專利名稱：一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法
技術領域：
本發明涉及一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法。
背景技術：
據衛生部的統計，2010年我國糖尿病患者約9200萬人，占我國總人口的9. 3%，耐糖量低人群更是高達1. 42億人。糖尿病等血液系統慢性疾病正在呈現出快速增長、向農村蔓延、低齡化的演變趨勢，越來越嚴重地影響著人類社會的生存和發展(第一大生命殺手，嚴重影響生命質量，年醫療費用高達千億元)，而且目前尚無根治之法。醫學研究表明除遺傳因素外，糖尿病等血液系統慢性疾病主要起因于日常飲食起居等生活習慣，而高糖、高脂肪、高蛋白的飲食結構則是罪魁禍首，尤其是高糖這一“元兇”。稻米主食“高糖”的核心在于可消化淀粉的比例過高(導致貪食、肥胖和高血糖)，而抗性淀粉的比例過低(目前一般秈稻米的抗性淀粉含量僅為1%，粳稻的含量僅有0. 1%，而達到現代人健康需求的含量應為10%)。因此，依照我國傳統“藥食同源”、“寓藥于食”的理念，預防糖尿病等高危慢性病的發生，改進病患者生活質量的重要途徑是改善一日三餐的大米營養構成，而培育滿足人們健康需求的美味口感與功能性水稻品種則是這一途徑的根本。高抗性淀粉含量專用水稻品種選育與開發是吃出健康的關鍵和核心。抗性淀粉的形成，不僅與水稻本身的直連淀粉含量有關，且與支鏈淀粉的鏈長結構密切相關。淀粉去分支酶基因ISA是調控淀粉合成的關鍵酶，可以優化支鏈淀粉鏈長的精細結構，實現顯著提高抗性淀粉的含量。正是在上述背景下，本發明提出一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法，旨在選用中等直鏈淀粉含量秈稻為基礎，通過淀粉去分支酶基因優化調控支鏈淀粉的鏈長結構，培育獲得高抗性淀粉含量水稻，用于糖尿病專用產品的開發，這對糖尿病人群實施飲食療法具有重要意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法，以獲得高抗性淀粉含量水稻，用于糖尿病專用產品的開發，實施飲食療法從源頭預防和控制糖尿病。本發明的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，包括以下步驟
1)取直鏈淀粉含量20% 25%水稻品種的成熟胚為外植體，接種至誘導培養基，在25 士 1°C、光強3000勒克司光條件下誘導形成愈傷組織；
2)將誘導形成2周的愈傷組織，轉移至繼代培養基，繼代培養至愈傷組織進入成倍增
殖期；
3)將成倍增殖的愈傷組織，在25士1°C避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養
2天；
4)將經過預培養的愈傷組織，在農桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養基上，在25士 1°C避光的黑暗條件下共培養2天；
5)將上述共培養愈傷組織，洗凈、晾干后，轉移到篩選培養基，在25士1°C避光的黑暗條件下培養6周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉移至新的篩選培養基上，再進行連續2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；
6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉移至分化培養基，在25士1°C、光強3000勒克司光條件下誘導分化成苗，對抗性植株進行組織化學染色和分子檢測，選留含目的基因插入序列的轉基因植株，所說的目的基因插入序列是指目的基因淀粉分支酶基因ISA1、標記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因淀粉分支酶基因ISAl 片段長 570bp ；
7)取入選的轉基因植株，田間種植后收獲種子，測定抗性淀粉含量，選留抗性淀粉含量高于10%的轉基因植株；
8)繼續種植步驟7)篩選的轉基因株系，評價抗性淀粉含量的表達穩定性，繁殖抗性淀粉含量穩定高于10%的優良株系，為培育的高抗性淀粉含量水稻。本發明中，所說的誘導培養基為N6基本培養基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5.8。本發明中，所說的繼代培養基為N6基本培養基添加2，4-D Img蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前 5. 8。本發明中，所說的共培養基為N6基本培養基添加2，4-D 0. 5mg、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。本發明中，所說的篩選培養基為N6基本培養基添加2，4-D 0. 5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。本發明中，所說的分化培養基為N6基本培養基添加6-BAlmg、NAA0. 5mg、KT0. 5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。上述的 N6 基本培養基為 KNO3 2830mg, (NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 1. 5mg、FeS04 · 7H2027. 8mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg、H3B03 1. 6mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、維生素Bl 0. 5mg和甘氨酸ang。本發明中，所說的農桿菌的菌株為EHA105，內含質粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA區域攜帶目的基因插入序列，包括目的基因淀粉分支酶基因ISA1、標記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT。目的基因淀粉分支酶基因ISAl片段長570bp，與玉米啟動子W^i-I和nos終止子共同構成表達框架。菌株為EHAlO方便購買或贈送獲得，在一般植物遺傳實驗室均有保存，參見文獻吳關庭等，中國農業科學，2005，38 (12) :2395-2402.上述的標記基因葡糖苷酸酶基因⑶S的組織化學染色方法參見Rueb和Hensgens.Rice Genetics Newsletters, 1989，(6): 168-169，篩選基因抗潮霉素基因 HPT 的分子檢測方法參見文獻吳關庭等，中國農業科學，2005，38 (12) :2395-對02。本發明中，所說的抗性淀粉含量檢測方法，參見文獻楊朝柱等，中國水稻科學，2005，19 (6): 516-520。上述的穩定性是指入選水稻中抗性淀粉含量在不同年份間(2年以上)、季節間(2季以上)以及地點間(2個地點以上)的含量變化不顯著。
本發明的高抗性淀粉含量水稻，具有以下優點
本發明首先利用ISA轉基因，優化調控直鏈淀粉含量209Γ25%水稻的支鏈淀粉的鏈長結構，培育出高抗性淀粉含量水稻。高抗性淀粉含量水稻可用于糖尿病專用產品的開發，對糖尿病人群實施飲食療法具有重要意義。


圖1是本發明所用的目的基因ISA插入序列的載體構建示意圖。
具體實施例方式
以下通過具體實例進一步說明本發明。實施例1
以取直鏈淀粉含量24. 5%水稻品種“浙恢7%4”的成熟胚為外植體，接種至誘導培養基，在25士 1°C、光強3000勒克斯光條件下誘導形成愈傷組織；
取誘導形成2周的愈傷組織，轉移至繼代培養基，繼代培養至愈傷組織進入成倍增殖
期；
取成倍增殖的愈傷組織，在25士 1°C、避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養2
天；
取經過預培養的愈傷組織(約300個培養皿，含1500塊以上的愈傷組織)，在農桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養基上，在25士 1 °C、避光的黑暗條件下共培養2天；
取上述共培養愈傷組織，洗凈、晾干后，轉移到篩選培養基，在25士 1°C、避光的黑暗條件下培養6周，收集新長出的抗性愈傷組織(約160塊愈傷組織)，轉移至新的篩選培養基上，再進行連續2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；
取3輪篩選后的抗性愈傷組織(約40塊愈傷組織)，轉移至分化培養基，在25士 1°C、光強3000勒克斯光條件下誘導分化成苗69株，對抗性植株進行標記基因GUS組織化學染色和篩選基因HPT分子檢測，選留含目的基因ISAl插入序列的轉基因植株69株，目的基因插入序列的載體構建如圖1所示。取入選的轉基因植株，田間種植后收獲種子，進行抗性淀粉含量檢測，選留抗性淀粉含量高于10%的轉基因植株16株；繼續種植轉基因株系；
2008-2010連續3年，分別在浙江杭州(春季)、浙江富陽(夏季)、海南陵水(冬季)三地三季評價抗性淀粉含量的表達穩定性，繁殖抗性淀粉含量穩定高于10%的優良株系，最終培育高抗性淀粉含量水稻5個，T-RS-U T-RS-2、T-RS-3、T-RS-4、T-RS-5，其抗性淀粉含量分別為10. 5%、11· 2%、12· 7%、14· 1%、19· 5%，而原中等直鏈淀粉含量水稻品種“浙恢7954”的抗性淀粉含量分別為0. 9%。
權利要求
1.一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法，包括以下步驟1)取直鏈淀粉含量20% 25%水稻品種的成熟胚為外植體，接種至誘導培養基，在25 士 1°C、光強3000勒克司光條件下誘導形成愈傷組織；2)將誘導形成2周的愈傷組織，轉移至繼代培養基，繼代培養至愈傷組織進入成倍增殖期；3)將成倍增殖的愈傷組織，在25士1°C避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養2天；4)將經過預培養的愈傷組織，在農桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養基上，在25士 1°C避光的黑暗條件下共培養2天；5)將上述共培養愈傷組織，洗凈、晾干后，轉移到篩選培養基，在25士1°C避光的黑暗條件下培養6周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉移至新的篩選培養基上，再進行連續2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉移至分化培養基，在25士1°C、光強3000勒克司光條件下誘導分化成苗，對抗性植株進行組織化學染色和分子檢測，選留含目的基因插入序列的轉基因植株，所說的目的基因插入序列是指目的基因淀粉分支酶基因ISA1、標記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因淀粉分支酶基因ISAl 片段長 570bp ；7)取入選的轉基因植株，田間種植后收獲種子，測定抗性淀粉含量，選留抗性淀粉含量高于10%的轉基因植株；8)繼續種植步驟7)篩選的轉基因株系，評價抗性淀粉含量的表達穩定性，繁殖抗性淀粉含量穩定高于10%的優良株系，為培育的高抗性淀粉含量水稻。
2.根據權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的誘導培養基為N6基本培養基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
3.根據權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的繼代培養基為N6基本培養基添加2，4-D lmg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
4.根據權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的共培養基為N6基本培養基添加2，4-D 0. 5mg、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g、和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
5.根據權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的篩選培養基為N6基本培養基添加2，4-D 0. 5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前 5. 8。
6.根據權利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的分化培養基為N6基本培養基添加6-BAlmg、NAAO. 5mg、KTO. 5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH 滅菌前 5. 8。
7.根據權利要求2-6所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說的N6 基本培養基為 KNO3 2830mg, (NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 1. 5mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg, Na2-EDTA · 2H2037. 3mg,H3BO3 1. 6mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、維生素 Bl 0. 5mg 和甘氨酸2mg。
全文摘要
本發明涉及一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法，步驟包括取直鏈淀粉含量20%～25%水稻品種的成熟胚為外植體，誘導愈傷組織，繼代培養至成倍增殖期，暗條件預培養，進行農桿菌共培養轉化，轉移到篩選培養基進行3輪篩選，取抗性愈傷組織誘導分化成苗，對抗性植株進行標記基因組織化學染色和篩選基因分子檢測，鑒定含目的基因ISA1插入序列的分化小苗，對入選的轉基因植株進行抗性淀粉含量檢測，選留抗性淀粉含量高于10%的轉基因植株，繼續種植評價抗性淀粉含量的表達穩定性，繁殖抗性淀粉含量穩定高于10%的優良株系，最終培育出高抗性淀粉含量水稻。本發明的高抗性淀粉水稻，可用于糖尿病專用產品的開發，對糖尿病人群實施飲食療法具有重要意義。
文檔編號A01H4/00GK102550415SQ20121000510
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者吳殿星, 張寧, 徐開盛, 舒小麗 申請人:浙江大學