專利名稱：Nf-ya9蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及ー種NF-YA9蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應用。
背景技術：
脂肪酸是生物體內主要的能量儲存形式，其主要衍生物甘油三脂 (triacylglycerol,TAG)可在動物的脂肪組織、植物種子或果實中大量儲藏。其中，植物油作為食用油和ー種重要的可再生能源物質而備受關注。甘油三脂是脂肪酸和甘油化合而成的天然高分子化合物。甘油三脂合成的過程包括脂肪酸在質體中的從頭合成過程、在內質網中的修飾過程和甘油三脂的組裝過程。在植物體內，脂肪酸的從頭合成(FAQ是在質體內進行的。脂肪酸合成的前體是乙酰CoA(acetyl-CoA)。它首先在乙酰CoA羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase, ACCase)作用下合成丙ニ酰 CoA(malonyl-CoA)，然后脂肪酸合成酶以丙ニ酰CoA為底物進行連續的聚合反應，以每次循環增加兩個碳的頻率合成酰基碳鏈，最后合成16至18碳的飽和脂肪酸。在質體內合成的游離脂肪酸被活化后運輸到內質網，進行進ー步的修飾(去飽和，脫氫，延長等)，最后形成甘油脂和膜脂。植物種子中TAG 的生物合成是在內質網中進行的。TAG合成的前體是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成的過程共需要三種酰基轉移酶和一種磷酸水解酶，分別是甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)，溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAT)，ニ脂酰甘油酰基轉移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase) (Barron等，Biochim Biophys Acta,60 :329-337)。TAG的極性很低，因此能夠使油脂在脂肪體內不斷積累。目前，已發現的參與植物脂肪酸代謝調控的轉錄因子有WRI1、LECU FUS3和 LEC2 等(Focks 等，1998，Plant Physiology, 18 :91-101 ；Santos Mendoza 等，2005， FEBS Letter,579 :4666-4670 ；Wang 等，2007，Planta，226:773-783 ；Mu 等，2008，Plant Physiology, 148 :1042-1054) 其中，WRIl編碼ー個AP2/EREB轉錄因子蛋白，它可能是植物體內由蔗糖向TAG轉化的一個關鍵的調節因子(Cernac等，2004，Plant Journal, 40 575-585)。LECl屬于能結合啟動子中順式作用元件CCAAT盒的ー類轉錄因子，調控胚胎的發生與種子成熟，同時可能對胚胎形成過程中胚胎儲存物的積累進行調控(Lotan等， 1998，Cell,1998,93(7) :1195-1205 ；To 等，2006，The Plant Cell,18(7) :1642-1651)。 過量表達LECl能大幅度增加轉基因擬南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu等，2008，Plant Physiology, 148 :1042-1054)。FUS3和LEC2都是編碼了ー個B3家族的轉錄因子，它們都是胚胎發育過程中的重要調控基因(Reidt等，2000，Plant Journal, 21 :401-408 ;Stone等， 2001,Proc Natl Acad Sci 98:11806-11811)。fus3 和 lec2 突變體的種子中，油脂含量都顯著降低(Wang2007,Planta, 226 :773-783 ；Santos Mendoza等，2008，Plant Journal, 54 :608-620)；過量表達FUS3和LEC2，都能使轉基因植物體內的油脂含量増加(Santos Mendoza 等，2005，FEBS Letter, 579 :4666-4670 ；Wang 等，2007，Planta，226 :773-783)。上述研究表明，在植物種子成熟過程中油脂積累的調控很大程度上是依賴胚胎發生過程中的重要調控因子來調控的。在擬南芥基因組中，編碼轉錄因子的基因占了很大一部分，至少有1500個，占整個基因組的5%以上(Riechmann等，2000，Science，290 :2110-2113)。這些轉錄因子大多屬于大的基因家族，有的基因家族又包括許多亞族，而且有些轉錄因子家族是植物所特有的。對轉錄因子的研究結果表明，一個轉錄因子可能對ー類相關性狀的很多基因實施調節控制，從而有效改變植物的相關特性。CCAAT盒是ー個廣泛存在于基因啟動子上的順式作用元件，與CCAAT序列結合的轉錄因子又稱為nuclear factor Y (NF-Y)或CCAAT binding factor (CBF)。NF-Y是ー個由三種不同亞基構成的異源三聚體復合物，它特異性地識別DNA 上的CCAAT序列，并與之結合，從而調節基因的表達。NF-Y的三種不同亞基分別屬于3個亞族NF-YA (又稱為 HAP2 或 CBF-B)，NF-YB (又稱為 HAP3 或 CBF-A)和 NF-YC (又稱為 HAP5 或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心結構域在序列上與組蛋白H2A和H2B有很高的同源性。 NF-YB/NF-YC形成一個緊密結合的異源ニ聚體復合物，NF-YA再結合在這個復合物的表面， 形成異源三聚體復合物。

發明內容
本發明的ー個目的是提供ー種培育轉基因植物的方法。本發明提供的方法，為將NF-YA9蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物具有如下1)-5)中的任一一種特征1)所述轉基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物、所述轉基因植物植株的根部或下胚軸均形成胚性細胞、所述轉基因植物植株生長受到抑制和所述轉基因植物的與脂肪酸合成相關基因表達水平高于所述目的植物；2)所述轉基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；3)所述轉基因植物植株生長受到抑制；4)所述轉基因植物植株的根部或下胚軸均形成胚性細胞；5)所述轉基因植物的與脂肪酸合成相關基因表達水平高于所述目的植物；所述NF-YA9蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1。在上述方法中，所述NF-YA9蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2或序列表中的序列3 ；所述脂肪酸為C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3和/或C20:l。在上述方法中，所述轉基因植物植株生長受到抑制體現在所述轉基因植物的株高或子葉大小均小于所述目的植物；所述轉基因植物植株的根部或下胚軸均有胚性細胞體現在所述轉基因植物植株的根部或下胚軸均大于所述目的植物；所述與脂肪酸合成相關基因為FAB2、FAD2、FAD3或FAEl基因。在上述方法中，上述NF-YA9蛋白的編碼基因通過重組載體導入目的植物；上述重組載體為如下1)或2)1)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PERlO的BioI和SpeI位點間得到的載體；2)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入pBA002的BioI和SpeI位點間得到的載體。在上述方法中，上述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。在上述方法中，所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黒麥、高梁或草坪草。在本發明的實施例中具體用的是擬南芥。本發明的另ー個目的是提供ー種重組載體。本發明提供了ー種重組載體，為如下1)或2)1)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PERlO的BioI和SpeI位點間得到的載體；2)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入pBA002的BioI和SpeI位點間得到的載體。本發明的實驗證明，本發明提供了將ー個調控植物脂肪酸代謝的轉錄因子NF-YA9 及其編碼基因導入擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態型中，得到轉基因植物， 發現該轉錄因子可用于調控植物體內脂肪酸代謝，實驗證明，NF-YA9轉基因擬南芥體內，不僅脂肪酸含量得到顯著提高，而且參與脂肪酸合成的酶FAEl和參與脂肪酸修飾的酶FAB2， FAD2以及FAD3的相應基因的表達也都受其調控。本發明的轉錄因子及其編碼基因對于植物脂肪酸代謝分子機制的研究，以及通過生物技術來提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關性狀的改良具有重要的理論及實際意義，在農業領域具有廣闊的應用和市場前景。本發明在研究過程中，發現了 NF-YA9在植物種子發育過程中對油脂積累的調控作用。通過以NF-YA9為靶點基因的遺傳操作可以有效地提高轉基因植物體內的脂肪酸含量。


圖1為NF-YA9的基因結構框架圖其中，黒色方框表示外顯子，灰色方框表示5 ‘和3’非編碼區，直線表示內含子。 ATG和TAA分別表示基因的起始密碼和終止密碼。圖2為pER10-NF-YA9轉基因植物萌發一周后的表型圖3為pBA-NF-YA9轉基因植物萌發10天后的表型圖4為pER10-NF-YA9轉基因植物萌發一周后的蘇丹紅染色圖5為pBA-NF-YA9轉基因植物萌發10天后的蘇丹紅染色圖6為GS-MS檢測脂肪酸含量圖7為脂肪酸合成相關基因在野生型和轉基因植物中的表達水平
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、轉NF-YA9擬南芥的獲得及表型鑒定一、轉NF-YA9擬南芥的獲得1、調控植物脂肪酸代謝的轉錄因子基因NF-YA9的克隆設計引物序列如下P1 (上游引物)5，-CCCTCGAGATGGGAATTGAAGACATGCA-3，
5
P2 (下游引物)5，-AACCCGGGTTTAATGGCTAGACGAGCTT-3，用植物總RNA提取試劑盒(購自天根生物公司，目錄號DP432)并參照試劑盒說明書提取野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia生態型，購自美國擬南芥生物資源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC，產品編號為 CS28166.以下簡稱為野生型擬南芥)2周幼苗的總RNA，然后用superscript II Reverse Transcriptase試劑盒(購自全式金生物公司，目錄號ΑΗ301_02)并參照試劑盒說明書反轉錄合成其第一鏈cDNA，再以所合成的cDNA為模板，在引物Pl和P2的引導下進行PCR擴增，得到PCR產物。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收長度約912bp的目的片段并對其進行純化，將其與經過同樣酶切得到的pBluescript SK載體片段(可購自默克公司，產品目錄號為ST212205)連接，再將連接產物用熱激法轉化大腸桿菌(E. coli) DH5a感受態細胞(購自全式金生物公司，目錄號⑶201-03)，篩選陽性克隆，將其接種于含50mg/L氨芐青霉素的5mL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12小吋，提質粒， 得到含有回收片段的重組質粒，命名為SK-NF-YA9，對其進行測序，測序結果表明PCR產物的基因具有序列表中的序列2的核苷酸序列，由912個堿基組成，其編碼序列為自5’端第 1-912位堿基，其編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質。其中，序列表中序列2自5’端第507-567位堿基編碼蛋白_蛋白相互作用結構域，自5’端第603-663位堿基編碼DNA結合結構域。上述基因對應的基因組序列具有序列表中序列3的核苷酸序列，由2195個堿基組成，自5'端第114-116位堿基為該基因組基因的第一個外顯子，自5'端第117-440位堿基為該基因組基因的第一個內含子，自5'端第441-705位堿基為該基因組基因的第二個外顯子，自5'端第706-784位堿基為該基因組基因的第二個內含子，自5'端第785-873 位堿基為該基因組基因的第三個外顯子，自5'端第874-975位堿基為該基因組基因的第三個內含子，自5'端第976-1050位堿基為該基因組基因的第四個外顯子，自5'端第 1051-1402位堿基為該基因組基因的第四個內含子，自5'端第1403-1567位堿基為該基因組基因的第五個外顯子，自5'端第1568-1673位堿基為該基因組基因的第五個內含子，自 5'端第1674-1988位堿基為該基因組基因的第六個外顯子自5'端第1_113位堿基為該基因組基因的5’非編碼區(UTR)，自5'端第1989-2195位堿基為該基因組基因的3’非編碼區。該基因的框架結構見圖1，將該基因命名為Nuclear Factor YA9 (簡稱NF-YA9)，將其編碼蛋白命名為Nuclear Factor YA9 (簡稱NF-YA9)。2、含NF-YA9的植物誘導表達載體的構建用限制性內切酶)(ho I和Spe I對上述1構建的含有NF-YA9的質粒SK_NF_YA9 進行雙酶切，對雙酶切產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收長度約912bp的NF-YA9基因片段并對其進行純化，然后連接到與經相同酶雙酶切的載體PER10連接，得到連接產物。PER10是ー個有雌ニ醇誘導的植物表達載體，記載在Applications οι Cnemicai — Inducible Expression systems in Functional Lrenomics ana Biotechnology,Nam-Hai Chua,Methods in Molecular Biology，323(III)，329—342，2006， 公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。將連接產物用熱激法轉化大腸桿菌(E. coli)DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，將其接種于含50mg/L潮霉素的5mL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養16小吋，提質粒，對重組質粒用限制性內切酶Bio I和Spe I進行雙酶切鑒定，結果經酶切獲得了 912bp DNA片段，與預期結果相符，再用引物Pl和P2做進ー步的PCR鑒定，結果經PCR擴增得到了 912bp的DNA片段，也與預期結果一致，再將該質粒送去測序，結果為將序列表中的序列2插入PERlO的)(ho I和Spe I酶切位點間得到的載體，表明得到了插入序列及位置正確的含有的植物表達載體，命名為PER10-NF-YA9。3、轉NF-YA9擬南芥的獲得將步驟2構建的植物表達載體PER10-NF-YA9用電激法轉化農桿菌GV3101感受態細胞(購自BI0VECT0R CO.，LTD，產品貨號BI0VECT0R_375)，將其涂布于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的LB抗性平板上在觀で、150rpm下培養16小吋，挑取長出的農桿菌單菌落經過用引物Pl和P2的PCR鑒定，結果經PCR擴增得到了 912bp的DNA片段，說明為陽性重組農桿菌，命名為GV3101/PER10-NF-YA9。再將GV3101/PER10-NF-YA9接種于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的20mLLB 液體培養基中在^°C、150rpm下振蕩培養2天，然后，再按2%的接種量菌將菌液接種于含 50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的300mL LB液體培養基中在28°C、150rpm下振蕩培養 18小吋。培養結束后，5000rpm離心20分鐘收集菌體，再將菌體溶于250mL含有5%蔗糖的侵染液中，慢慢搖勻。最后，將菌液轉于250mL燒杯中，將已去掉花和果莢的野生型擬南芥倒置于燒杯中5分鐘，得到TO代轉NF-YA9植物。將上述陽性TO代轉NF-YA9植物進行常規培養，收獲種子，所得種子經50mg/L卡那霉素篩選后得到20株Tl代轉NF-YA9植物。經過自交，得到大約500株T2代轉NF-YA9 植物。ニ、轉NF-YA9擬南芥的表型鑒定1、轉 PER10-NF-YA9 植物的鑒定將步驟一獲得的編號為#1和#2的T2代轉NF-YA9擬南芥(PER10-NF-YA9)的T2 代種子播在含ΙΟμΜ雌激素(17-β-Estradiol，Sigma，產品貨號E8875)的MS培養基上 (1/2MS，1%蔗糖，0.8%瓊脂)培養10天的幼苗提取全苗的RNA，以野生型擬南芥作為對照。 反轉錄獲得 cDNA，用 Pl (上游引物):5，-CCCTCGAGATGCAATCAAAACCGGGAAG-3，P2 (下游引物)5，-AACCCGGGTGGTGCACCAGAAGAATTCA-3，進行 RT-PCR，檢測了 NF-YA9 基因在 T2 代轉基因植物中的表達水平，以野生型擬南芥為對照，以Actin7為內參，內參的引物為ACTIN7F 5 ‘-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3，和 ACTIN7B :5 ‘-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3，。結果如圖2A所示，為RT-PCR技術檢測NF-YA9基因的表達水平，從圖中看出，與野生型擬南芥相比，編號為#1和#2的T2代轉PER10-NF-YA9擬南芥中NF-YA9基因的表達水平均具有不同程度地升高，說明編號為#1和#2的T2代轉PER10-NF-YA9擬南芥為陽性的過表達擬南芥。2.轉PER10-NF-YA9植物的表型分析將上述鑒定為陽性的編號為#1和#2的T2代轉NF-YA9擬南芥(PER10-NF-YA9) 的種子播在含ΙΟμΜ雌激素(17-β-Estradiol，Sigma，產品貨號E8875)的MS培養基上 (1/2MS，1 %蔗糖，0. 8 %瓊脂)(其中，MS鹽、瓊脂和蔗糖購自北京西美杰科技有限公司，產品貨號M531、A7848和S391，)置于溫室中在22°C、光照強度80-120 μ E-2S-1條件下培養 16小吋，以野生型擬南芥作為對照。
10天后，觀察T2代轉NF-YA9擬南芥和野生型植株的生長情況，結果如圖2B所示， 可以看出，T2代轉NF-YA9擬南芥在誘導培養基上生長10天時有明顯的生長抑制表型，具體表現為NF-YA9過表達植株矮小、子葉變小或不能正常發育、頂端分生組織的發育完全受阻，根的生長發育異常。同吋，在T2代轉NF-YA9擬南芥的下胚軸和根部形成明顯的胚性組織，主要表現為根部和下胚軸顏色變綠，明顯膨大變粗。三、NF-YA9組成型表達轉基因擬南芥的獲得1、構建NF-YA9基因組成型過量表達的重組表達載體將上述一得到的SK-NF-YA9經過BioI和SpeI酶切得到酶切產物與經過同樣酶切
pBA002 ( idici A GFP-mouse talin fusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes, Benedikt Kost, Pius Spielhofer, Nam-Hai Chua, The Plant Journal,16 (3), 393-401，1998，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)連接，連接產物轉化大腸桿菌，得到克隆，在含有50毫克/升壯觀酶素的LB平板上37度培養16小吋，最后篩選得到具有抗壯觀酶素抗性的克隆，提取該克隆的質粒，送去測序，結果為將序列2插入 PBA002的BioI和SpeI酶切位點間得到的質粒，該質粒命名為pBA_NF_YA9。2、轉pBA-NF-YA9擬南芥的獲得將上述獲得的pBA-NF-YA9轉化農桿菌GV3101 (購自Biovector Co.，LTD,產品貨號Bi0Vect0r-375)，然后用花侵染轉化方法轉化野生型擬南芥Col-O (購自美國擬南芥生物資源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC，產品編號為 CS28166,以下簡稱野生型擬南芥)的花序，通過除草劑Basta(50mg/L)篩選出12株Tl代轉pBA-NF-YA9擬南芥，經過擴繁，得到約300株T2代轉pBA_NF_YA9擬南芥。3、轉pBA-NF-YA9擬南芥的表型分析分別將編號為#2和#6的T2代轉pBA-NF-YA9擬南芥的種子播種后在MS培養基 (1/2MS，1 %蔗糖，0. 8 %瓊脂)(其中，MS鹽、瓊脂和蔗糖購自北京西美杰科技有限公司，產品貨號M531、A7848和S391，)上22度M小時光照培養7天，觀察植物的生長發育表型。結果表明，用組成型啟動子驅動NF-YA9過量表達，對于苗期植物的生長沒有明顯影響，但在幼苗的下胚軸處有明顯的胚性組織形成，具體表現為下胚軸明顯膨大變粗，顔色更綠(圖 3)。實施例2、轉NF-YA9擬南芥的脂肪酸代謝檢測及其機制研究一、蘇丹紅染色指示轉NF-YA9擬南芥體內脂肪酸含量的變化蘇丹紅是ー種能夠與種子特有的中性脂特異結合的染料，植物材料著色的深淺可以指示植物體內中性脂的含量高低。將由實施例1的一得到T2代轉NF-YA9擬南芥 (PER10-NF-YA9)與野生型擬南芥分別浸泡于1 %蘇丹紅(Fat Red 7B) (Sigma，產品貨號 201161-8)，室溫(25°C )染色6小吋，用去離子水清洗3遍，每遍30s，染色結果如圖4所示， 在編號為#1和#2的T2代轉NF-YA9擬南芥的根部和下胚軸處，蘇丹紅著色的程度明顯高于野生型植物，說明轉基因植物體內形成胚性細胞，且胚性細胞中的種子特異的脂肪酸的積累量明顯高于野生型。按照上述方法將由實施例1的一得到T2代轉pBA-NF-YA9擬南芥進行蘇丹紅染色，結果如圖5所示，在T2代轉pBA-NF-YA9擬南芥的根部和下胚軸處，蘇丹紅的著色程度明顯高于野生型的下胚軸，說明由于NF-YA9基因的過量表達導致種子特異的中性脂肪酸在下胚軸部位積累。ニ、GC-MS方法檢測轉NF-YA9擬南芥經誘導后體內各種脂肪酸組分的含量變化情況分別取由實施例1的一得到編號為1 (#1)和2 (#2)的T2代轉NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥在誘導培養基(含10 μ M雌激素，17-β -Estradiol，Sigma，產品貨號E8875，的 MS培養基上(配方為1/2MS，1 %蔗糖，0. 8 %瓊脂))中萌發后生長10天，各取0. 1克植物整株幼苗，在液氮中研磨成干粉，然后轉移到帶密封蓋的試管中，加入3mL甲醇(含2. 5% (V/V)濃硫酸)，在80°C水浴加熱90分鐘，再加入4. 5mL 0.9% NaCl水溶液和ImL正己烷， 混勻，4000rpm離心10分鐘，收集正己烷相。真空抽干，用IOOul乙酸乙酯溶解，取Iul上樣，用PerkinElmer公司的TurboMass GC/MS儀分析各種脂肪酸組分的含量變化情況，所用 GC柱為30mX0. 25mmBPX-70柱，GC升溫程序為初始溫度120°C，保持1分鐘，再以每分鐘 IO0C的速率升至150°C，然后以每分鐘4°C的速率升溫至230°C，保持10分鐘，以C17 0的三酯酰甘油(Sigma，貨號201161-8)作內標。根據樣品質譜出現的時間和分子量可以確定組分，根據質譜峰圖的面積與內標的面積相比，可以計算含量。脂肪酸含量的計算公式是樣品含量=(樣品峰圖面積/內標峰圖面積)χ內標含量/樣品重量。結果如圖6所示，編號為1 (#1)、2(#2)的T2代轉NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的 C16:0 的含量分別為 0. 56 μ g/mg、l. 13 μ g/mg、0. 80 μ g/mg ；編號為1 (#1)、2 (#2)的T2代轉NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C18:0的含量分別為 0. 14 μ g/mg、0. 50 μ g/mg、0· 20 μ g/mg ；編號為1 (#1)、2(#2)的T2代轉NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C18:1的含量分別為 0. 12 μ g/mg、1. 21 μ g/mg、0. 54 μ g/mg ；編號為1(#1)、2(#2)的T2代轉NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C18:2的含量分別為 0. 55 μ g/mg,2. 12 μ g/mg、1· 27 μ g/mg ；編號為1(#1)、2(#2)的T2代轉NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C18:3的含量分別為 1. 0 μ g/mg,2. 48 μ g/mg、1· 24 μ g/mg ；編號為1 (#1)、2 (#2)的T2代轉NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C20:1的含量分別為 0 μ g/mg、1. 90 μ g/mg、0· 32 μ g/mg。從上述可以看出，與野生型擬南芥相比，編號為1(#1)和2(#2)的T2代轉NF-YA9 擬南芥經誘導后脂肪酸的各個組分含量都明顯上升，其中，C16:0分別升高了 100. 4%和 42% ；C18:0 分別升高了 266. 8%和 43. 2% ；C18:l 分別升高了 913. 3%和 353. 4% ；C18:2 分別升高了 286. 5%和131. 5%;C18:3分別升高了 148. 7%和24. 5% 0尤其值得注意的是， 種子油脂中特有的C20:l在10天的野生型幼苗中是檢測不到的，但在轉基因植物中，該組分的含量分別達到了 1.90 μ g/mg和0. 32 μ g/mg。上述結果表明，NF-YA9是脂肪酸合成的正向調控因子，過量表達該基因可以顯著提高植物體內的脂肪酸含量。三、NF-YA9調控脂肪酸合成的分子機制研究分別由實施例1的一得到的編號為#1 T2代轉NF-YA9擬南芥(PER10-NF-YA9)在誘導培養基中萌發后生長10天的提取全苗的RNA，反轉錄獲得cDNA，分別用如下引物進行擴增，以野生型擬南芥(Col-O)為對照。FAD2Fl (5‘-ATGGGTGCAGGTGGAAGAAT--3，
FAD2Bl (5‘-CCAGGAGAAGTAAGGGACGA--3，
FAD3Fl (5‘-CATAAGCGGCGTGCATTTTG--3，
FAD3Bl (5‘-ACGAAAGCAGCTAAACATGT--3，
FAB2Fl (5‘-CGCTGTGCATAAGCATTCTC--3，
FAB2Bl (5‘-TTGGGGCCGGAGCTGAGAGC--3，
FAElFl (5‘-CGTTAAGCTCCTTTACCGTT--3，
FAElBl (5‘-TCTGTCTCTTCACGTGACGC--3，
UBQ5Fl (5‘-CTTCAGCAGCCGTTGCCTCA--3，
UBQ5Bl (5‘-CTGGTAAACGTAGGTGAGTCC-3‘
進行RT-PCR，檢測了與脂肪酸合成相關基
表達水平，以UBQ5為內參。 結果如圖7所示，從圖中看出，與野生型擬南芥相比，在編號為#1 T2代轉NF-YA9擬南芥(PER10-NF-YA9)中與脂肪酸合成相關基因，包括FAB2 (At2g43710)，FAD2(At3gl2120), FAD3 (At2g29980)和 FAEl (At4g34520)的表達水平均有明顯地升高，說明NF-YA9調控脂肪酸的合成與積累是通過誘導脂肪酸合成相關基因的表達實現的。
權利要求
1.ー種培育轉基因植物的方法，為將NF-YA9蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物具有如下1)-5)中的任一一種特征1)所述轉基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物、所述轉基因植物植株的根部或下胚軸均形成胚性細胞、所述轉基因植物植株生長受到抑制和所述轉基因植物的與脂肪酸合成相關基因表達水平高于所述目的植物；2)所述轉基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；3)所述轉基因植物植株生長受到抑制；4)所述轉基因植物植株的根部或下胚軸均形成胚性細胞；5)所述轉基因植物的與脂肪酸合成相關基因表達水平高于所述目的植物； 所述NF-YA9蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述NF-YA9蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2或序列表中的序列3 ； 所述脂肪酸為 C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3和/或C20:l。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述轉基因植物植株生長受到抑制體現在所述轉基因植物的株高或子葉大小均小于所述目的植物；所述轉基因植物植株的根部或下胚軸均有胚性細胞體現在所述轉基因植物植株的根部或下胚軸均大于所述目的植物；所述與脂肪酸合成相關基因為FAB2，FAD2，FAD3和FAEl基因。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 所述NF-YA9蛋白的編碼基因通過重組載體導入目的植物； 所述重組載體為如下1)或2):1)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PERlO中得到的載體；2)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PBA002中得到的載體。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黒麥、高梁或草坪草。
7.—種重組載體，所述重組載體為如下1)或2)1)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PERlO中得到的載體；2)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PBA002中得到的載體。
全文摘要
本發明公開了一種NF-YA9蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應用。本發明提供的培育轉基因植物的方法，為將NF-YA9蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物具有如下等特征1)所述轉基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；本發明的實驗證明，本發明提供了將一個調控植物脂肪酸代謝的轉錄因子NF-YA9及其編碼基因導入擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態型中，得到轉基因植物，發現該轉錄因子可用于調控植物體內脂肪酸代謝。
文檔編號A01H5/00GK102558324SQ201210005549
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者左建儒, 牟金葉 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所