專利名稱：一種nod/scid小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及ー種N0D/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法。建立具有模擬臨床異基因造血干細胞移植后移植物抗宿主病特點的疾病模型， 可為研究移植物抗宿主病的發生機制和診療方法提供研究平臺。
背景技術：
移植物抗宿主病(GVHD)是異基因造血干細胞移植后的主要并發癥和死亡原因，成為阻礙移植成功的關鍵因素。降低或減輕GVHD的發生及程度相關的體外、動物模型和臨床研究顯得尤為迫切。目前大部分GVHD動物模型建立在不同H-2抗原不合的小鼠間移植， 與人類造血干細胞移植后發生的GVHD存在一定的差異。近年來人源化免疫系統N0D/SCID 小鼠的出現為在活體內進行人類免疫功能研究提供了可能。人源化免疫系統N0D/SCID小鼠是指在小鼠體內建立人的免疫系統，該小鼠能夠提供研究人免疫系統的體內實驗平臺， 對研究開發疫苗、藥物試驗、腫瘤防治和移植排斥反應等方面具有重要意義。人源化NOD/ SCID小鼠GVHD模型為GVHD研究提供了很好的疾病模型，經典的該模型建立過程中首先需要對N0D/SCID小鼠進行亞致死劑量輻照預處理，接著輸注一定數量的人外周血單個核細胞(PBMCs)。亞致死劑量的輻照能夠抑制宿主的固有免疫，同時增加植入細胞所需要的龕位，所以亞致死劑量輻照是人源化N0D/SCID小鼠GVHD模型成功建立的關鍵，但是國內很多研究中心缺乏輻照相關的儀器設備從而限制了該模型的廣泛應用。為此，本發明中我們應用環磷酰胺藥物聯合抗小鼠CD122單克隆抗體預處理代替亞致死劑量輻照并回輸在體外預先用植物血凝素(PHA)活化的人PBMCs的方法建立了人源化N0D/SCID小鼠GVHD模型， 為國內大多數研究中心能夠開展該模型相關研究奠定基礎。

發明內容
本發明的目的是提供ー種N0D/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法， 通過以下步驟實現
(1)活化的人PBMCs制備取正常志愿者外周血標本，肝素抗凝，應用人淋巴細胞分離液分離制備外周血單個核細胞，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640重懸細胞至細胞終密度為2 X 106/ml，加入PHA和白介素-2 (IL-2)共培養7天后準備小鼠輸入用。(2) N0D/SCID小鼠造模實驗前1周從上海斯萊克實驗動物有限責任公司購買6 周齡無特定病原體(SPF)級N0D/SCID雄性小鼠，飼養于SPF級層流柜中，飼料及飲用水均經無菌處理，并在飲用水中加入慶大霉素(32X 104U/L)和紅霉素(250mg/L)。小鼠輸入活化的人PBMCs當天作為第0天，第0天前面的時間均以“_”表示。于-3至-1天進行環磷酰胺聯合抗小鼠⑶122單克隆抗體預處理，預處理后小鼠分為兩組，每組6只，一組為實驗組，一組為對照組。實驗組小鼠中每只輸入制備好的活化人PBMCs，對照組小鼠輸入磷酸鹽緩沖液。之后每天定期觀察小鼠體重、腹瀉、皮膚GVHD表現(毛發脫落、紅斑等)、活動情況寸。
(3)小鼠人白細胞數量含量植入檢測于第10天取小鼠血50 μ 1，小鼠血進行抗人 CD45 FITC標記，流式細胞術檢測人CD45陽性白細胞數量含量；取小鼠脾臟，制備單細胞懸液，進行抗人⑶45 FITC標記，流式細胞術檢測人⑶45陽性白細胞含量。(4)小鼠GVHD靶器官的病理表現待小鼠自然死亡后，取小鼠的肝臟、小腸和腎臟等各個器官進行常規石蠟包埋、切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，查看各臟器中GVHD病理表現，并用抗人CD45單克隆抗體對各臟器進行免疫組化檢測，查看人淋巴細胞在各臟器中的浸潤情況。本發明通過應用環磷酰胺藥物聯合抗小鼠⑶122單克隆抗體預處理代替亞致死劑量輻照方法建立一種人源化N0D/SCID小鼠GVHD模型。其具有如下特點(1)該模型具有模擬臨床上化療預處理的異基因造血干細胞移植后移植物抗宿主病的特點；(2)建模型效率高，重復性好；(3)造模過程簡單易行；(4)彌補了國內很多研究中心缺乏輻照相關的儀器設備而不能進行相關研究的缺陷，能為在活體動物內進行人類免疫系統GVHD研究提供實驗平臺。


圖1是對照組小鼠和實驗組小鼠中分離的外周血細胞、脾細胞和骨髓細胞的流式分析圖。圖2是對照組和實驗組小鼠處死后分離的肝臟、小腸和腎臟的病理活檢HE染色圖。圖3是對照組和實驗組小鼠肝臟、小腸和腎臟組織的抗人⑶45單克隆抗體免疫組化圖。
具體實施例方式本發明結合附圖和實施例作進ー步的說明。本實驗所用N0D/SCID小鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，藥物環磷酰胺購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，抗小鼠⑶122單克隆抗體和抗人⑶45 FITC單克隆抗體購自eBioscience公司，人IL-2購自 P印rotech公司，PHA購自廣州市醫藥エ業研究所。本實驗重復了 6只N0D/SCID小鼠，均取得了類似結果。實施例1 活化的人PBMCs制備
1、在15ml離心管中加入5ml淋巴細胞分離液；
2、取肝素抗凝人外周靜脈血10ml與等量Hank’ s液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面，水平離心600gX20分鐘；
3、離心后見管內分為三層，上層為血漿和Hank’s液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有ー以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶；
4、用滴管插到云霧層，吸取單個核細胞，置入另ー15ml離心管中，加入5倍體積的 Hank's液，300gX 5分鐘離心，洗滌細胞2次；末次離心后，棄上清，用含10%FBS的RPMI1640 培養液重懸細胞，調整細胞密度至2 X 106/ml ；
5、細胞懸液中加入250U/ml的IL-2和100μ g/ml的PHA，置于37°C的C02培養箱中培養7天以備下一歩使用。
實施例2 N0D/SCID小鼠造模
1、于-3至-1天對N0D/SCID小鼠進行預處理，預處理方案為_3天、-2天分別腹腔注射(或灌注)環磷酰胺50mg/kg/天，-1天腹腔注射抗小鼠CD122單克隆抗體100 μ g/
只；
2、第0天在實驗組小鼠中每只從尾靜脈輸注(或灌注)制備好的活化人PBMCs1 X IO7 共0. anl，對照組小鼠中每只從尾靜脈輸注(或灌注)磷酸鹽緩沖液0. 2ml ；
3、每天定期觀察小鼠體重、腹瀉、皮膚GVHD表現(毛發脫落、紅斑等)、活動情況等。實施例3小鼠人白細胞數量含量植入檢測
1、取肝素抗凝小鼠血1ml，或脾細胞懸液Iml(細胞總數106)，加氯化銨溶液(NH4C1 8. 99g/L, KHC03: lg/L, Na4_EDTA: 0. 037g/L)3ml 裂解紅細胞，混勻，37°C作用 10 分鐘后 300g離心5分鐘，棄上清；
2、用IX磷酸鹽緩沖液40μ 1重懸細胞，加入抗⑶45 FITC單克隆抗體20 μ 1，充分混勻，4°C避光孵育30分鐘；
3、用IX磷酸鹽緩沖液2ml洗滌2次，毎次洗滌后傾倒用濾紙吸干管ロ液體；
4、加入500μ 1 IX磷酸鹽緩沖液重懸細胞，流式細胞儀上機檢測；應用CELL-QUEST軟件每管獲取10000個細胞，以人CD45陽性作為人白細胞的表型特征，計算人CD45陽性細胞占總有核細胞的百分含量。檢測結果發現小鼠外周血中CD45陽性人白細胞占總有核細胞的54. 0%，小鼠脾細胞中CD45陽性人白細胞占總有核細胞的84. 4%，小鼠骨髓細胞中CD45 陽性人白細胞占總有核細胞的21. 7%。結果參見圖1，其中對照組是未經任何處理的NOD/ SCID小鼠，實驗組是經環磷酰胺和抗小鼠CD122單克隆抗體預處理后回輸體外活化的人 PBMCs后N0D/SCID小鼠。以上結果說明人外周血白細胞能在經環磷酰胺和抗小鼠CD122單克隆抗體預處理的N0D/SCID小鼠體內獲得較高水平的植入。圖中百分數指人白細胞在總有核細胞中的數量百分含量。實施例3小鼠GVHD靶器官的病理檢測
1、固定取各臟器組織切成小塊，10%中性福爾馬林溶液內固定M小時；IX磷酸鹽緩沖液洗5分鐘，5次；
2、脫水把固定好的組織標本分別在70%乙醇1小吋，80%酒精1小吋，95%乙醇I1小時，95%乙醇II 2小時，95%乙醇III 2小時，100%乙醇I 1小時和100%乙醇2小時；
3、透明將脫水后標本分別在ニ甲苯I和ニ甲苯II中放置10分鐘和20分鐘；
4、浸蠟經透明后的組織放入熔化的石蠟中浸透，反復3次，毎次0.5-1小吋；5、包埋在包埋器中倒人熔化的新石蠟，在其凝固之前迅速放入組織塊，放入前要分清組織的各個面，將所需斷面朝下；包埋有腔組織吋，把組織平放或立放；
6、切片在切片機上切下4μ m切片，在37攝氏度水浴展開，并撈于免疫組化專用玻片上；在60攝氏度烤箱中烘烤4小時；
7、脫蠟把切片放置與ニ甲苯I、II各5分鐘；
8、進水把切片分別放置于100%,95%,85%,75%,50%乙醇中各5分鐘，放置于自來水 5分鐘；
9、HE染色把切片放于蘇木素中5分鐘，鹽酸水溶液分化數秒鐘(3 4秒)，流水沖洗后放置于0. 5%伊紅酒精溶液中1分鐘；
510、脫水將切片放置于85%、95%酒精各數秒鐘，100%酒精I、II各1分鐘；
11、ニ甲苯中放置數秒透明，采用中性樹膠封片；
12、光學顯微鏡下觀察HE染色組織切片，結果發現小鼠肝臟、小腸、肺臟和腎臟中均可見大量淋巴細胞浸潤，尤以肝臟和肺臟組織最為明顯，肝臟組織可見肝細胞水腫、壞死，小腸腺體可見破壞；結果參見圖2 ；
13、應用抗人CD45單克隆抗體對組織切片進行免疫組化檢測，同HE染色一祥先對石蠟切片進行脫蠟和進水；
14、抗原修復切片放入已預熱的0.OlM檸檬酸緩沖液(PH6. 0)內煮沸20分鐘，自然冷卻20分鐘；
15、用3%過氧化氫室溫孵育20分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性；
16、應用蒸餾水沖洗切片，磷酸鹽緩沖液中浸泡5分鐘；
17、除去磷酸鹽緩沖液，每張切片加1滴或50ul正常非免疫動物血清，封閉，室溫下孵育10分鐘，傾去血清，勿洗，滴加1 100稀釋的抗人CD45單克隆抗體(用磷酸鹽緩沖液稀釋)，4攝氏度濕盒過夜；
18、磷酸鹽緩沖液沖洗切片，毎次5分鐘，共3次；
19、滴加Envision工作液，室溫中放置30分鐘
20、磷酸鹽緩沖液沖洗切片，毎次5分鐘，共3次；
21、除去PBS液，每張切片加2滴或IOOul新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3_10 分鐘；
22、自來水沖洗，蘇木素復染1分鐘，自來水沖洗返藍；
23、將切片放置于85%、95%酒精各數秒鐘，100%酒精I、II各1分鐘，ニ甲苯中放置數秒透明，采用中性樹膠封片；
24、光學顯微鏡下觀察各切片中CD45陽性人白細胞的浸潤情況；觀察結果發現小腸、 肝臟和腎臟中均可見大量CD45陽性人白細胞浸潤，尤以小腸和肝臟最多。結果參見圖3。
權利要求
1.一種N0D/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法，通過以下步驟實現(1)活化的人PBMCs制備取正常志愿者外周血標本，肝素抗凝，應用人淋巴細胞分離液分離制備外周血單個核細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640重懸細胞至細胞終密度為 2 X 106/ml，加入PHA和白介素-2共培養7天；(2)N0D/SCID小鼠造模實驗前1周取6周齡無特定病原體級N0D/SCID雄性小鼠，飼養于SPF級層流柜中，飼料及飲用水均經無菌處理，并在飲用水中加入慶大霉素32 X 104U/L 和紅霉素250mg/L，小鼠輸入活化的人PBMCs當天作為第0天，第0天前面的時間均以“_” 表示，于-3至-1天進行環磷酰胺聯合抗小鼠CD122單克隆抗體預處理，預處理后小鼠分為兩組，每組6只，一組為實驗組，一組為對照組，實驗組小鼠中每只輸入制備好的活化人 PBMCs，對照組小鼠輸入磷酸鹽緩沖液，之后每天定期觀察小鼠體重、腹瀉、皮膚GVHD表現、 活動情況；(3)小鼠人白細胞數量含量植入檢測于第10天取小鼠血50μ 1，小鼠血進行抗人⑶45 FITC標記，流式細胞術檢測人CD45陽性白細胞數量含量；取小鼠脾臟，制備單細胞懸液，進行抗人CD45 FITC標記，流式細胞術檢測人CD45陽性白細胞含量；(4)小鼠GVHD靶器官的病理表現待小鼠自然死亡后，取小鼠的肝臟、小腸和腎臟等各個器官進行常規石蠟包埋、切片，常規蘇木素-伊紅染色，查看各臟器中GVHD病理表現，并用抗人CD45單克隆抗體對各臟器進行免疫組化檢測，查看人淋巴細胞在各臟器中的浸潤情況。
2.根據權利要求1所述的一種N0D/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法，其特征在于，步驟(2 )皮膚GVHD表現是指毛發脫落、紅斑。
全文摘要
本發明提供一種NOD/SCID小鼠異種移植物抗宿主病模型的建立方法，通過制備活化的人PBMCs，NOD/SCID小鼠造模，小鼠人白細胞數量含量植入檢測，小鼠GVHD靶器官的病理表現建立。本發明通過應用環磷酰胺藥物聯合抗小鼠CD122單克隆抗體預處理代替亞致死劑量輻照方法建立一種人源化NOD/SCID小鼠GVHD模型。該模型具有模擬臨床上化療預處理的異基因造血干細胞移植后移植物抗宿主病的特點；建模型效率高，重復性好；造模過程簡單易行；彌補了國內很多研究中心缺乏輻照相關的儀器設備而不能進行相關研究的缺陷，能為在活體動物內進行人類免疫系統GVHD研究提供實驗平臺。
文檔編號A01K67/027GK102550486SQ20121000593
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者胡永仙, 譚亞敏, 顧嫣珺, 黃河 申請人:浙江大學