專利名稱：一種淀粉基質專用水稻的轉基因培育方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種淀粉基質專用水稻的轉基因培育方法。
背景技術：
全國組織培養(yǎng)室超過1000個，組織培養(yǎng)技術廣泛用于農作物、果樹、蔬菜、林木、觀賞植物及中藥材等近400種經濟植物，在快繁和脫毒等方面取得了巨大的社會經濟效益。因成本過高，組織培養(yǎng)的商業(yè)利用受極大限制，無法符合市場對高質量組培苗、低價位成本的需求。因此，降低成本是組培技術更成功商品化的首要條件。在降低組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基成本方面，多采用增加繁殖系數(shù)的方法，但繁殖系數(shù)的增加導致組培苗質量的降低，不但玻璃苗的比例顯著提高，而且嚴重影響其后續(xù)的生長。瓊脂是目前各種生物培養(yǎng)基中應用最廣泛的一種凝固劑，不僅用量巨大且是所有藥品中最貴的一種，占藥品成本的70%以上。僅組培級瓊脂的市場價就高達160元/kg以上，常用的成本每升就高達8元以上。淀粉是植物體中貯存的養(yǎng)分，是食物的重要組成部分，水稻中含淀粉629Γ86%，但普通水稻品種的淀粉凝固抗性很低，膠體結構不穩(wěn)定，難以直接或改性利用。直鏈淀粉在水中加熱糊化后，不穩(wěn)定且會迅速老化而逐步形成凝膠體，但這種凝膠體較硬，需高溫才反向轉化；支鏈淀粉在水溶液中穩(wěn)定，凝膠柔軟，且凝膠其強度隨溫度變化是可逆的。淀粉分支酶基因sbenb是調控淀粉合成的關鍵酶，可以優(yōu)化促進直鏈淀粉的合成，實現(xiàn)直鏈淀粉及其凝膠特性的顯著改良。

發(fā)明內容
正是在上述背景下，本發(fā)明的目的是提供一種淀粉基質專用水稻的轉基因培育方法，選用低直鏈淀粉含量秈稻為基礎，通過淀粉分支酶基因優(yōu)化促進直鏈淀粉的合成，獲得淀粉凝膠性能兼顧直鏈與支鏈雙重特性的水稻，創(chuàng)制高凝抗性且膠體結構穩(wěn)定的新型淀粉基質，替代瓊脂，發(fā)展新型生物培養(yǎng)生物基質，
廣泛用于科研、醫(yī)學和化工。本發(fā)明的淀粉基質專用水稻的轉基因培育方法，包括以下步驟
1)取直鏈淀粉含量介于109Γ15%的水稻品種的成熟胚為外植體，接種至誘導培養(yǎng)基，在25士 1°C、光強3000勒克司光條件下誘導形成愈傷組織；
2)將誘導形成2周的愈傷組織，轉移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進入成倍增殖期；
3)將成倍增殖的愈傷組織，在25士1°C、避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養(yǎng)2天；
4)將經過預培養(yǎng)的愈傷組織，在農桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25士 1°C、避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；
5)將上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉移到篩選培養(yǎng)基，在25士1°C、避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；
6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉移至分化培養(yǎng)基，在25士1°C、光強3000勒克司光條件下誘導分化成苗，對抗性植株進行組織化學染色和分子檢測，選留含目的基因插入序列的的轉基因植株，所說的目的基因插入序列是指包括目的基因淀粉分支酶基因sbellb、標記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因淀粉分支酶基因sbenb片段長64;3bp ；
7)取入選的轉基因植株，田間種植后收獲種子，鑒定淀粉凝膠性能，選留淀粉糊化冷卻后可形成半固態(tài)凝膠的轉基因植株；
8)繼續(xù)種植步驟7)篩選的轉基因株系，評價的淀粉凝抗性表達穩(wěn)定性，對淀粉凝抗性穩(wěn)定的優(yōu)良株系進行種子繁殖，為培育的淀粉基質專用水稻。本發(fā)明中，所說的誘導培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5.8。本發(fā)明中，所說的繼代培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D Img蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前 5. 8。本發(fā)明中，所說的共培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0. 5mg、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。本發(fā)明中，所說的篩選培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0. 5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。本發(fā)明中，所說的分化培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加6-BAlmg、NAA0. 5mg、KT0. 5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。上述的N6 基本培養(yǎng)基為 KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 1. 5mg、FeSO4 · 7H2027. 8mg, Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg, H3BO3 1. 6mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、維生素Bl 0. 5mg和甘氨酸ang。本發(fā)明中，所說的農桿菌的菌株為EHA105，內含質粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA區(qū)域攜帶目的基因的插入序列，包括淀粉分支酶基因sbenb、標記基因葡糖苷酸酶基因⑶S和篩選基因抗潮霉素基因HPT。淀粉分支酶基因sbenb片段長64;3bp，與玉米啟動子W3i-l、35S和nos終止子共同構成表達框架。菌株為EHAlO方便購買或贈送獲得，在一般植物遺傳實驗室均有保存，參見文獻吳關庭等，中國農業(yè)科學，2005，38 (12) :2395-對02。本發(fā)明中，所說的標記基因葡糖苷酸酶基因⑶S的組織化學染色方法參見Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989，(6): 168-169，篩選基因抗潮霉素基因HPT的分子檢測方法參見文獻吳關庭等，中國農業(yè)科學，2005，38 (1 :2395_對02。本發(fā)明中，所說的淀粉凝膠性能的測定方法，參見文獻杜先鋒等，農業(yè)工程學報，2001，17(2): 16-19。上述的穩(wěn)定性是指入選水稻中抗性淀粉含量在不同年份間(2年以上)、季節(jié)間(2季以上)以及地點間(2個地點以上)的含量變化不顯著。本發(fā)明的淀粉基質專用轉基因水稻，具有以下優(yōu)點
本發(fā)明首先利用淀粉分支酶基因sbenb針對性優(yōu)化調控直鏈淀粉含量109Γ15%水稻的淀粉回生特性。這種轉基因水稻的淀粉，具有良好的凝膠特性，與普通水稻、玉米、小麥等淀粉類作物的普通品種的淀粉凝抗性完全不同，可作為新穎生物培養(yǎng)基質，廣泛用于科研、食品、醫(yī)藥和化工。


圖1是本發(fā)明所用的目的基因插入序列的載體構建示意圖。
具體實施例方式以下通過具體實例進一步說明本發(fā)明。實施例1
以直鏈淀粉含量13. 6%水稻品種“嘉育948”的成熟胚為外植體，接種至誘導培養(yǎng)基，在25 士 1°C、光強3000勒克斯光條件下誘導形成愈傷組織；
將誘導形成2周的愈傷組織，轉移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進入成倍增殖
期；
將成倍增殖的愈傷組織，在25士 1°C、避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養(yǎng)2
天；
將經過預培養(yǎng)的愈傷組織(約500個培養(yǎng)皿，含2000塊以上的愈傷組織)，在農桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25士 1 °C、避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；
取上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉移到篩選培養(yǎng)基，在25士 1°C、避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長出的抗性愈傷組織(約210塊愈傷組織)，轉移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；
取3輪篩選后的抗性愈傷組織(約50塊愈傷組織)，轉移至分化培養(yǎng)基，誘導分化成苗78株，對抗性植株進行標記基因GUS組織化學染色和篩選基因HPT分子檢測，選留含目的基因淀粉分支酶基因sbenb插入序列的轉基因植株56株，目的基因插入序列的載體構建如圖1所示；
取入選的轉基因植株，田間種植后收獲種子，測定淀粉凝膠性能，選留淀粉糊化冷卻后可形成半固態(tài)凝膠的轉基因植株11株；
2008-2010連續(xù)3年，分別在浙江杭州(春季)、浙江富陽(夏季)、海南陵水(冬季)三地三季評價淀粉凝抗性的表達穩(wěn)定性，最終培育淀粉基質專用水稻3個，T-NJ-U T-NJ-2、T-NJ-3，其淀粉糊化冷卻后可形成穩(wěn)定的半固態(tài)凝膠，而原直鏈淀粉含量水稻品種“嘉育948”則根本無法形成半固態(tài)的凝膠。
權利要求
1.一種淀粉基質專用水稻的轉基因培育方法，包括以下步驟1)取直鏈淀粉含量介于109Γ15%的水稻品種的成熟胚為外植體，接種至誘導培養(yǎng)基，在25 士 1°C、光強3000勒克司光條件下誘導形成愈傷組織；2)將誘導形成2周的愈傷組織，轉移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進入成倍增殖期；3)將成倍增殖的愈傷組織，在25士1°C、避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養(yǎng)2天；4)將經過預培養(yǎng)的愈傷組織，在農桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25士 1°C、避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；5)將上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉移到篩選培養(yǎng)基，在25士1°C、避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉移至分化培養(yǎng)基，在25士1°C、光強3000勒克司光條件下誘導分化成苗，對抗性植株進行組織化學染色和分子檢測，選留含目的基因插入序列的轉基因植株，所說的目的基因插入序列是指包括目的基因淀粉分支酶基因sbenb、標記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因淀粉分支酶基因sbellb片段長643bp ；7)取入選的轉基因植株，田間種植后收獲種子，鑒定淀粉凝膠性能，選留淀粉糊化冷卻后可形成半固態(tài)凝膠的轉基因植株；8)繼續(xù)種植步驟7)篩選的轉基因株系，評價的淀粉凝抗性表達穩(wěn)定性，對淀粉凝抗性穩(wěn)定的優(yōu)良株系進行種子繁殖，為培育的淀粉基質專用水稻。
2.根據(jù)權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的誘導培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
3.根據(jù)權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的繼代培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D Img蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
4.根據(jù)權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的共培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0. 5mg、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g、和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前 5. 8。
5.根據(jù)權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的篩選培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0.5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH 滅菌前 5. 8。
6.根據(jù)權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的分化培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加6-BAlmg、NAAO. 5mg、KTO. 5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前 5. 8。
7.根據(jù)權利要求2-6所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的N6基本培養(yǎng)基為 KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 1. 5mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg, Na2-EDTA · 2H2037. 3mg,H3BO3 1. 6mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、維生素 Bl 0. 5mg 和甘氨酸2mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種淀粉基質專用水稻的轉基因培育方法，步驟包括取低直鏈淀粉含量的水稻品種的成熟胚為外植體，誘導愈傷組織，繼代培養(yǎng)至成倍增殖期，暗條件預培養(yǎng)，進行農桿菌共培養(yǎng)轉化，轉移到篩選培養(yǎng)基進行3輪篩選，取抗性愈傷組織誘導分化成苗，對抗性植株進行組織化學染色和分子檢測，鑒定含目的基因的分化小苗，對入選的轉基因植株測定淀粉凝膠性能，選留淀粉糊化冷卻后可形成半固態(tài)凝膠的轉基因植株，繼續(xù)種植評價的淀粉凝抗性表達穩(wěn)定性，對淀粉凝抗性穩(wěn)定的優(yōu)良株系進行種子繁殖，最終培育淀粉基質專用水稻。本發(fā)明的淀粉基質專用水稻，可作為新穎生物培養(yǎng)基質，廣泛用于科研、食品、醫(yī)藥和化工。
文檔編號A01H4/00GK102550414SQ20121000510
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權日2012年1月10日
發(fā)明者吳殿星, 張寧, 舒小麗 申請人:浙江大學