專利名稱：粗柄雞樅菌種的快速制備方法
技術領域：
本發明涉及一種珍稀野生食用菌粗柄雞揪(Termitomyces robustus (Beeli.) Heim)的菌種制備方法，屬于生物技術領域，具體地說是屬于大型真菌菌絲體室內人工培養范疇。
背景技術：
雞揪菌屬(Termitomyces)隸屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina )、層菌綱( Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、口蘑禾斗(Tricholomataceae)，因與白蟲義有共生關系，又名蟻巢傘屬。雞揪，又名雞宗(棕)、傘把菇、雞肉絲菇、白蟻菇等，它是云南省一種名貴特產野生食用菌，也是世界上一種著名的美味食用菌，其營養豐富，肉質細嫩，味道鮮美，且具有明顯的藥理作用，深受國內外消費者的喜好及青睞。國內的雞揪菌主要分布于云南，有報道指出，中國雞揪菌約M種，其中云南達20種，但近年來由于生態破壞及過度的采挖，云南的雞揪菌價格一漲再漲，每公斤鮮重售價在300-450元。
自1799 K0ning對蟻巢內菌圃的發現和描述算起，人們對雞揪菌的科學研究已有兩百多年的歷史，對雞揪菌的認識也不斷深入，但至今為止，其人工培養仍然難以攻克，尚未見規模化成功栽培的例子。由于雞揪菌的珍稀及寶貴，其人工馴化栽培一直是科研工作者奮斗的終極目標。目前人工栽培的研究仍然存在較多問題，其中菌絲在人工培養基上生長極其緩慢、難以擴繁、難以批量生產菌種等仍是一個主要問題，它是制約或影響人工培養的前提或基礎。粗柄雞揪是云南的一個主產種，分布于云南的富民、祿勸、武定等地，本發明征對其菌絲培養問題進行了重點突破。發明內容
本發明的目的在于，提供一種簡單，生產成本低，能使雞揪菌絲快速生長及擴繁的固體菌種制備方法。
實現本發明的技術方案以未開傘的子實體為材料，通過菌絲體誘導、菌絲體擴大培養及其快速繁殖等途徑制備栽培種，實現本發明的主要步驟如下(1)材料的選擇野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗狀、菌蓋較肥厚的成熟子實體；(2)材料的消毒及處理將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 20 0. 40cm2的小塊；(3)菌絲體誘導將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面母種培養基表面，母種培養基為馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50 1. OOg /L、KH2PO4 0. 40 0. 60g/L、NH4N03 0. ；35 0. 45g/L、KN03 0. ；35 0. 45g /L、維生素B1 2. 00 2. 50mg/ L、瓊脂12. 00g/L,控制PH值為4. 0 4. 5，培養溫度為24 ~26°C,暗培養14 18天，原組織塊上萌生少量白色的菌絲，菌絲逐漸增多呈球狀，覆蓋原組織塊，35 40天，菌絲聚集成顆粒狀、小團塊狀，色澤加深，漸變成淺褐色；(4)菌絲體擴大培養將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，將其輕輕嵌入500ml三角瓶的擴大培養基表面，培養基為馬鈴薯150. 00 180. 00g/L、葡萄糖 8. 00 10. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50 1. 00g /L、KH2PO4 0. 40 0. 60g/L、NH4NO3 0. 35 0. 45g/L、KN03 0. 35 0. 45g/L、維生素 B1 2. 00 2. 50mg/L、麥芽汁(15. 0 波美) 150 180ml，谷氨酸0. 10 0. 20g/L,瓊脂12. 00g/L,控制PH值為4. 0 4. 5，培養溫度為 24 ，暗培養40 45天，菌絲基本長滿三角瓶；(5)固體栽培種的制作將以上長勢良好的原種菌絲體挑出，轉接入栽培種的袋裝固體培養基中，栽培種培養基為原生境土壤35 45%、麥麩35 45%、蔗糖3. 0 3. 5%、石膏 2. 0 2. 5%、尿素1. 0 2. 0%、草木灰2. 5 3. 0%、羊糞5 10%、牛糞5 10%，將以上原料混均，調節含水量為52 56%，PH值為4. 0 4. 5，得固體培養基，將其分裝于塑料菌種袋中，每袋裝約700ml，120°C滅菌60min，冷卻后備用，培養溫度為M ^°C，暗培養60 70天，菌絲長滿培養袋。
本發明的有益效果是采用比較簡單的培養基，使菌絲在短期內快速增殖，其特點如下，(1)培養基簡單、生產成本低本發明使用的幾種培養基都比較簡單，母種培養基在 PDA基本培養基上主要增加了鉀鹽及無機氮，擴大培養基在母種培養基的基礎上，只添加了麥芽汁、谷氨酸，栽培種培養基主要利用原生境土及麥麩，三種培養基的成本都很低，這一點非常重要，其關系到以后的生產規模及推廣使用等問題；(2)周期短本發明克服了菌絲在固體培養基上生長速度緩慢、難以擴繁等問題，培養周期大大縮短；(3)便于推廣所培養的固體栽培種方便推廣和使用。
具體實施方式
以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
實例一野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗狀、菌蓋較肥厚的成熟子實體； 將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 20 0. 40cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面母種培養基表面，母種培養基為馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO30.35g/L, KNO3 0. 35g /L、維生素 B1 2. 50mg/L、瓊脂 12. 00g/L，控制 PH 值為 4. 5，培養溫度為^TC，暗培養15天，原組織塊上萌生少量白色的菌絲，菌絲逐漸增多呈球狀，覆蓋原組織塊，35天，菌絲聚集成顆粒狀、小團塊狀，色澤加深，漸變成淺褐色；將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，將其輕輕嵌入500ml三角瓶的擴大培養基表面，培養基為馬鈴薯150. 00g/L、葡萄糖8. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl21.00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g/L、維生素 B1 2. 50mg/L、麥芽汁(15. 0波美)180ml，谷氨酸0. 20g/L,瓊脂12. 00g/L,控制PH值為4. 5，培養溫度為26°C，暗培養40天，菌絲基本長滿三角瓶；將以上長勢良好的原種菌絲體挑出，轉接入栽培種的袋裝固體培養基中，栽培種培養基為原生境土壤45%、麥麩35%、蔗糖3. 5%、石膏2. 5%、尿素1. 0%、草木灰3. 0%、羊糞5%、牛糞5%，將以上原料混均，調節含水量為52%，PH值為4. 5，得固體培養基，將其分裝于塑料菌種袋中，每袋裝約700ml，120°C滅菌60min，冷卻后備用，培養溫度為^°C，暗培養60天，菌絲長滿培養袋。
實例二野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗狀、菌蓋較肥厚的成熟子實體； 將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 20 0. 40cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面母種培養基表面，母種培養基為馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50g/L、KH2PO4 0. 60g/L、NH4NO3 0. 45g/L、KN03 0 . 45g /L、維生素 B1 2. 00mg/L、瓊脂 12. 00g/L，控制 PH 值為 4. 5，培養溫度為25°C，暗培養18天，原組織塊上萌生少量白色的菌絲，菌絲逐漸增多呈球狀，覆蓋原組織塊，38天，菌絲聚集成顆粒狀、小團塊狀，色澤加深，漸變成淺褐色；菌絲體擴大培養將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，將其輕輕嵌入500ml三角瓶的擴大培養基表面，培養基為馬鈴薯180. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、 MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50g /L、KH2PO4 0. 60g/L、NH4NO3 0. 45g/L、KNO3 0. 45g/L、維生素 B1 2. OOmg/L、麥芽汁(15. 0 波美)150ml，谷氨酸 0. 15g/L，瓊脂 12. OOg/L,控制 PH 值為 4. 5， 培養溫度為25°C，暗培養45天，菌絲基本長滿三角瓶；固體栽培種的制作將以上長勢良好的原種菌絲體挑出，轉接入栽培種的袋裝固體培養基中，栽培種培養基為原生境土壤35%、麥麩45%、蔗糖3. 0%、石膏2. 0%、尿素1. 5%、草木灰2. 5%、羊糞6%、牛糞5%，將以上原料混均，調節含水量為56%，PH值為4. 5，得固體培養基，將其分裝于塑料菌種袋中，每袋裝約700ml，120°C滅菌60min，冷卻后備用，培養溫度為 25 °C，暗培養65天，菌絲長滿培養袋。
實例三野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗狀、菌蓋較肥厚的成熟子實體； 將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 20 0. 40cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面母種培養基表面，母種培養基為馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 80g /L、KH2PO4 0. 40g/L、NH4NO3 0.40g/L、KN03 0 . 40g /L、維生素 B1 2. 20mg/L、瓊脂 12. 00g/L，控制 PH 值為 4. 0，培養溫度為M°C，暗培養17天，原組織塊上萌生少量白色的菌絲，菌絲逐漸增多呈球狀，覆蓋原組織塊，40天，菌絲聚集成顆粒狀、小團塊狀，色澤加深，漸變成淺褐色；將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，將其輕輕嵌入500ml三角瓶的擴大培養基表面，培養基為馬鈴薯170. 00g/L、葡萄糖9. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl20. 80g /L、KH2PO4 0. 40g/L、NH4NO3 0. 40g/L、KNO3 0. 40g/L、維生素 B1 2. 20mg/L、麥芽汁 (15.0波美)170ml，谷氨酸0. 10g/L，瓊脂12. 00g/L，控制PH值為4.0，培養溫度為24°C, Hf 培養42天，菌絲長滿三角瓶；將以上長勢良好的原種菌絲體挑出，轉接入栽培種的袋裝固體培養基中，栽培種培養基為原生境土壤40%、麥麩40%、蔗糖3. 0%、石膏2. 0%、尿素2. 0%、草木灰3. 0%、羊糞5%、牛糞5%，將以上原料混均，調節含水量為M%，PH值為4. 0，得固體培養基，將其分裝于塑料菌種袋中，每袋裝約700ml，120°C滅菌60min，冷卻后備用，培養溫度為M°C，暗培養70天，菌絲長滿培養袋。
實例四野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗狀、菌蓋較肥厚的成熟子實體； 將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 20 0. 40cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面母種培養基表面，母種培養基為馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1. 00g /L、KH2PO4 0. 40g/L、NH4NO30.45g/L、KN03 0 . 45g /L、維生素 B1 2. 00mg/L、瓊脂 12. 00g/L，控制 PH 值為 4. 2，培養溫度為25°C，暗培養14天，原組織塊上萌生少量白色的菌絲，菌絲逐漸增多呈球狀，覆蓋原組織塊，37天，菌絲聚集成顆粒狀、小團塊狀、色澤加深，漸變成淺褐色；將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，將其輕輕嵌入500ml三角瓶的擴大培養基表面，培養基為馬鈴薯180. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、MgS04l. 00g/L,CaCl21.00g /L、KH2PO4 0. 40g/L、NH4NO3 0. 45g/L、KNO3 0. 45g/L、維生素 B1 2. OOmg/L、麥芽汁 (15. 0波美)160ml，谷氨酸0. 20g/L,瓊脂12. OOg/L,控制PH值為4. 2，培養溫度為25°C，暗培養44天，菌絲長滿三角瓶；將以上長勢良好的原種菌絲體挑出，轉接入栽培種的袋裝固體培養基中，栽培種培養基為原生境土壤38%、麥麩37%、蔗糖3. 5%、石膏2. 5%、尿素1. 0%、草木灰3. 0%、羊糞8%、牛糞7%，將以上原料混均，調節含水量為55%，PH值為4. 2，得固體培養基，將其分裝于塑料菌種袋中，每袋裝約700ml，120°C滅菌60min，冷卻后備用，培養溫度為25°C，暗培養63天，菌絲長滿培養袋。
權利要求
1.一種珍稀野生食用菌粗柄雞揪(Termitomyces robustus (Beeli. )Heim)菌種制作的方法，其特征為，采用未開傘的子實體誘導菌絲，對菌絲體進行優化擴大培養，使其快速地大量繁殖，主要包括下列步驟(1)材料的選擇野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘、菌柄較粗狀、菌蓋較肥厚的成熟子實體；(2)材料的消毒及處理將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為二，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 20 0. 40cm2的小塊；(3)菌絲體誘導將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面母種培養基表面，培養溫度為M ^TC,暗培養14 18天，原組織塊上萌生少量白色的菌絲，菌絲逐漸增多呈球狀， 覆蓋原組織塊，35 40天，菌絲聚集成顆粒狀、小團塊狀，色澤加深，漸變成淺褐色；(4)菌絲體擴大培養將以上試管中長勢良好的菌絲體挑出，剔除上面的培養基，將其輕輕嵌入500ml三角瓶的擴大培養基表面，培養溫度為M ，暗培養40 45天，菌絲基本長滿三角瓶；(5)固體栽培種的制作將以上長勢良好的原種菌絲體挑出，轉接入栽培種的袋裝固體培養基中，培養溫度為M ^°C，暗培養60 70天，菌絲長滿培養袋。
2.根據權利要求1所述的雞揪菌種制作方法，其特征在于步驟(3)中的母種培養基為馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50 1. 00g /L、KH2PO40.40 0. 60g/L、NH4N03 0. ；35 0. 45g/L、KN03 0. ；35 0. 45g /L、維生素B1 2. 00 2. 50mg/ L、瓊脂12. 00g/L，控制PH值為4. 0 4. 5。
3.根據權利要求1所述的雞揪菌種制作方法，其特征在于步驟(4)中的擴大培養基為馬鈴薯 150. 00 180. 00g/L、葡萄糖 8. 00 10. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50 1.00g /L, KH2PO4 0. 40 0. 60g/L、NH4NO3 0. 35 0. 45g/L、KNO3 0. 35 0. 45g/L、維生 SB1 2. 00 2. 50mg/L、麥芽汁(15. 0 波美)150 180ml，谷氨酸 0. 10 0. 20g/L，瓊脂 12. 00g/L,控制 PH 值為 4. 0 4. 5。
4.根據權利要求1所述的雞揪菌種制作方法，其特征在于步驟(5)中的栽培種培養基為原生境土壤；35 45%、麥麩；35 45%、蔗糖3. 0 3. 5%、石膏2. 0 2. 5%、尿素1. 0 .2.0%、草木灰2. 5 3. 0%、羊糞5 10%、牛糞5 10%，將以上原料混均，調節含水量為52 56%，PH值為4. 0 4. 5，得固體培養基，將其分裝于塑料菌種袋中，每袋裝約700ml，120°C 滅菌60min，冷卻后備用。
全文摘要
本發明涉及一種珍稀名貴野生食用菌粗柄雞樅的菌種制備方法，屬于大型真菌培養技術領域。其特征為以未開傘的子實體為材料，通過菌絲體誘導、菌絲體擴大培養及快速繁殖等途徑制備固體栽培種。雞樅菌絲比較特殊，在固體培養基上生長極其緩慢、難以擴繁、更難以在栽培基質中生長，難以生產批量菌種，這是制約或影響人工培養的因素之一。本發明以云南的主產種粗柄雞樅為例，對菌絲的固體培養技術進行了創新性突破，使菌絲能快速生長繁殖，培養周期大大縮短，且生產出了袋裝栽培種。本發明所使用的母種、擴大及栽培種三種培養基，成份簡單易得，成本低，便于推廣，如栽培種培養基主要利用原生境土及麥麩，這為今后人工馴化栽培等提供了條件。
文檔編號C05G3/00GK102487726SQ201110431260
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者張麗萍, 張曦予, 李宗菊, 李文蓮, 楊振升, 陶喬雙 申請人:云南大學