專利名稱：增強子Hr3在促進hycu-ep32蛋白增量表達中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因領域，特別涉及家蠶的轉基因技術。
背景技術：
轉基因技術是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾。轉基因技術是現代生物學研究中的一項重要的技術，在功能基因研究、生物素材創新、現代遺傳育種等方面發揮著重要的作用。家蠶是具有重要經濟價值的鱗翅目昆蟲，蠶絲業每年為蠶農創收100多億元，蠶絲業為世界經濟、文化、社會發展作出了重要貢獻。但是，當家蠶遭遇病毒侵害，通常會造成蠶業的巨大損失。據統計，我國養蠶業最為發達的幾個主產區，每年因病毒性疾病所造成的損失，約占總蠶病損失的70-80%。其中家蠶核型多角體病毒病又是三大病毒病中最常見、 危害最嚴重的一類蠶病，該病傳染性極強，難以控制。引起核型多角體病毒病的病原為家蠶核型多角體病毒iBombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus, BmNPV)，BmNPV屬于桿狀病毒科，真桿狀病毒亞科，核型多角體病毒屬，病毒粒子呈桿狀，全基因組大小為128413bp ；病毒結構主要由外層的囊膜和內層的核衣殼組成，在不同感染時期分別以出芽型病毒粒子(budded virus, BV)和包埋型病毒粒子 (occluded virus, 0V)兩種形態存在，而多角體是在感染細胞的核或質中產生的包含和保護病毒粒子的一種蛋白質結晶，很穩定。多角體病毒對不良環境、消毒藥劑等有較強的抵抗性，在環境中可以長期存活，但極易溶于堿性溶液；當家蠶食下多角體病毒，在中腸強堿性消化液(PH9.2 9. 4)作用下多角體被溶解，釋放的病毒粒子OV借囊膜與中腸上皮細胞微絨毛膜的融合作用脫去囊膜，核衣殼進入中腸細胞開始原發感染(Primary infection), 在細胞內復制核衣殼并通過“出芽”方式產生BV進入血體腔，繼而感染其他組織細胞。最終，蠶體多以體壁破裂，流出病毒多角體濃汁而死。病毒多角體濃汁中含有大量的病毒粒子，污染蠶座環境，使得周圍健康蠶感染病毒。可見，家蠶核型多角體病毒病是蠶業生產中的一個重要的危害原，一旦產生，極易爆發。由于家蠶核型多角體病毒病在蠶業生產中危害重大，蠶業界一直希望能夠培育出對此病毒具有較高抗性的蠶品種。但是，由于目前病毒致病分子機制研究較少，加之抗性品種培育手段多采用傳統的遺傳篩選的辦法，周期長而且定向性差，所以收效甚微。轉基因技術在生物素材創新、現代遺傳育種等方面發揮著重要的作用，自2000年日本科學家報道首次成功培育轉基因家蠶以來，國內外已陸續報道轉基因家蠶成功的消息。目前已經有報道外國學者嘗試通過轉基因干涉病毒基因的方法來提高家蠶的抗性，他們利用的是家蠶多化性品系的非滯育卵，主要是因為多化性家蠶品種所產的卵為生種卵， 其不需要任何的人工處理便能夠在適當的溫濕度下連續發育直至孵化，這個特點極大地方便了轉基因實驗中的操作控制。但是，通過轉基因干涉利用多化性家蠶品種制備的抗病毒品系具有以下兩個方面明顯的缺陷①生產用種普遍為二化性滯育種，用多化性家蠶品種制備的抗病毒品系不利于生產推廣，同時與滯育性的家蠶品種相比較，多化性家蠶品種不具有滯育期，對其繼代維持只能依靠連續的飼養繁殖，這樣需要耗費大量的人力物力對獲得的轉基因家蠶品系進行維持和繼代，同時也大大增加了獲得的轉基因家蠶品種資源丟失的風險。②轉基因干涉品系只能在mRNA水平發揮作用，不能在病毒DNA復制和蛋白合成水平發揮作用。因此，利用家蠶滯育品種，制備一種能在病毒DNA復制和蛋白合成水平抑制病毒增殖的轉基因品系是一個有效可取的方法。先前的研究結果顯示，當家蠶核型多角體病毒(BmNPV)和美國白蛾核型多角體病毒(HycuNPV)共轉染BmN-4細胞，BmNPV在BmN_4細胞中的增殖將受到抑制，HycuNPV編碼的如《/_印32基因與BmNPV的增殖被抑制有關。家蠶自身抗性的有限導致宿主對抗性蛋白的大量需求。然而，遺憾的是，家蠶自身體內并不存在Hycu-EP32蛋白。BmNPV的同源重復區(homologous regions, hr3)具有復制起始位點的功能，可以對啟動子行使增強子功能。 在細胞水平，Hr3增強子能使啟動子的活性增強幾倍，而Hr3+BmNPV的IEl蛋白能使啟動子的活性增強上千倍。BmNPV的39kP啟動子具有明顯的BmNPV誘導啟動活性，能使家蠶在受到BmNPV侵染的時候啟動下游基因的表達。在棉花、玉米和水稻等物種中已經有利用轉基因增量表達抗性基因來培育抗性品種的相關報道。到目前為止，利用滯育性家蠶品種增量表達外源抗病毒蛋白的方法和轉基因品系在國內外還未見報道。因此，探索利用家蠶滯育品種，轉基因增量表達外源抗病毒基因，抑制病毒在家蠶細胞中的增殖來提高家蠶的抗性是培育抗性品種的必然選擇，也是加速科技成果實用化的要求。

發明內容
本發明的目的在于提供增強子Hr3的新應用，該應用為提高家蠶核型多角體病毒抗性提供了新的思路。本發明的目的之二在于提供一種增量表達載體，其能顯著提高 hycu-ep-il蛋白的表達量；本發明的目的之三在于提供所述增量表達載體的制備方法，該方法操作簡單，適用于大規模運用，其穩定性佳；本發明的目的之四在于提供所述增量表達載體的應用，該應用降低了家蠶感染核型多角體病毒的風險。本發明增強子Hr3在促進hycu-印32蛋白增量表達中的應用，利用轉基因增量表達外源抗病毒蛋白來制備抗BmNPV家蠶品種的方法，依次通過以下步驟實現
(1)利用轉座載體pBac[3XP3-EGFPafm]構建包含病毒39kP啟動子、如《/_印32基因全長序列和終止信號序列SV40片段的增量表達載體pBac[39kP-A_F /-e/732-SV40-3XP3 -EGFP afm] (pb-EKG)以及包含增強子Hr3、39kP啟動子、如《/-印32基因全長序列和終止信號序列 SV40 片段的增量表達載體 pBac[Hr3-39kP- Aycu-ep32-SYA0~3 X P3-EGFP afm] (pb-HEKG)；
(2)將家蠶932品種通過15°C低溫催青解除滯育，將產下的非滯育蠶卵收集好，在蠶卵產后池-處用顯微注射儀內將3-如1、總濃度為400ng/ul的混合質粒(增量表達載體和輔助質粒按1:1混合)注射進蠶卵蠶卵，然后用無毒膠水將注射孔封住。(3)將完成注射的蠶卵在35%的甲醛蒸汽中消毒^iin后，置于25°C、相對濕度為 80%的環境中進行催青直到孵化，將孵化的蟻蠶置于標準條件中飼養，將當代(GO)的蠶蛾進行自交或者回交，將滯育性的Gl代蠶卵即時浸酸解除滯育，胚胎發育第六天在熒光顯微鏡下面篩選轉基因陽性個體，將獲得的轉基因個體單蛾區正常飼養，繼代擴大群體數量。(4)通過RT-PCR檢測轉基因系統中hycu-印 >2的表達量，確定hycu-印 >2確實在所獲得的轉基因系統中表達。(5)將轉基因系統EKG、HEKG和正常932在3齡起蠶，用半致死劑量的BmNPV病毒通過經口感染，設置不添食的轉基因和正常932對照，連續10天統計死亡率。結果顯示轉基因系統HEKG對BmNPV病毒的抗性明顯提高。(6)通過熒光定量PCR檢測hycu-印 ^在攻毒后的表達量變化情況，確定在HEKG 系統中，如《/-印32的表達量在攻毒后大大增加。(7)在攻毒后Mh，EKG、HEKG和正常932各取10頭蠶提取總DNA，通過熒光定量 PCR檢測BmNPV病毒的拷貝數，證明HEKG中的病毒含量確實遠低于正常932。(8)調查EKG、HEKG和正常932的經濟性狀，各系統雌雄各隨機抽取15顆繭，分別稱取每顆繭的全繭量和繭殼量，計算繭層率，確定轉基因系統的經濟性狀沒有受到影響。本發明的技術方案為
增強子Hr3在提高hycu-印32蛋白表達量中的應用，所述增強子Hr3的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。優選的，增強子Hr3在介導39kP啟動子提高hycu-印32蛋白表達量中的應用，所述39kP啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。增量表達載體，所述增量表達載體以轉座載體pBac[3XP3-EGFP afm]為基礎載體，依次連接有增強子Hr3、39kP啟動子、如印32基因和終止信號序列。優選的，所述如《/-印32基因為如《/-印32基因全長序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。優選的，所述終止信號序列為SV40，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。所述的增量表達載體的制備方法，具體包括以下步驟 A) 39kP-1180載體的構建
將如SEQ ID NO: 2所示的39kP啟動子用Sal I和BamH I進行雙酶切，得39kP啟動子酶切片段，同時用Sal I私BamH I酶切pSLfall80fa載體，得pSLfall80fa載體酶切片段，連接39kP酶切片段和pSLfalISOfa載體酶切片段，得39kP_1180載體； B ) 39kP-^cw-6'/732-1180 載體的構建
將核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的hycu-ep22基因分別用BamH /和Not I 進行雙酶切，■ hycu-印 >2酶切片段，同時用I和Λ^ I酶切39kP-1180載體，得 pSLfal 180fa-39kP載體酶切片段，連接如《/_印32酶切片段和pSLfal 180fa_39kP載體酶切片段，得39迚-如《/-印32-1180載體；
C ) 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 載體的構建
Not /和歷///雙酶切含有如SEQ ID Ν0:4所示的終止信號的1180載體，得到終止信號酶切片段，同時用Λ^ I私Hind ///雙酶切步驟B所得39沙-如《/-印32-1180載體，得到39迚-如《/-印32-1180酶切片段，將終止信號酶切片段和39迚-如《/-印32-1180酶切片段進行連接，得 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 ； D) Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-l 180
將如SEQ ID NO: 1所示增強子Hr3用Afco /進行單酶切，得增強子Hr3酶切片段，同時將步驟C所得的39kP-A_F /-e/732-SV40-1180用Afco /進行單酶切，得39kP-A_F /-印32-SV40-1180酶切片段，將所述增強子Hr3酶切片段和 39kP-^cw-6'/732-SV40-l 180 酶切片段進行連接，得 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 ； E) pBac [Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-3 X P3-EGFP afm]的構建用限制性內切酶Jm /酶切步驟D所得Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-l 180載體， 得 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段；同時用內切酶Asc / 單酶切 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]，得 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]線性片段，將 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段和 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]連接，得增量表達載體，命名為 pBac[Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV4 0-3XP3-EGFP afm]。優選的，步驟Α)中，如SEQ ID NO: 2所示的39kP啟動子的獲得方式如下設計特異引物，39kP的上游引物為5' acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3' , 39kP的下游引物為 R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'；以 BmNPV 基因組為模板進行 PCR擴增，PCR 反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、55°C退火40秒、72°C延伸20秒，共30個循環，最后72°C延伸10分鐘。優選的，步驟B)中，如SEQ ID NO 3所示的hycu-印 >2的獲得方式如下 如《/-印32基因序列設計特異引物，上游引物為5，cgggatccatgaagaaccaacaacag 3', 下游弓 I物為5' atagtttagcggccgcttaatttattaacatatcaaag 3'；以 HycuNPV 基因組為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、44°C退火 40秒、72°C延伸50秒，共30個循環，最后72°C延伸10分鐘。所述的增量表達載體在制備家蠶核型多角體病毒抗性增效劑中的應用。本發明增強子Hr3在促進hycu-印32蛋白增量表達中的應用，利用轉基因增量表達外源抗病毒蛋白提高家蠶對BmNPV抗性的方法，首次通過在滯育家蠶品種中轉基因增量表達外源抗性蛋白來顯著提高家蠶的抗性。與其他方法相比，本發明具有以下優勢①使家蠶在發育的各個時期均能表達Hycu-EP32蛋白，克服正常家蠶不表達Hycu-EP32的缺陷，有利于家蠶在各個時期都能利用Hycu-EP32蛋白來抑制病毒的增殖；②巧妙的利用誘導型啟動子39kP和增強子Hr3的組合，使轉基因家蠶在正常情況下基本不表達Hycu-EP32蛋白， 當BmNPV侵染家蠶的時候才表達該蛋白，而且利用病毒增殖產生的IEl蛋白激活Hr3增強子來大量表達該蛋白，使該蛋白的表達量隨著病毒量的增加而增加，所以能最大程度減少表達外源蛋白對家蠶正常生理活動和經濟性狀的影響，同時還能顯著提高家蠶的抗性；③ 滯育性轉基因系統不需要連續飼養，保存和管理方便，而且品種資源丟失的風險低；④和傳統育種手段相比，本發明通過轉基因制備抗性品種不但效果好而且周期短。


圖1為增量表達如《/-印32的轉基因載體pb-EKG、pb-HEKG的結構示意圖。圖2為RT-PCR檢測hycu-印 >2在EKG、HEKG-A, HEKG-B和正常932中的表達量的瓊脂糖凝膠電泳圖；印32代表如《/-印32，sw2^34代表內參基因；PCR檢測同一個模板， ep32擴增28個循環，sw229;34擴增25個循環。圖3為EKG、HEKG-A, HEKG-B、正常932品種和不攻毒對照的死亡率統計結果；各系統在3齡起蠶以半致死劑量(3X IO5多角體/頭)單頭經口添食BmNPV病毒。
圖4為EKG、HEKG-B和正常932品種添食病毒后Oh和48h，hycu-印 >2在各系統中表達量的定量PCR檢測結果。圖5為攻毒后4 ，EKG、HEKG-B和正常932各系統體內BmNPV病毒含量的定量PCR 檢測結果。圖6為EKG、HEKG-A, HEKG-B和正常932各系統雌雄全繭量統計結果。圖7為EKG、HEKG-A, HEKG-B和正常932各系統雌雄繭層率統計結果。
具體實施例方式就分子生物學領域中，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中為注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkiCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。本發明通過構建病毒39kP誘導型啟動子以及39kP啟動子+Hr3增強子分別介導 hycu-ep-il基因的增量表達載體；結合蠶卵低溫催青解除滯育方法，利用家蠶胚胎顯微注射技術，制備了 3個家蠶實用品種轉基因系統；通過RT-PCR檢測證明外源如印32基因在3個轉基因系統中成功表達，而正常家蠶品種中沒有該基因；通過經口添食病毒的抗性檢測方法，結果發現和正常932系統相比，EKG系統(使用39kP啟動子)沒有降低死亡率，而 HEKG系統(使用39kP啟動子+Hr3增強子)則降低了 30%左右的死亡率，抗性效果明顯；通過定量定PCR檢測發現，在正常情況下，如印32基因在HEKG系統中的表達量是EKG系統中的11. 9，在攻毒后48h，hycu-ep-il在HEKG系統中的表達為EKG系統中的48. 5倍，HEKG 系統中hycu-??？>2的表達量能夠隨著病毒的增殖而增加，而EKG系統中hyCuiP >2的表達量基本不受病毒的誘導；通過定量定量PCR檢測發現，在食下病毒量一致的情況下，在攻毒后48h，BmNPV病毒的拷貝數在EKG和正常932中沒有明顯區別，而在HEKG-B中的含量僅為正常932中的30%左右；經濟性狀調查結果顯示，EKG、HEKG和正常932各個系統的全繭量沒有區別，繭層率也沒有區別，說明表達外源如《/_印32基因沒有影響家蠶的經濟性狀。本發明通過使用39kP啟動子+Hr3增強子，成功表達外源如印32，并且使如印32的表達量隨著病毒含量的增加而增加，在顯著提高家蠶抗性的同時沒有影響其經濟性狀。實施例1 構建轉基因增量表達載體 pBac [39kP-^c -6'/732-SV40-3 X P3-EGFP afm]和 pBac [Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-3 X P3-EGFP afm]
(1)根據已經報道的BmNPV 39kP啟動子序列(如SEQ ID NO: 2所示)設計特異弓丨物，弓丨物序歹丨J 如下39kP F: 5' acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3' , 39kP R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'，設計的引物委托生工生物工程(上海)有限公司進行合成。以BmNPV基因組為模板，以設計的39kP F和39kP R為上下游引物進行PCR擴增，PCR反應條件為94 V預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、55 °C退火40秒、72 °C延伸20秒，共30個循環，最后72°C延伸10分鐘；PCR產物(如SEQ ID NO: 2所示)用5 //和及 /7/進行雙酶切，經瓊脂糖電泳鑒定并回收，得39kP酶切片段，同時用Sal I私BernH I酶切pSLfall80fa 載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得PSLfalISOfa載體酶切片段，連接39kP酶切片段和 pSLfallSOfa載體酶切片段，連接反應在T4 DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a，在含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，酶切鑒定片段大小，得含有 39kP 的 pSLfall80fa 載體(簡稱 39kP_1180)。(2)根據印32基因序列設計特異引物，引物序列如下:印32 F: 5’ cgggatccatgaagaaccaacaacag 3’，hycu~ep >2 R: 5’ atagtttagcggccgcttaatttattaac atatcaaag 3’，設計的引物委托生工生物工程(上海)有限公司進行合成。以HycuNPV基因組為模板，以設計的如《/-印32 F、hycu-印·為上下游引物進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、44°C退火40秒、72°C延伸50秒，共30個循環，最后72°C延伸10分鐘；PCR產物(如SEQ ID NO: 3所示)分別用BamH I私Not /進行雙酶切，經瓊脂糖電泳鑒定并回收，得如印32酶切片段，同時用/和Λ^ /酶切39kP-1180載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得pSLfall80fa-39kP載體酶切片段，連後hycu-印 >2酶切片段和pSLfall80fa-39kP載體酶切片段，轉化后篩選陽性克隆，得含有 hycu~ep >2基因和39kP啟動子的pSLfall80fa載體(簡稱39迚-如《/-印32-1180)。(3)用艙 /和Hind ///雙酶切已經含有SV40終止信號(如SEQ ID NO: 4所示)的 1180載體得到SV40酶切片段，同時用Afoi I琳Hind ///雙酶切39迚-如《/-印32-1180載體得到39迚-如《/-印32-1180酶切片段，將SV40酶切片段和39迚-如《/-印32-1180酶切片段進行連接轉化，篩選陽性克隆得到含有39kP啟動子、如印32基因和SV40終止信號的 pSLfall80fa 載體(簡稱 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180)。(4)將增強子Hr3序列(如SEQ ID NO: 1所示)用Afco /進行單酶切，回收得到Hr3酶切片段，同時將39kP-Aj^/-e/732-SV40-l 180用Afco /進行單酶切回收得到 39kP-A_F /-e/732-SV40-l 180 酶切片段，將 Hr3 酶切片段和 39kP-A_F /-e/732-SV40-l 180 酶切片段進行連接轉化，篩選陽性克隆，得到Hr3增強子、39kP啟動子、如印32基因和SV40 終止信號的 pSLfall80fa 載體(簡稱 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-1180)。(5)用限制性內切酶 Asc I 分別酶切 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 和Hr3-39kP-如《/-e/732-SV40-1180載體，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，得 39kP-A_F /-e/732-SV40 和 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段；同時用內切酶 Jse / 單酶切 PiggyBac[3Xp3 EGFP afm]，的 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]線性片段，然后對獲得 piggyBac [3 X p3 EGFP afm]線性片段 5，端去磷酸化，連接 39kP-A_F /-e/732-SV40 和 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]，轉化后篩選陽性克隆，得到重組載體pBac [39迚-如《/-印32-SV40-3XP3-EGFP afm] (pb-EKG)；將 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段和 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]連接轉化，篩選陽性克隆，得到重組載體pBac [Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-3XP3 -EGFP afm] (pb-HEKG)，如圖 1 所示。實施例2 轉基因顯微注射和陽性個體的篩選
(1)將家蠶932品種蠶卵浸酸(所用鹽酸比重為1.073，溫度為46°C，時間為5分鐘)解除滯育以后，放于15°C和80%濕度的黑暗環境中催青30天左右直至孵化，將蟻蠶收好置于標準環境中飼養(溫度25°C，濕度80%)，化蛾以后將雌雄蠶蛾交配4小時，拆對后產下的蠶卵為非滯育蠶卵，用于下一步的顯微注射；
(2)將產下的蠶卵在干凈的載玻片上排列整齊，在蠶卵產后2小時用Eppendorf顯微注射儀將Pb-EKG重組載體和輔助質粒A3H，一起注射進91粒932蠶卵中，用無毒膠水封口以后置于25°C、相對濕度80%的環境中催青10天左右孵化，將孵化的25頭GO代蟻蠶用桑葉收集飼養至化蛾，GO代蠶蛾通過自交或回交共獲得6蛾圈Gl代蠶卵，用Olympus 電動宏觀熒光顯微鏡觀察Gl胚胎篩選并獲得1個陽性蛾圈，即1個39kP啟動子介導的外源Hycu-EP32 蛋白表達的轉基因家蠶，簡稱EKG轉基因系統，轉化效率為16. 67% ；將含有pb-HEKG重組載體和輔助質粒A3H，一起注射進183粒932蠶卵中，共孵化47頭GO代蟻蠶，獲得13蛾圈Gl 代蠶卵，篩選得到8個陽性蛾圈，即8個Hr3+39kP啟動子介導的外源Hycu-EP32蛋白表達的轉基因家蠶，簡稱HEKG轉基因系統，轉化效率為61. 54%.(3 )將獲得的一個EKG陽性蛾圈和隨機選擇的兩個HEKG陽性蛾圈(HEKG-A和 HEKG-B)各自單蛾圈飼養，繼代擴大。實施例3 =RT-PCR檢測hycu-印說在EKG、HEKG和正常932中的表達量
(1)將實施例2制備的EKG、HEKG-A,HEKG-B和正常932進行正常飼養，在3齡起蠶、3 齡眠蠶、4齡起蠶和4齡眠蠶各取5頭幼蟲提取總RNA (Total RNA (Mini) Kit，Watson)， 用DNA酶消化處理后各自取4 μ g的RNA反轉錄成25 μ 1的cDNA，最后各自稀釋到100 μ 1 用于下步檢測。(2)利用家蠶內參基因特異引物 sw22934 F 5' ttcgtactggctcttctcgt 3', sw22934 R 5' caaagttgatagcaattccct 3'，取上述的 16 個 cDNA 模板各 1 μ 1 進行 RT-PCR 檢測，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸 10秒，共25個循環，最后72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2所示， 發現各個模板都擴增出目的條帶，而且條帶大小粗細程度比較均一，說明這16個cDNA模板是可用的。(3)利用印32 的特異檢測引物印32 QRT F: 5，acatcagaatacccatcacg 3，， 印32 QRT R: 5，attgttcaatggtaactccc 3，，取上述的 16 個 cDNA 模板各 1 μ 1 進行 RT-PCR 檢測，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸 10秒，共觀個循環，最后72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現除了正常932的4個模板，在EKG、HEKG-A和HEKG-B的所有模板中都擴增出目的條帶，如圖2所示。這個結果證明正常家蠶體內確實不含有如印32基因，而如印32基因成功在我們所制備的轉基因系統中表達。實施例4 轉基因系統的抗性檢測
(1)取轉基因系統EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932品種，在3齡起蠶時期以半致死劑量(3X IO5多角體/頭)單頭經口添食BmNPV病毒，4個系統各設置3個重復區，每個重復區 100頭蠶，同時每個系統設置3個不攻毒對照區，連續10天統計死亡率；
(2)抗性檢測結果如圖3所示，EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的死亡率分別為 55. 47%,24. 29%,24. 50%,50. 50%。轉基因系統EKG的死亡率和正常932系統沒有明顯區別； 轉基因系統HEKG-A和HEKG-B的死亡率明顯低于正常932系統，能降低26%左右的死亡率。(3)根據抗性檢測結果，我們發現增量表達外源Hycu-EP32蛋白確實能提高家蠶對BmNPV病毒的抗性，而且Hr3+39kP的啟動子效率明顯優于39kP的啟動子效率。實施例5 定量PCR檢測hycu-??？>2在攻毒后的的表達量變化情況
(1)在3齡起蠶(設為攻毒Oh)和攻毒后48h，EKG、HEKG-B和正常932每個系統各取10 頭蠶，提取總RNA然后反轉錄成cDNA。以如《/-印32基因的特異引物ep32 QRT進行定量PCR 檢測(試劑盒為 SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa ；定量PCR檢測儀器為 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System,Applied Biosystems ；按照試劑盒和儀器使用說明書進行操作);以家蠶看家基因BGIBMGA003186-TA作為內參，檢測引物為sw22934。(2)根據定量PCR的結果如圖4所示，我們發現在正常情況下，hycu-ep ,2在 HEKG-B中的表達量是EKG中的11. 9倍；在攻毒后48h，A_F /-e/732在EKG中的表達量為攻毒前的1. 3倍,hycm-印 >2在HEKG-B中的表達量為攻毒前的5. 4倍；在攻毒后4811，如《/-印32 在HEKG-B中的表達量為EKG中的48. 5倍。(3)從以上的定量PCR結果，我們可以看出，39kP啟動子被病毒誘導表達的能力很弱(1. 3倍)，導致EKG不能增強家蠶的抗性，這說明39kP啟動子單獨作為一個啟動子使用基本不具備應用價值；但是，如果把Hr3增強子和39kP啟動子聯合一起使用(Hr3+39kP)， 則可以明顯提高啟動子的活性，在正常情況下可以比較明顯的提高啟動子活性(增強11.9 倍)，更重要的是，Hr3+39kP在攻毒后的活性大大增加，達到了 39kP的48. 5倍。這些結果說明由于使用Hr3+39kP啟動子，我們的HEKG系統在正常情況下可以表達適量的印32，在攻毒后則隨著病毒量的增加而增加印32的表達量，這使HEKG系統的經濟性狀沒有受到影響， 同時還大大提高了抗性。實施例6 定量PCR檢測攻毒后各系統中BmNPV病毒的含量
(1)在攻毒后48h，EKG、HEKG-B和正常932每個系統各取10頭蠶提取總DNA。每個 DNA模板各取20 ng,以BmNPV病毒甜W基因的特異引物進行定量PCR檢測，引物為GP41 F: 5 ‘cgtagtagtagtaatcgccgc3‘, GP41 R: 5 ^agtcgagtcgcgtcgctttS',(試劑盒為 SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa ；定量 PCR 檢測儀器為 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System, Applied Biosystems ；按照試劑盒和儀器使用說明書進行操作)；以家蠶看家基因徹似/W為內參，引物為 BmGAPDH F: 5 ‘ gctgcctccttgaccttttgc3，，BmGAPDH R: 5 ‘ cattccgcgtccctgttgctaat 3'。(2)定量PCR的結果如圖5所示，正常932體內的病毒含量被設置為100%，EKG和 HEKG-B體內的病毒含量分別為110. 89%和28. 39%。從該圖我們可以發現，在食下病毒量一致的情況下，在攻毒后48h，BmNPV病毒的拷貝數在EKG和正常932中沒有明顯區別，而在 HEKG-B中的含量則遠遠低于正常932中的含量。(3) BmNPV病毒拷貝數的檢測結果說明，HEKG-B系統明顯抑制了 BmNPV病毒在其體內的復制增殖，這也解釋了為什么HEKG-B的死亡率明顯降低；EKG不能抑制病毒在其體內的增殖，所以不能降低死亡率。實施例7 調查轉基因系統的經濟性狀
(1) EKG、HEKG-A, HEKG-B和正常932各系統雌雄各自隨機抽取15顆繭，分別稱取每顆繭的全繭量和繭殼量。(2)統計的全繭量結果如圖6所示EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的全繭量分別為 1. 007g、l. 361g、l. 353、1. 197(雄)，和 1. 279g、1. 749g、1. 638g、1. 497g(雌)。結果顯示轉基因系統和正常932之間沒有明顯區別
(3)計算出的繭層率結果如圖7所示EKG、HEKG-A、HEKG-B和正常932的繭層率分別為 22. 21%, 23. 94%, 24. 49%, 23. 18% (雄)，禾口 19. 50%、19. 75%, 21. 20%, 20. 36% (雌)。結果也顯示轉基因系統和正常932之間沒有明顯區別。(4)以上調查結果顯示轉基因增量表達如印32不會影響家蠶的經濟性狀。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。
權利要求
1.增強子Hr3在提高hycu-印32蛋白表達量中的應用，所述增強子Hr3的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，增強子Hr3在介導39kP啟動子提高 hycu-印32蛋白表達量中的應用，所述39kP啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.增量表達載體，其特征在于，所述增量表達載體以轉座載體pBac[3XP3-EGFPafm] 為基礎載體，依次連接有增強子Hr3、39kP啟動子、如印32基因和終止信號序列。
4.根據權利要求3所述的增量表達載體，其特征在于，所述如《/_印32基因為如《/-印32基因全長序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根據權利要求3所述的增量表達載體，其特征在于，所述終止信號序列為SV40，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
6.權利要求3所述的增量表達載體的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟A) 39kP-1180載體的構建將如SEQ ID NO: 2所示的39kP啟動子用Sal I和BamH I進行雙酶切，得39kP啟動子酶切片段，同時用Sal I私BamH I酶切pSLfall80fa載體，得pSLfall80fa載體酶切片段，連接39kP酶切片段和pSLfalISOfa載體酶切片段，得39kP_1180載體；B ) 39kP-^cw-6'/732-1180 載體的構建將核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的hycu-ep22基因分別用BamH /和Not I 進行雙酶切，■ hycu-印 >2酶切片段，同時用I和Λ^ I酶切39kP-1180載體，得 pSLfal 180fa-39kP載體酶切片段，連接如《/_印32酶切片段和pSLfal 180fa_39kP載體酶切片段，得39迚-如《/-印32-1180載體；C ) 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180 載體的構建Not /和歷///雙酶切含有如SEQ ID Ν0:4所示的終止信號的1180載體，得到終止信號酶切片段，同時用Λ^ I私Hind ///雙酶切步驟B所得39沙-如《/-印32-1180載體，得到39迚-如《/-印32-1180酶切片段，將終止信號酶切片段和39迚-如《/-印32-1180酶切片段進行連接，得 39kP-A_F /-e/732-SV40-1180,如 SEQ ID NO:5 所示；D)Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-l 180將如SEQ ID NO: 1所示增強子Hr3用Afco /進行單酶切，得增強子Hr3酶切片段，同時將步驟C所得的39kP-A_F /-e/732-SV40-1180用Afco /進行單酶切，得39kP-A_F /-印32-SV40-1180酶切片段，將所述增強子Hr3酶切片段和 39kP-^cw-6'/732-SV40-l 180 酶切片段進行連接，得 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-1180，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；E)pBac [Hr3-39kP-^cw-6'/732-SV40-3 X P3-EGFP afm]的構建用限制性內切酶Jm /酶切步驟D所得Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40-l 180載體， 得 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段；同時用內切酶Asc / 單酶切 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]，得 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]線性片段，將 Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV40 片段和 piggyBac [3 Xp3 EGFP afm]連接，得增量表達載體，命名為 pBac[Hr3-39kP-A_F /-e/732-SV4 0-3XP3-EGFP afm]。
7.根據權利要求6所述的增量表達載體的制備方法，其特征在于，步驟Α)中，如SEQID N0:2所示的39kP啟動子的獲得方式如下設計特異引物，39kP的上游引物為5’ acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3' , 39kP 的下游弓|物為R: 5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'；以BmNPV基因組為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C 變性40秒、55°C退火40秒、72°C延伸20秒，共30個循環，最后72°C延伸10分鐘。
8.根據權利要求6所述的增量表達載體的制備方法，其特征在于，步驟B)中，如SEQ ID N0:3所示的如印32的獲得方式如下如印32基因序列設計特異引物，上游引物為5' cgggatccatgaagaaccaacaacag 3' , T"￠1^141 5' atagtttagcggccgcttaatt tattaacatatcaaag 3'；以HycuNPV基因組為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、44°C退火40秒、72°C延伸50秒，共30個循環，最后72°C 延伸10分鐘。
9.權利要求3所述的增量表達載體在制備家蠶核型多角體病毒抗性增效劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及家蠶的轉基因技術，具體為增強子Hr3在提高hycu-ep32蛋白表達量中的應用；所述增量表達載體以轉座載體pBac[3×P3-EGFPafm]為基礎載體，依次連接有增強子Hr3、39kP啟動子、hycu-ep32基因和終止信號序列；本發明轉基因增量表達外源抗病毒蛋白制備抗BmNPV家蠶品種，首次通過在滯育家蠶品種中轉基因增量表達外源抗性蛋白提高家蠶的抗性；其在發育的各個時期均能表達Hycu-EP32蛋白，克服正常家蠶不表達Hycu-EP32的缺陷，有利于家蠶在各個時期都能利用Hycu-EP32蛋白來抑制病毒的增殖；該蛋白的表達量隨著病毒量的增加而增加，所以能最大程度減少表達外源蛋白對家蠶正常生理活動和經濟性狀的影響，同時還能顯著提高家蠶的抗性。
文檔編號A01K67/04GK102492691SQ20111042327
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者夏慶友, 徐漢福, 王根洪, 程廷才, 蔣亮, 金盛凱 申請人:西南大學