其是順產收集的人臍帶易受厭氧菌和霉菌污染的問題，特別添加了注射用兩性霉素B的甲硝唑注射液中進行無菌處理，而由此可明顯提高人臍帶間充質干細胞培養的成功率。其中，甲硝唑注射液主要可用于抗厭氧菌感染、抗滴蟲的治療，注射用兩性霉素B是多烯類抗真菌藥物，其可破壞新型隱球菌、皮炎芽生菌、組織胞漿菌、球孢子菌屬、孢子絲菌屬、念珠菌屬等真菌細胞的正常代謝從而抑制其生長。但是注射用兩性霉素B對細胞有一定的毒性，本發明經過反復實驗研究發現，通過控制兩性霉素B的濃度，可達到使其發揮作用但又不影響臍帶間充質干細胞的活性的目的。
[0012]本發明的有益效果:
(1)本發明全程使用無血清無動物來源的試劑及利用全自動組織處理器，替代傳統人臍帶間充質干細胞培養中使用的的胎牛血清、動物來源的胰蛋白酶及膠原酶，在臨床應用中能避免動物血清及動物來源的試劑帶來的潛在的危險性；
(2)采集后放入臍帶保護液，能起到保持離體組織活性的作用，使得生產制備有更強的操作性，在48小時內分離制備，仍能分離出活性好的臍帶間充質干細胞；
(3)臍帶清洗過程除使用廣譜的青鏈霉素進行無菌處理外，加入兩性霉素B和甲硝唑注射液，對分娩過程中帶有霉菌、厭氧菌的臍帶處理非常有效，可大大減少因霉菌、厭氧菌污染造成的間充質干細胞分離培養不合格的幾率。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
1.胎兒娩出后結扎，胎盤娩出前或娩出后剪臍帶約10cm，經0.9%氯化鈉注射液清洗后加入到臍帶保護液中于2-8°C保存，所述的臍帶保護液將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素分別先用少量AIM-V培養基溶解后加入到AIM-V培養基(治療級)中，其中青霉素鈉和硫酸鏈霉素在臍帶保護液中的終濃度分別為200U/mL和200U/mL。如此，將臍帶放于臍帶保護液中于2-8°C保存進行保存，可使臍帶在臍帶保護液的保護下48小時內皆可用于分離制備間充質干細胞。
[0014]2.人臍帶的無菌清洗
用無菌鑷子從臍帶保存液中取出人臍帶放入滅菌容器中，加入250mL 0.9%氯化鈉注射液，用8cm無菌鑷子將人臍帶來回震蕩漂洗一次。后再用無菌鑷子將人臍帶轉移到另一滅菌容器中，加入250mL臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素分別為3200U/mL、4000U/mL的氯化鈉溶液(濃雙抗溶液)，每隔1-2分鐘用無菌鑷子將人臍帶來回震蕩幾次，共浸洗10分鐘。再用無菌鑷子將人臍帶夾起，轉移到滅菌容器中加入每毫升含50單位注射用兩性霉素B的甲硝唑注射液，以同樣的方法浸洗10分鐘。浸洗后用8cm無菌鑷子將人臍帶夾起，再置另一滅菌容器中，加入0.9%氯化鈉注射液，并將人臍帶來回震蕩清洗三次，清洗后的人臍帶分置于一次性無菌培養皿中。
[0015]上述濃雙抗溶液為臨用前新配，具體配制方法為:取80萬單位的注射用青霉素鈉和100萬單位的注射用硫酸鏈霉素各一支加入到250mL 0.9%氯化鈉注射液中而得。
[0016]上述每毫升含50U兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制:取2.5萬單位的注射用兩性霉素B —支，加入5mL 0.9%氯化鈉注射液溶解，然后取前述溶液ImL和IOOmL甲硝唑注射液中混勻而得。
[0017]將最后清洗臍帶用的0.9%氯化鈉注射液抽取樣品并經薄膜過濾法進行微生物情況檢測，得:經14天培養樣品未見細菌、霉菌生長。
[0018]3.人臍帶干細胞的分離制備
將一次性無菌培養皿中無菌處理過的人臍帶用5cm無菌鑷子和剪刀去除其中的血管和粘膜，然后用5cm無菌剪刀剪成肉糜狀。每次取IOg置C管(全自動組織處理器配套分離管)，加入SmLAM-V培養基，經全自動組織分離器處理如在全自動組織處理器(C一01)程序下攪拌2次進行處理，然后轉移至50mL離心管中；用同樣的方法處理剩余的肉糜狀人臍帶組織，直至全部分離完所有的人臍帶組織。
[0019]將全自動組織處理器處理獲得的人臍帶勻漿在300g下離心15min，棄上清，收集下層，分別置于2個T25培養瓶中，然后向其中加入無血清培養基后，將培養瓶置36-38°C、飽和濕度、體積分數為5%的CO2孵育箱中培養。培養瓶的數量可根據處理臍帶的重量來選擇，一般T25培養瓶可約放置不超過5g的人臍帶經全自動組織分離器處理、離心后的組織。T25培養瓶加入的培養基為6-8mL。
[0020]4.人臍帶間充質干細胞原代培養
培養5天后，取上層置另一培養瓶中，然后在兩培養瓶中均加入無血清培養基繼續進行培養，并每隔3-4天換液一次，約10-15天后可用倒置顯微鏡觀察到有貼壁細胞生長，接著繼續培養，能觀察到貼壁細胞逐漸增殖成較大的細胞集落。當觀察到細胞培養瓶壁形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，即獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞混合液，再經離心，即可獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞。
[0021]5.人臍帶間充質干細胞傳代` 將培養瓶中的培養基完全移出，往培養瓶中加入質量百分數為0.25%的重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液(T25加3mL，T75加4mL，T175加6mL)，然后放入36-38°C培養箱保溫消化約7-9分鐘，在此過程中在倒置顯微鏡下觀察到貼壁細胞圓縮，且細胞已經脫離瓶底后，加入消化液同等體積的無血清培養基終止消化，然后轉移至離心管中，用雙目顯微鏡上用計數板計數及其苔盼藍染色計細胞活性。然后將離心管置300g條件下離心5min，離心后棄上清，用巴氏管輕輕吹勻沉淀在離心管底部的細胞，再根據4000-6000個細胞數/cm2接種到培養瓶中，并做好標記，向培養瓶中補充無血清培養基，置36-38°C、飽和濕度，體積分數為5%的CO2孵育箱中培養，每3-4天全量換液一次。當培養24h后，傳代細胞開始貼壁，成單個分散長條形細胞，3-4天后通過全量換液可去除未貼壁細胞，此時細胞為融合度達到50%左右的長梭形細胞。約6天后細胞基本能達到80%以上的融合，即可得間充質干細胞，然后根據需要可重復上述操作進行P2、P3、P4……傳代。
[0022]實施例2
1.胎兒娩出后結扎，胎盤娩出前或娩出后剪臍帶約10cm，經0.9%氯化鈉注射液清洗后加入到臍帶保護液中于2-8°C保存，所述的臍帶保護液為AIM-V培養基(治療級)中加入青霉素納和硫Ife鏈霉素，其中青霉素納和硫Ife鏈霉素在胳帶保護液中的終濃度分別為100U/mL和100U/mL。如此，將臍帶放于臍帶保護液中于2_8°C保存進行保存，可使臍帶在臍帶保護液的保護下48小時內皆可用于分離制備間充質干細胞。
[0023]2.人臍帶的無菌清洗用無菌鑷子從臍帶保存液中取出人臍帶放入滅菌容器中，加入0.9%氯化鈉注射液，用8cm無菌鑷子將人臍帶來回震蕩漂洗一次。后再用無菌鑷子將人臍帶轉移到另一滅菌容器中，加入臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素分別為2500U/mL、3500U/mL的氯化鈉溶液(濃雙抗溶液)，每隔1-2分鐘用無菌鑷子將人臍帶來回震蕩幾次，共浸洗8分鐘。再用無菌鑷子將人臍帶夾起，轉移到滅菌容器中加入每毫升含30U兩性霉素B的甲硝唑注射液，以同樣的方法浸洗8分鐘。浸洗后用8cm無菌鑷子將人臍帶夾起，再置另一滅菌容器中，加入0.9%氯化鈉注射液，并將人臍帶來回震蕩清洗三次，清洗后的人臍帶分置于一次性無菌培養皿中。
[0024]上述濃雙抗溶液為臨用前新配，其具體配制和每毫升含30U注射用兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制方法參考實施例1。
[0025]將最后清洗臍帶用的0.9%氯化鈉注射液抽取樣品并經薄膜過濾法進行微生物情況檢測，得:經14天培養樣品未見細菌、霉菌生長。
[0026]3.人臍帶干細胞的分離制備
將一次性無菌培養皿中無菌處理過的人臍帶用5cm無菌鑷子和剪刀去除其中的血管和粘膜，然后用5cm無菌剪刀剪成肉糜狀。每次取IOg置C管(全自動組織處理器配套分離管)，加入8mL AM-V培養基，經全自動組織分離器處理，然后轉移至50mL離心管中；用同樣的方法處理剩余的肉糜狀人臍帶組織，直至全部分離完所有的人臍帶組織。
[0027]將全自動組織處理器處理獲得的人臍帶勻漿在300g下離心15min，棄上清，收集下層，置于培養瓶中，然后向其中加入無血清培養基后，將培養瓶置36-38°C、飽和濕度、體積分數為5%的CO2孵育箱中培養。
[0028]4.人臍帶間充質干細 胞原代培養
培養5天后，取上層置另一培養瓶中，然后在兩培養瓶中均加入無血清培養基繼續進行培養，并每隔3-4天換液一次，約10-15天后可用倒置顯微鏡觀察到有貼壁細胞生長，接著繼續培養，能觀察到貼壁細胞逐漸增殖成較大的細胞集落。當觀察到細胞培養瓶壁形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，即獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞混合液，再經離心，即可獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞。
[0029]5.人臍帶間充質干細胞傳代
將培養瓶中的培養基完全移出，往培養瓶中加入質量百分數為0.25%的重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液，然后放入36-38°C培養箱保溫消化約7-9分鐘，在此過程中在倒置顯微鏡下觀察到貼壁細胞圓縮，且細胞已經脫離瓶底后，加入消化液同等體積的無血清培養基終止消化，然后轉移至離心管中，用雙目顯微鏡上用計數板計數及苔盼藍染色計細胞活性。然后將離心管置300g條件下離心5min，離心后棄上清，用巴氏管輕輕吹勻沉淀在離心管底部的細胞，再根據4000-6000個細胞數/cm2接種到培養瓶中，并做好標記，培養瓶中補充無血清培養基，置36-38°C、飽和濕度，體積分數為5%的CO2孵育箱中培養，每3-4天全量換液一次。當培養24h后，傳代細胞開始貼壁，成單個分散長條形細胞，3-4天后通過全量換液可去除未貼壁細胞，此時細胞為融合度達到50%左右的長梭形細胞。約6天后細胞基本能達到80%以上的融合，即可得間充質干細胞，然后根據需要可重復上述操作進行P2、P3、P4……傳代。
[0030]將實施例1和2得到的間充質干細胞進行流式細胞檢測，檢測方法及結果見下:實驗原理:利用流式細胞技術檢測熒光標記抗體。根據抗原抗體結合原理，用特定熒光素標記的抗體對已知攜有相應抗原的細胞進行染色。經熒光素標記抗體染色的細胞可以被流式細胞儀識別，并根據已知細胞所攜帶的熒光素的強度，對標記抗體進行定性，定量分析。
[0031]檢測步驟:
(I)取5根流式管，分別標記為對照管①FITC/PE/APC②FITC/PE樣本管③90/34/14④DR/105/19 ⑤ 45/34。
[0032](2)各流式管分別加入相同量的傳代細胞(有核細胞數2-5X IO5個)，不可粘到管壁。
[0033](3)對照管①加入 Mouse IgG2a_PE、Mouse IgGl-FITC、Mouse IgGl-APC 分別5 ul，混勻；對照管②加入Mouse IgG2a_PE、Mouse IgGl-FITC分別5 ul，混勻；樣本管③加入 CD90-FITC、CD73-PE、CD14-APC 分別 5 ul，混勻；樣本管④加入 DR-FITC、CD105-PE、⑶19-APC分別5 ul，混勻；樣本管⑤加入⑶45-FITC、⑶34-PE分別5 ul，混勻。
[0034](4)室溫避光放置 15min,加入 2mL PBS/ 管，1400 rpm/min,離心 5min。
[0035](5)上清，將管內細胞彈起，加入0.5mL PBS,混勻，上機檢測(若不能及時上機，應加入多聚甲醛固定)。
[0036](6)上機分析結果如下:CD73、CD90、CD105 大于 95%，為陽性；CD14、CD19、CD34、CD4、5HLA-DR小于2%，為陰性。
[0037]上述說明:按照實施例中的方法分離培養得到的人臍帶間充質干細胞，滿足CD73、CD90、CD105 大于 95%，為`陽性；CD14、CD19、CD34、CD4、5HLA_DR 小于 2%，為陰性的結
果，經鑒定為間充質干細胞。
[0038]上述無菌檢測過程中使用的薄膜過濾法如下:
無菌檢查法包括比薄膜過濾法和直接接種法，薄膜過濾法能避免能有效去除抗生素及其他水溶性物質對無菌檢測的干擾，能更準確地反映細胞培養過程中微生物存在的狀態。
[0039]本實施方案的無菌檢測采依照《中國藥典2010版》薄膜過濾法檢測，采用HTY-601集菌儀和APY系列培養器。無菌檢測的全過程均在環境潔凈度10000級下局部潔凈度100級的單向流空氣區域內進行，其全過程嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。隔離系統內部環境的潔凈度符合無菌檢查的要求。
[0040]具體實施步驟如下:
(I)取出培養器先檢查包裝是否完好無損。檢查用濾膜孔徑應不大于0.45 μ m，直徑約為50_。根據供試品特性選擇濾膜材質，濾器及濾膜使用前應經適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾I旲在過濾如后的完整性。
[0041](2)將培養器逐個插放在不銹鋼座上，將培養器的彈性軟管裝入集菌儀泵頭，注意定位準確，軟管走勢順暢。
[0042](3)潤濕濾膜:選用PH7.0的氯化鈉_蛋白胨緩沖液作為沖洗液，用75%乙醇或0.2%洗潔爾滅仔細對帶膠塞的沖洗液瓶表面進行消毒(特別是容器頂部需要穿刺的部位)，干燥。然后將培養器導管上的針頭插至沖洗液容器膠塞內，開啟集菌儀，調節轉速為160RMP，啟動約3秒之后倒置沖洗液瓶并置于載瓶架上，每只杯體內注入約50ml沖洗液，潤濕濾膜(潤濕液無需濾干)，取下沖洗液瓶直立于操作臺面上，排空液體后停止集菌儀。[0043](4)供試品的稀釋、轉移、過濾:用75%乙醇或0.2%洗潔爾滅仔細對樣品管裝供試品表面進行消毒，干燥。打開樣品管的蓋子，將樣品管身以45°C角握住，然后將培養器導管上的針頭插至樣品管的底部，開啟集菌儀，調節轉速為160RMP，將供試液轉移至杯體內并進行過濾，待供試液排放盡，停止集菌儀。
[0044](5)沖洗:取下杯體濾杯上端口的彈性護帽。將針頭插入沖洗液瓶內，開啟集菌儀，調節轉速為160RMP，再將沖洗液瓶倒置，向每只杯體內注入約IOOmL左右沖洗液，沖洗3次。沖洗完成后取下紅色護帽泄壓，使用黃色帽塞封閉出液口(旋轉推緊)，然后將培養基重新放入排液槽中。特別注意:在沖洗時，不建議對杯體進行過度振搖，否則導致沖洗液進入空氣過濾器。[0045](6)加培養基:
用紅色夾片夾住培養器四通和定位扣處的另外一管。以100R轉速啟動集菌儀，再倒置培養基瓶，使所有硫乙醇酸鹽流體培養基轉移到培養器杯體內。先用綠色夾片夾住另兩管，再把紅色夾片拿掉，注入改良馬丁培養基，儀器操作方法同加硫乙醇酸鹽流體培養基。當兩個杯體全加滿培養基時，用相對應的夾片夾住離培養器杯體上方2-3cm處的軟管，同時剪下兩根軟管，留下5-6cm，并將另一頭插入杯體的空氣過濾器處。(剪刀需過酒精燈火焰)
(7)取相應的沖洗液同法操作，作為陰性對照。
[0046](8)將已操作完畢的含培養基的集菌培養器移出無菌室，取其一管作陽性對照，依陽性對照菌選擇原則加入相應對照菌液。
[0047](9)硫乙醇酸鹽流體培養基在30-35°C培養14天，改良馬丁培養基在23-28°C培養14天。培養期間應逐日檢查是否有菌生長，并填寫無菌檢查記錄。如供試品管出現渾濁或沉淀，經培養后不能從外觀判斷時，可取該培養液接種在另一支相同新鮮培養基中，細菌培養2天，真菌培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基是否再出現渾濁；或取培養液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。
[0048](10)結果判斷:陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。
[0049]若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明實驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結果無效:
①無菌檢查試驗所用設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查要求；
②回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物污染的因素；
②供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和(或)無菌操作技術不當引起的。試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規定。
【權利要求】
1.一種培養人臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)取新鮮采集的人臍帶，清洗，放入臍帶保護液中2-8°C保存備用，所述的臍帶保護液是在AIM-V培養基中加入青霉素鈉和硫酸鏈霉素得到的，其中青霉素鈉和硫酸鏈霉素在臍帶保護液中的終濃度分別為100-200 U/mL和100-200 U /mL ； (2)取浸泡在臍帶保護液中不超過48小時的人臍帶，清洗，再依次置臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液中進行浸洗，最后再清洗后置于一次性無菌培養皿中進行備用； (3)將無菌清洗過的人臍帶剪成肉糜狀，加入AIM-V培養基，置分離管中用全自動組織分離器進行分離，得臍帶組織勻漿； (4)將全自動組織分離器處理好的臍帶組織勻漿進行離心，棄上清，收集下層，置于培養瓶中，然后向其中加入無血清培養基，置于36-38°C、飽和濕度、體積分數為5%的CO2孵育箱中培養，至觀察到瓶壁上形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，則獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞混合液，然后經離心，即可獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞，再經傳代培養至細胞融合 度達80-90%即得。
2.根據權利要求1所述的培養人臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于:所述步驟(O中的臍帶保護液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素預先溶解后再加入到AIM-V培養基(治療級)中得到的；所述步驟(2)中青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素按一定量加入0.9%氯化鈉注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制是將注射用兩性霉素B先用0.9%氯化鈉注射液溶解后，再和特定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人臍帶在青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗時間均為8-12min。
3.根據權利要求1所述的培養人臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于:所述步驟(I)和步驟(2)中的清洗均為0.9%氯化鈉注射液清洗。
4.根據權利要求1所述的培養人臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于:所述的步驟(4)為培養5-6天后，取出未貼壁的上層置另一新培養瓶中，向原培養瓶和新培養瓶中均加入無血清培養基繼續培養，并每隔3-4天換液一次，待培養10-15天后即可獲得人臍帶間充質干細胞原代細胞； 然后將原培養瓶和新培養瓶中的培養基完全移出，往原培養瓶和新培養瓶中加入質量百分數為0.25%的重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液浸沒貼壁細胞，放入36-38°C培養箱保溫消化7-9分鐘，當觀察到貼壁細胞圓縮，且已經脫離瓶底后，加入消化液同等體積的無血清培養基終止消化，然后轉移至離心管中，離心棄上清，吹勻沉淀在離心管底部的細胞，再根據4000-6000個細胞/cm2接種到培養瓶中，并向培養瓶中補充無血清培養基，置36-38°C、飽和濕度，體積分數為5%的CO2孵育箱中培養，每3-4天全量換液一次，至貼壁細胞彼此融合，且融合度達80-90%，即得人臍帶間充質干細胞，在有需要時，可重復上述操作進行多代細胞培養擴增。
5.根據權利要求1所述的培養人臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于:所述T25培養瓶可放置不超過5g的人臍帶經全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進行培養；所述T75培養瓶可放置10-15 g的人臍帶經全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進行培養；所述T175培養瓶可放置30-35 g的人臍帶經全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進行培養；所述T25培養瓶中需要的無血清培養基的體積為6-8mL ;所述T75培養瓶中需要的無血清培養基的體積 為20-25mL ;所述T175培養瓶中需要的無血清培養基的體積為30_35mL。
【文檔編號】C12N5/0775GK103451151SQ201310243569
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月19日 優先權日:2013年6月19日
【發明者】蔡鵬 , 操春紅, 余順 申請人:武漢道培胎盤干細胞生物技術有限公司