一種大葉藻無菌實生苗的培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種大葉藻無菌實生苗的培養方法，步驟是：選取形態飽滿完整的大葉藻種子，無菌環境下置于滅菌容器中，用滅菌天然海水洗3~5次；用濃度為75％乙醇浸泡30秒，用滅菌天然海水洗3~5次；將種子移至濃度為10％的過氧化氫溶液中浸泡20分鐘，用滅菌天然海水洗3~5次；分散接種于固體培養基上，于恒溫光照培養箱中進行培養：溫度18℃、光強1500lux，光照：黑暗＝12h：12h；逐天觀察，如有污染及時將未污染者轉接；實生苗長到1~2cm長，將其轉入液體培養基培養或取其相關組織培養。本發明對大葉藻種子進行固體培養，可及時轉接未污染者到新培養基上，避免一粒污染而損失整瓶現象出現，有效降低了污染率。
【專利說明】 一種大葉藻無菌實生苗的培養方法

【技術領域】
[0001]本發明所屬海草組織培養【技術領域】，涉及一種大葉藻無菌實生苗的培養方法。

【背景技術】
[0002]大葉藻(Zo1Siera marina L.)是北半球溫帶海域分布最為廣泛的海草,具有重要的生態服務功能。由于近幾十年來其種群在全球范圍內大面積退化，所以其種群修復重建工作已成為許多沿海國家的重要生態工程項目，修復重建中需要大量的種源，種源的采集往往又會導致其原生境的進一步破壞。因此，如能利用組織培養技術在室內快速、大批量地培養出價格低廉的純凈大葉藻試管苗，可滿足其種群修復重建中對種源的大量需求。
[0003]但研究表明，由于大葉藻葉表皮細胞無角質層，且葉和莖組織中散布有大量氣道，根中也有許多氣體空腔，所以使得以野生成體植株為組織培養的外植體時，消毒劑濃度和消毒時間極難掌握，常出現因消毒不夠而污染或消毒過而殺死大部分組織的兩難境地。而大葉藻種子的種皮堅硬、厚實，對消毒劑的耐受性顯然強于根、莖、葉等組織；且實生苗生理年齡最幼，所以無菌實生苗是大葉藻組織培養的最佳外植體選擇。
[0004]2010年7月中國海洋大學公開“一種大葉藻無菌苗的培育方法”、2012年I月山東東方海洋科技股份有限公司公開“一種培育大葉藻無菌苗的方法”專利，兩項專利均為大葉藻無菌實生苗的培養方法，雖然種子消毒方式和培養介質不同，也成功地獲得了大葉藻無菌實生苗，但二者均用液體介質對大葉藻種子進行培養，大量的組織培養實踐表明，多個外植體置于同一液體培養基中進行培養，極易引起污染，雖然大葉藻種子相對于其根、莖、葉較易達到徹底消毒，但其種子較小、種皮上有10-20條縱棱紋,所以消毒后難免會有消毒不徹底的種子，如果將它們進行液體培養，常會出現因培養瓶內一粒種子污染導致一瓶種子均污染的嚴重后果。
[0005]


【發明內容】

[0006]本發明的目的是:提供一種有效減少污染率的大葉藻無菌實生苗的培養方法。其特征包括以下步驟:
(1)選取形態飽滿完整、種皮呈現褐色的大葉藻種子，在超凈工作臺的無菌環境下將其置于已滅菌的玻璃容器中，用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干；
(2)用濃度為75%乙醇溶液將種子浸泡30秒后,再用滅菌天然海水沖洗3-5次,用滅菌濾紙將水吸干；
(3)將大葉藻種子移至濃度為10%的過氧化氫溶液中浸泡20分鐘，再用滅菌天然海水沖洗3-5次；
(4)將消毒的種子分散接種于固體培養基上；
(5)放入恒溫光照培養箱中進行培養，培養條件為:溫度保持18°C，光照強度15001UX，光照:黑暗=12h:12h ； (6)逐天觀察，發現有污染者立即將未污染者轉接到新的培養基中；
(7)實生苗長到f2cm長時，即可將其轉入相應的液體培養基中進行培養，或直接取其相關組織進行組織培養。
[0007]本發明的優點在于:采用固體培養基對大葉藻消毒種子進行培養，如有個別種子污染，由于固體培養基的固定性，可將未污染種子及時轉接到新的培養基上，避免一粒污染而損失整瓶種子的現象出現(圖1)。因此本發明大大降低了大葉藻實生無菌苗獲得過程中的污染率，節約種子、節約成本，提高無菌實生苗的產率。
[0008]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1采用液體培養時大葉藻實生苗出現整瓶污染照片圖2在固體培養基上剛發芽的大葉藻實生苗照片
圖3轉入液體培養基中的實生苗照片

【具體實施方式】
[0010]本發明所述的一種有效減少污染率的大葉藻無菌實生苗的培養方法包括以下實施例，下面的實施例可進一步說明本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0011]實施例1:
一種大葉藻無菌實生苗的培養方法，其實施步驟包括:
(1)選取8月剛從海域中采回的形態飽滿完整、種皮呈黑褐色、有活力的大葉藻種子；
(2)先用天然海水將種子表面的附著物和雜質沖洗干凈，在超凈工作臺的無菌環境下將其置于已滅菌的玻璃容器中，用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干；
(3)用濃度為75%乙醇溶液將種子浸泡30秒后，再用滅菌天然海水沖洗3-5次,用滅菌濾紙將水吸干；
(4)將大葉藻種子移至濃度為10%的過氧化氫溶液(含0.1%的吐溫，過氧化氫溶液用滅菌海水來稀釋配制)中浸泡20分鐘，再用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干;
(5)將消毒過的種子分散接種于裝有固體培養基的培養皿中，培養基只含4g/L瓊脂和10g/L海鹽，培養皿用parafilm封口膜封口 ；
(6)放入恒溫光照培養箱中進行培養，培養條件為:溫度保持18°C，光照強度15001UX，光照:黑暗=12h: 12h。
[0012](7)逐天觀察，發現有污染者立即將未污染者轉接到新的培養皿中；
(8)20天后，種子陸續發芽，如圖2所示，30天后，80%的種子發芽，發芽I周后，實生苗可長到l-2cm長，此時即可將其轉入相應的液體培養基中進行培養(圖3)，或直接取其相關組織進行組織培養。
[0013]本實施例所用海鹽為青島通用海大海水素有限公司生產的海水素；恒溫光照培養箱為上海博訊SPX-250B-G型光照培養箱。
[0014]實施例2:
(I)選取7月剛從海域中采回的形態飽滿完整、種皮呈黑褐色、有活力的大葉藻種子； (2)先用天然海水將附著物和雜質沖洗干凈，在超凈工作臺的無菌環境下將其置于已滅菌的玻璃容器中，用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干；
(3)用濃度為75%乙醇溶液將種子浸泡30秒后，再用滅菌天然海水沖洗3-5次,用滅菌濾紙將水吸干；
(4)將大葉藻種子移至濃度為10%的過氧化氫溶液(含0.1%的吐溫，過氧化氫溶液用滅菌海水來稀釋配制)中浸泡20分鐘，再用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干;
(5)將消毒過的種子分散接種于裝有固體培養基的培養皿中，培養基為含4g/L瓊脂和10g/L海鹽的1/2MS培養基，培養皿用parafilm封口膜封口 ；
(6)放入恒溫光照培養箱中進行培養，培養條件為:溫度保持18°C，光照強度15001UX，光照:黑暗=12h: 12h。
[0015](7)逐天觀察，發現有污染者立即將未污染者轉接到新的培養皿中；
(8)20天后，種子陸續發芽，如圖1所示，30天后，80%的種子發芽，發芽I周后，實生苗可長到l-2cm長，此時即可將其轉入相應的液體培養基中進行培養，或直接取其相關組織進行組織培養。
[0016]本實施例所用海鹽為青島通用海大海水素有限公司生產的海水素；恒溫光照培養箱為上海博訊SPX-250B-G型光照培養箱。
[0017]實施例3:
(I)選取7月剛從海域中采回的形態飽滿完整、種皮呈黑褐色、有活力的大葉藻種子，置于250ml的培養瓶中，加入天然海水200ml，放于在4°C冰箱保存，無需充氣和照明，每日更換兩次海水，更換的海水需預冷。
[0018](2)將保存15天或更長時間的種子先用天然海水將附著物和雜質沖洗干凈，在超凈工作臺的無菌環境下將其置于已滅菌的玻璃容器中，用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干；
(3)用濃度為75%乙醇溶液將種子浸泡30秒后,再用滅菌天然海水沖洗3-5次,用滅菌濾紙將水吸干；
(4)將大葉藻種子移至濃度為10%的過氧化氫溶液(含0.1%的吐溫，過氧化氫溶液用滅菌海水來稀釋配制)中浸泡20分鐘，再用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干;
(5)將消毒過的種子分散接種于裝有固體培養基的培養皿中，培養基只含4g/L瓊脂和10g/L海鹽，培養皿用parafilm封口膜封口 ；
(6)放入恒溫光照培養箱中進行培養，培養條件為:溫度保持18°C，光照強度15001UX，光照:黑暗=12h: 12h。
[0019](7)逐天觀察，發現有污染者立即將未污染者轉接到新的培養皿中；
(8)5天后種子陸續發芽，10天后，90%的種子發芽，發芽I周后，實生苗可長到l-2cm長，此時即可將其轉入相應的液體培養基中進行培養，或直接取其相關組織進行組織培養。
[0020]本實施例所用海鹽為青島通用海大海水素有限公司生產的海水素；恒溫光照培養箱為上海博訊SPX-250B-G型光照培養箱。
【權利要求】
1.一種大葉藻無菌實生苗的培養方法，其特征在于具體步驟如下: (1)選取形態飽滿完整、種皮呈現褐色的大葉藻種子，在超凈工作臺的無菌環境下將其置于已滅菌的玻璃容器中，用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干； (2)用濃度為75%乙醇溶液將種子浸泡30秒后,再用滅菌天然海水沖洗3-5次,用滅菌濾紙將水吸干； (3)將大葉藻種子移至濃度為10%的過氧化氫溶液中浸泡20分鐘，再用滅菌海水沖洗3-5 次； (4)將消毒過種子分散接種于固體培養基上； (5)放入恒溫光照培養箱中進行培養，培養條件為:溫度保持18°C，光照強度15001UX，光照:黑暗=12h:12h ； (6)逐天觀察，發現有污染者立即將未污染者轉接到新的培養基中； (7)實生苗長到f2cm長時，可將其轉入相應的液體培養基中進行培養，或直接取其相關組織進行組織培養。
【文檔編號】A01H4/00GK104126504SQ201310431215
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】鄭鳳英, 李樂樂, 陳玉, 金艷梅, 竇國棟, 劉雪芹, 張偉 申請人:山東大學（威海）