專利名稱：玉米干旱誘導型啟動子及活性分析的制作方法
技術領域：
本發明屬生物工程技術領域，具體涉及一種來源于玉米干旱應答蛋白基因CKS2 并在植物中高度表達的干旱誘導型啟動子序列、含有該啟動子序列的植物干旱誘導型表達載體，以及應用該啟動子生產轉基因植物。
背景技術：
逆境脅迫是目前農業生產中影響糧食產量最重要的因素和挑戰之一。土壤退化、 淡水匱乏、氣候(象)多變等因素導致扣除零產出的荒蕪、鹽堿、灘涂地(15億畝以上)夕卜， 每年直接由鹽堿、干旱、低溫等逆境脅迫造成的農作物減產仍超過總產的20%左右。在這些嚴重影響農作物生產的逆境因子中，干旱和鹽脅迫是最主要的因素。據統計，全國每年有7 億畝農田受旱災威脅，干旱所造成的損失幾乎是其它自然災害所造成損失的總和。特別是擔負我國糧食生產任務65%以上的華北、東北和西北，恰恰是我國最缺水和最干旱的地區。解決糧食生產中嚴重的多元逆境脅迫問題，提高其產量，除了常規育種技術以外， 基于基因遺傳轉化的生物育種技術是一個重要的選擇。通過轉基因技術提高作物抗逆性是有效應對逆境挑戰的根本途徑，而分離、克隆抗逆關鍵基因是解決這一重要問題的核心與關鍵，克隆和組建逆境誘導型啟動子是進行多抗基因轉化實現分子育種目標的重要保障。 目前，從實踐上應用的啟動子來看，仍以CaMV35S、玉米WDiquitin promoter等組成型表達啟動子為主，而且多為天然分離DNA片段的直接應用，無法實現高效、可控和特異(定點、定時、定量)的調控，而且由35S啟動的基因過表達會使轉基因植物表型產生一些負面效應， 如矮化等。因此克隆并應用脅迫誘導型啟動子來啟動抗逆基因的表達，在提高植物的抗性方面具有重要作用。目前，許多學者對逆境脅迫誘導型啟動子進行了研究。如rd29A啟動子是缺水等逆境誘導啟動子。Kasuga等用組成型的CaMV 35S啟動子和rd29A啟動子分別驅動DREBlA 基因轉化擬南芥(Kasuga M，Liu Q,Miura S，，1999)。CaMV 35S啟動子驅動的DREBlA基因的過量表達激活了許多其他耐脅迫基因的表達，例如rc^9A、Kin l、Cor6.6等。轉基因植株都比非轉基因植株的抗旱、抗鹽、抗凍能力顯著提高。但是，過量表達DREBlA基因也導致了植株在正常生長條件下生長遲緩；與之相反，由脅迫誘導型啟動子rd29A驅動的基因表達不僅使植株有更強的脅迫耐受力還對其生長有著最小的負面影響。0sABA2基因編碼玉米黃質環氧化酶，該基因啟動子含有一個MYBR元件和5個MYCR元件，表明它的表達與ABA響應誘導有關。Rai等用0sABA2基因啟動子與GUS構建的表達載體轉化玉米，實驗表明在沒有脅迫的條件下，由0sABA2基因啟動子驅動的的轉基因株系的GUS活性要比由Actl驅動的對照組低得多(feii M，He CK，2009)。缺水處理后，葉片中由0sABA2基因啟動子驅動的⑶S 的表達量是無缺水處理對照組的5倍；而由Actl啟動子驅動的對照組GUS的表達量沒有任何增加。corlfe基因啟動子具有低溫誘導表達的特性，朱青等從擬南芥Columbia生態型的基因組中擴增出corlfe基因的啟動子片段，將其插入pBI121的⑶S基因和NOS終止子上游構成表達載體PLB，獲得轉化株。⑶S組織染色結果表明，經過低溫處理的轉基因馬鈴薯的葉片均表達了⑶S產物，而沒有經過低溫處理的轉基因馬鈴薯及非轉基因植株則檢測不到⑶S活性(朱青，宋波濤等，2004)。Rrandl等分析了大豆Gmhspl7. 32B熱誘導啟動子在轉基因煙草中的調節作用，并在轉基因植物的種子上測得GUS活性，發現該啟動子具有一段熱誘導因子(HSE)的同功序列。杜鵑等從小麥中克隆了 mWCS120啟動子，構建了誘導型瞬時表達質粒pmw-GUS，用pmw-GUS轉化玉米愈傷組織和煙草葉片證明，mwcsl20啟動子在單子葉和雙子葉植物中均可受低溫等逆境誘導，可以用于驅動結構基因的表達(杜娟， 朱禎，李晚忱，2005)。Nazmul等分離了 1. 6kb的AmCMO基因上游啟動子片段，5'端缺失分析發現，翻譯起始點上游410bp片段中含有鹽脅迫響應序列，300mmol/L NaCl處理24h后， ⑶S活性顯著提高，AmCMO基因上游410bp片段可以作為鹽誘導啟動子(Nazmul HB, Akira H, Nana Y,2007)。利用逆境誘導型啟動子驅動抗逆基因在轉基因植物中表達是培育抗逆作物新品種的有效方法。目前能應用于轉基因研究的誘導型啟動子仍然很少，對于新的抗逆相關啟動子的發現、克隆、順式作用元件分析以及與順式元件相互作用的轉錄因子的研究仍然是今后研究的重點，將功能明確的抗逆啟動子成功應用到轉基因植物中調控抗逆基因的表達是植物抗逆基因工程的一個重要研究方向。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種干旱誘導型啟動子序列，該啟動子序列能夠誘導目標基因高水平表達，而且該啟動子來源于玉米干旱應答蛋白基因CKS2。本發明的第二個目的是提供一種用于植物轉化的干旱誘導型啟動子載體，該載體指導高水平表達目標基因的干旱誘導型啟動子序列和5’非翻譯區。本發明的第三個目的是提供一種所述載體轉化的轉基因植物。該轉基因植物能反映啟動子誘導活性的高低。為實現上述目的，本發明克隆了玉米干旱應答蛋白基因CKS2的干旱誘導型啟動子區，并構建了用于植物轉化的載體，所述載體包含帶有玉米干旱應答蛋白基因CKS2的5’ 非翻譯區的上述啟動子。本發明提供一種獲得的玉米干旱誘導型啟動子序列，包含相對于SEQ ID NO 1的轉錄起始位點的-Ibp至-1444bp區(見序列表)的DNA核苷酸序列，干旱可以在植物中誘導本發明所述的啟動子的高水平活性。獲得的玉米干旱誘導型啟動子序列源自玉米干旱應答蛋白基因CKS2。一種克隆得到的玉米干旱應答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區包含相對于SEQ ID NO 1的轉錄起始位點的+Ibp至+219bp區(見序列表)的DNA核苷酸序列，本發明所述的非翻譯區能通過增強導入植物中的目標外源基因的翻譯效力，而誘導目標基因的高水平表達。為實現另一個目的，本發明提供一種用于玉米轉化的干旱誘導型的植物表達載體，包含玉米干旱誘導型啟動子序列和玉米干旱應答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區。上述用于植物轉化的干旱誘導型載體是指能夠在轉基因植物中持久表達外源基因的二元載體。所述二元載體可以是任何包含T-DNA (轉移DNA)的RB (右邊界序列)和 LB (左邊界序列)，能夠在根癌農桿菌(Agrobaterium tumefaciens) Ti質粒存在下轉化植物的二元載體。該載體可以是經常用于相關領域的二元載體，例如PCAMBIA1301載體、 PBI121 載體。一種用植物表達載體轉化的轉基因植物，包含玉米干旱誘導型啟動子序列和玉米干旱應答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區。本發明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，適于擴增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。關于本發明所述的用于植物的誘導型載體(PCAMBIA1301)，所述的玉米干旱應答蛋白CKS2基因CKS2的啟動子和5’非翻譯區在植物表達載體中位于外源基因的前面。本發明提供通過插入本發明所述的玉米干旱應答蛋白基因CKS2的啟動子和5’非翻譯區至含有GUS報告基因的載體中而構建的PCAMBIA1301。但是，所述GUS報告基因是外源基因，并預期可以用任意其它有用的外源基因來代替。本發明提供一種應用干旱誘導型二元載體的轉基因植物，以及一種應用本發明所述進行瞬時表達的玉米成熟胚。植物能通過使用例如根癌農桿菌(An，G 1987, Plant Physiology)或粒子轟擊方法(Lacorte等，1997，Plant Cell Reports)由上述植物干旱誘導型啟動子二元載體進行轉化。在本發明中，例如煙草可以用葉盤轉化法進行轉化。本發明提供來自玉米干旱應答蛋白基因CKS2的干旱誘導型啟動子和5’非翻譯區，根據本發明的啟動子和5’非翻譯區使得能夠在植物中進行干旱誘導型表達。本發明有益效果在于可用于啟動抗旱基因的高效表達，應用于抗旱的轉基因植物中，對于解決干旱地區糧食生產并提高其產量具有積極意義。


圖1為玉米(B73)基因組電泳圖其中1. 2. 3.代表目的條帶擴增的模板玉米B73基因組DNA圖 2 為 ZmCKS2_pro PCR 電泳圖其中1.ZmCKS2 Μ. Marker IV圖3為pCAMBIA 1301 ZmCKS2pro質粒酶切鑒定電泳圖其中:M.marker ν 1. Cks-1301 質粒酶切 2. Cks-1301 質粒圖4為pCAMBIA 1301: ZmCKS2pro植物表達載體構建示意5為ZmCKS2pro啟動子的GUS檢測(用20 %的PEG處理)圖6為ZmCKS2pro啟動子的⑶S檢測(未處理)圖7為pCAMBIA 1301 :ZmCKS2pro農桿菌侵染煙草葉片篩選照片圖8為pCAMBIA 1301:: ZmCKS2pro農桿菌侵染煙草葉片篩選后生根照片圖9為轉基因(ZmCKS2pr0)侵染煙草根的⑶S染色照片(未處理)圖10為轉基因(ZmCKS2pro)侵染煙草根的⑶S染色照片(用20%的PEG處理)
具體實施例方式下面結合附圖介紹具體實施例以下的實施將能夠使本領域技術人員更清楚地理解如何實施本發明。盡管已經結合本發明優選的具體實施方式
來對本發明進行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發明的范圍。本發明的其它方面對于本發明有關領域的技術人員來說是顯而易見的。實施例1 玉米干旱應答蛋白基因CKS2的干旱誘導型啟動子的克隆玉米干旱應答蛋白基因CKS2的啟動子(啟動子序列包含相對于SEQ ID NO=I的轉錄起始位點的-Ibp至-1444bp區的DNA核苷酸序列)，在玉米干旱應答蛋白基因CKS2的 5’非翻譯區序列中得到鑒定。玉米干旱應答蛋白基因CKS2登錄在NCBI GenBank (登錄號⑶556566. 1)，序列表顯示本發明上述基因的植物干旱誘導型啟動子和5’非翻譯區的DNA序列。在圖1中，蛋白合成的起始密碼子ATG帶有下劃線，而且轉錄起始位點的堿基T用+1示出。并用啟動子分析網站分析了啟動子的核心元件。啟動子分析網站為http://bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/0以玉米基因組DNA(圖1)為模板，擴增得到目的片段，經
瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出長度為1860bp的特異條帶，并進行回收(圖幻。電泳后回收目的片段，與PMD 18-T載體連接得到重組質粒pMD 18-T::Zm CKS2ft~o，提取質粒并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切驗證，并測序。更具體地說，通過PCR擴增克隆的干旱應答蛋白基因CKS2的啟動子和219bp的5’ 非翻譯區(見序列表)，上述PCR所用引物詳細顯示在表1中。對于PCR擴增，反應程序: 940C 4min ；94°C 50S，55. 5°C 50S，72°C 2min，29 個循環；72°C IOmin ；表1:引物
上游引物5' CAATCCTGTCTTGCCCCATACT 3'SEQ ID NO 2下游引物5' TCCATGGCTACCMGACTTCTCG 3'SEQ ID NO 3 實施例2 植物干旱誘導型載體的構建將在實施例1中所克隆的玉米干旱應答蛋白基因CKS2的啟動子和219bp的5’非翻譯區ZmCKS2ftx)(見序列表)插入到載體中，從而構建植物干旱誘導型載體。更具體地說，將植物表達載體pCAMBIA 1301及重組質粒pMD 18-T: :Zm CKS2Pro 用克隆序列內部的I3StI和NcoI分別進行酶切，然后將它們插入載體pCAMBIA1301的I^stI 和NcoI酶切位點。該載體被稱作pCAMBIA 1301: Zm CKS2ftx)，用于驅動⑶S基因的表達， 經酶切鑒定(圖3)獲得了啟動子片段，與預期結果相同。在圖4中，以編碼β -葡糖酸醛酶的基因GUS為報告基因，選擇標記為潮霉素抗性基因。此外35s-pro代表HPTII的啟動子，而35s_ter代表HPTII的終止子，Sn CKS2Pro代表⑶S的啟動子，而Nos-ter代表⑶S的終止子。實施例3 鑒定玉米干旱誘導型啟動子的活性通過熱激轉化法，將在實施例2中構建的載體pCAMBIA 1301:: Zm CKS2Pro轉移到根癌農桿菌EHA105中，提取質粒并進行酶切鑒定。為鑒定啟動子的干旱誘導活性，利用Jefferson等(EMBO J，1987)的方法對農桿菌侵染后的玉米的胚干旱處理再檢測GUS的活性。更具體地說，將玉米種子浸泡催芽，然后將種子縱切成兩半，用20 % PEG誘導培養Mh，將玉米種子在⑶S檢測液中于37 °C過夜，⑶S檢測液3mg/mlX-gluc (5-溴-4-氯-3- 口引哚-β -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸鈉緩沖溶液(PH = 7. 0)，IOmM EDTA，0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. 1% TritonX-100，20%甲醇。如圖所示(圖5， 圖6)，經過PEG誘導的胚根組織顯示出高水平的⑶S活性，而未經誘導的愈傷組織顯示出低水平的GUS活性。實施例4 煙草的葉盤轉化4.1受體材料的準備將煙草種子(NC89)用10%的次氯酸鈉消毒，用無菌水沖洗三次，接種在MS培養基上，得到無菌煙草苗。待幼葉長至2 3cm時，將葉片取下用直徑為7mm的打孔器制成葉盤，近軸面向下接種在分化培養基(MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L ΝΑΑ,ΡΗ = 5. 8,0. 7%瓊脂) 上，預培養2 3d。葉盤切口處剛剛開始膨大時即可進行侵染。4. 2農桿菌菌液的制備將農桿菌EHA105接種于YEP(50mg/L rif、50mg/L kan)固體培養基上，28°C暗培養，至長出單菌落。挑取單菌落，接種在5mL含有相應抗生素的YEP液體培養基中，于， 200r/min振蕩培養M 36小時，將菌液按1 20的比例進行二次活化。當0D600 = 0. 4 0. 6時，吸取菌液置于無菌離心管中，5000rpm離心5min，棄上清，用等體積的MS液體培養基
重懸，備用。4. 3侵染取預培養2 3d的外植體葉片于無菌三角瓶中，加入適量活化好的農桿菌菌液，侵染5 IOmin左右。4. 4共培養將侵染過的外植體接種在共培養培養基上，暗培養2d。4. 5除菌及篩選培養將經過共培養的外植體用無菌水沖洗3 4次，然后用附加除菌劑的液體培養基振蕩培養30min，用無菌濾紙吸干表面水分，再轉移到附加選擇壓力的除菌篩選培養基上，28°C光照培養，每IOd繼代一次(圖7)。4. 6繼代篩選培養篩選培養2 3周后，外植體的轉化細胞將分化出抗性芽，將抗性芽轉入相應的篩選培養基中進行繼代培養。4. 7生根培養待不定芽長到3 4cm時，將其切下并插入生根培養基上進行生根培養，兩周左右長出不定根。(圖8)實施例5 轉化煙草的組織化學法染色將實施例4中的煙草根在含有20% PEG的MS培養基中誘導Mh，浸入⑶S檢測液， 于37°C保溫過夜，將染色材料用70%的乙醇脫色除去葉綠素。⑶S檢測液lmg/ml X-gluc、 50mM磷酸鈉緩沖溶液(PH = 7. 0), IOmM EDTA,0. 5mM鐵氰化鉀、0. 5mM亞鐵氰化鉀、0. 1 % ΗΟηΧ-100，20%甲醇。如圖9、圖10所示，經過PEG誘導的根示出高水平的⑶S活性，而未經誘導的根未檢測出GUS活性。工業實用性如上所述，本發明提供玉米干旱應答蛋白基因CKS2的干旱誘導型啟動子和5’非翻譯區。本發明提供分別將啟動子和5’非翻譯區插入至pCAMBIA1301而制得的植物表達載體。經使用所述的植物表達載體進行鑒定，本發明所述的玉米干旱應答蛋白基因CKS2 的啟動子和5’非翻譯區使得能夠進行干旱誘導型的表達。因此，本發明可用于提高耐旱基因的啟動活性，最終獲得能用于生產的耐旱植物。 序列表
SEQ ID NO. 1的序列(帶功能元件標記)
⑴序列特征(A)長度-lbp至-1444bp ；+Ibp至+219bp ； (B)類型核苷酸；(C) 單鏈。
( )分子類型核苷酸 (iii)序列描述=SEQ ID NO. 1
-1444 GTTGTGCTCA A0GGTCA00C GTGGACATOC ATOGTGMOC OCMTTOGTG AGTGATTGAT ATTCAGTTTT CCAAT-box MBS
-1374 GCCTACATCT IUTTCTTGCT TGTTTCTTCA ATTGATTGTA GGMTAGMC TTTGTGTTCA GGTTGATCTT -1304 GTCAOCAGCA AGGTCMTM OCATTTGGM TTGCTTCTGC GMTGCTMG GTGCCAOGAC CIUTTOGTTC Box-WlG-box
-1234 GTAGTOGGAT OGCGAGTCAT GTTCTOCAOC MTCMMTT AT0CA0CT0G TOGAMGATC GGGGACTOCA
Skn-l_motif TC-rich repeats circadian -1164 GCTCTATCAC CTTTTATAGG TCAGGAMGG GGTOGGCCAG AGATGGMGG AGCOGCGAGG
-1094 AOCMOGTTC TATCTAGGGT AMGCCATGT
C-repeat/DRE GTACTOGTGG GAOOOGGMT TGTTTG1TTC
CMGGGTMT
ABRE GTATTTAOOG
G-box
-1024 TGGCGCATGA OGTGGGGCTG OGATGGTAOC AGGCGCTACT GTOCTCTOCA CACAOGCTAC ACT000CT0G CGTCA-motif
-954 GCCTOGTTGT GACTOGTGTC AAMCTCTTC OGTGAAMOC GTATOCACTA AGGCAGACTC CMOGAOGCC
CE3
TGA-element
-884 OOCTCTGCTC 000CTCA00C TOGCCAOGGC GTAOGACAGC TOCATGMOG ACTOCATOGT TGCOOOCTCT
TGA-element
AGAGAMOGT nOCTTOCAC
-814
-744 -674
(XCTOOOOCT CAOGCOGATG Spl
GTGTGAmT CTGATMCM
TTGATGTATA AMGTCAMT
TATGTAmT MCTTAGm
GATMTMTT ATGAMTTM mTTTTCAG
TAATbox ATACAmn Α ΤΠΤΤΑΜ ACTTCAAAM ATGAGCTGM TAAMGGMT GGTTGGAGM GA-motif
GGTACTACM MTGATAMG as-2—box
-604 GGGATAGMT AGGGGGMGA ATAGTTGAGG GGGAGGTATG TAMTATGM AAMGTATM mGGGGGAT
TCA-element -534 TTGAGAGAGA GMTGGmG AGATAOOCTA AGGGCTGAH
-464 -394
GGGATTGAGG AMnMOOC
GGGAMmG TTTAITTOOC ACTCMTOOC TMGGGGGAC TOCMCAGTG OOOCTOGACA
TGGTGAOOOG GGATOOOGGG AGGATOGMG Spl
CTATMTOCT CTOGGGATOC OCTTGTCAOC OCTMOCTGA MGMTGGAG GGCGGGGAOG
Spl
-324 OCAOCTOGCC GCTOCMOGG OGCOCTTGCC TGQXTCTOG OGGGCGTGGA GMTATTTOC OOCTTGGAGA
CCAAT-boxTC-rich repeats
-254 GGGMGCTCT AGTCTTOOOC TCTOCACTM TCMTMTM ΤΜπΑ Μ ΑπΜπΑπ TTTGAG1TTA
-184 CTAGCAGATA ACMTGTGTA mmCTAT AMTATGGCA GTGTTTTTTG AMCT0CAM MCAMTGTACAAT-box-114 AAAAMGm MTTGCTCAG HAAMGATA MMGMMC TGMTAGGM GMTGATMG AGAGMGATAMBS+1-44 ΑΜΤΜΤΑπ TAMTATGM TAAAMGTAT AMTAGCGGG GCTTTGAGAG GGGGMTGGT AGGAGATACT+27 ATMGGTAOG T000GA0GCC OGTTGCCTTC TCAOOOCAM TOCTOCMn TCTTGTCTTC TOOGCGAMTCCAATT-boxCAAT-box 5UTR Py-rich stretch+97 GnOCTCTGT CTGTOGTGTC TTTCTTCTGG T0G1TT000G AHOGGTAGT TGGCTTGGGG ATTTCACTGCG-boxGCN4_motif+167 AAGTTTGGGG ATTTTCTGTA GGAAAGTTGA TCGAGAAGTC TTGGTAGCCA TGG
權利要求
1.一種獲得的玉米干旱誘導型啟動子序列，其特征在于所述啟動子序列包含相對于 SEQID NO 1的轉錄起始位點的-Ibp至-1444bp區的DNA核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的獲得的玉米干旱誘導型啟動子序列，其特征在于所述啟動子序列源自玉米干旱應答蛋白基因CKS2。
3.根據權利要求2所述的獲得的玉米干旱誘導型啟動子序列，其特征在于一種克隆得到的玉米干旱應答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區包含相對于SEQ ID NO :1的轉錄起始位點的+Ibp至+219bp區的DNA核苷酸序列。
4.一種用于玉米轉化的干旱誘導型的植物表達載體，其特征在于所述植物表達載體包含權利要求1所述的玉米干旱誘導型啟動子序列和權利要求3所述的玉米干旱應答蛋白基因CKS2的5’非翻譯區。
5.一種用植物表達載體轉化的轉基因植物，其特征在于所述轉基因植物包含權利要求 1所述的玉米干旱誘導型啟動子序列和權利要求3所述的玉米干旱應答蛋白基因CKS2的 5’非翻譯區。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米干旱誘導型啟動子及活性分析屬生物工程技術領域，本發明提供獲得的玉米干旱誘導型啟動子序列，包含相對于SEQ ID NO1的轉錄起始位點的-1bp至-1444bp區的DNA核苷酸序列；同時提供用于玉米轉化的干旱誘導型的植物表達載體，其包含玉米干旱誘導型啟動子序列和玉米干旱應答蛋白基因的5’非翻譯區；用植物表達載體轉化的轉基因植物包含玉米干旱誘導型啟動子序列和玉米干旱應答蛋白基因的5’非翻譯區；SEQ ID NO2和3的PCR引物引物適于擴增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段；本發明可用于啟動抗旱基因的高效表達、用于抗旱的轉基因植物中，對于解決干旱地區糧食生產并提高其產量具有積極意義。
文檔編號A01H5/00GK102417910SQ201110363699
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者劉金亮, 張世宏, 張桂珍, 李桂華, 潘洪玉, 王鳳婷, 賈承國 申請人:吉林大學