專利名稱：一種高黃酮含量杭白菊的培育方法
技術領域：
本發明涉及ー種杭白菊的培育方法，尤其是提高黃酮含量的杭白菊的培育方法。
背景技術：
杭白菊為菊科植物菊的干燥頭狀花序，栽培歷史悠久，據有關史料記載，迄今至少已有360余年之久，系“浙八味”地道藥材之一。杭白菊含有木犀草素-7-β -D-葡萄糖苷、 芹菜素-7- β -D-葡萄糖苷、金合歡素-7- β -D-葡萄糖苷等多種黃酮類有效成分，抗氧化作用優良，具有“清熱散風、平肝明目”之功效。早期研究發現表明，杭白菊具有解熱、抑菌、抗流感病毒、抗心血管、抗炎等作用，近年來國內外有研究顯示杭白菊具有抗氧化、抗腫瘤、抗愛滋等作用。目前，加工生產企業主要提取分離菊花總黃酮，因此，選育高黃酮含量的杭白菊新品種成為育種的主要方向。

發明內容
正是在上述背景下，本發明的目的是提出ー種高黃酮含量杭白菊的培育方法，以獲得高黃酮含量杭白菊，進行類黃酮的開發，用于食品和醫藥エ業。本發明的高黃酮含量杭白菊的培育方法，包括以下步驟
1)取杭白菊的子葉為外植體，接種至誘導培養基，在25士1°C、光強3000勒克司光條件下誘導形成愈傷組織；
2)將誘導形成3周的愈傷組織，轉移至繼代培養基，繼代培養至愈傷組織進入成倍増殖期；
3)將成倍増殖的愈傷組織，在25士1°C避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養 2天；
4)將經過預培養的愈傷組織，在農桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養基上，在25士 1°C避光的黑暗條件下共培養2天；
5)將上述共培養愈傷組織，洗浄、晾干后，轉移到篩選培養基，在25士1°C避光的黑暗條件下培養6周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉移至新的篩選培養基上，再進行連續2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；
6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉移至分化培養基，在25士1°C、光強3000勒克司光條件下誘導分化成苗，對抗性植株進行組織化學染色和分子檢測，選留含目的基因插入序列的的轉基因植株，所說的目的基因插入序列是指目的基因查耳酮合酶基因CHS、標記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因查耳酮合酶基因 CHS片段長960bp ；
7)取入選的轉基因植株，田間種植測定花瓣中總黃酮含量，選留總黃酮含量高于3%的轉基因植株；
8)繼續種植步驟7)篩選的轉基因株系，評價黃酮含量的表達穩定性，繁殖總黃酮含量穩定高于3%的優良株系，為培育的高黃酮含量杭白菊。
本發明中，所說的誘導培養基為MS基本培養基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、蔗糖30g 和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5.7。本發明中，所說的繼代培養基為MS基本培養基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、蔗糖30g 和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5.7。本發明中，所說的共培養基為MS基本培養基添加IAAO. :3mg、6-BAiaiig、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 7。本發明中，所說的篩選培養基為MS基本培養基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、潮霉素 25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 7。本發明中，所說的分化培養基為MS基本培養基添加IAAO. ;3mg、6-BA^ig/L、羧卞 200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 7。上述的MS 基本培養基為(NH4)2NO3 1650mg、KNO3 1900mg、CaCl2 · 2H20 440mg、 MgSO4 · 7H20 370mg、KH2PO4 170mg、MnSO4 · 4H20 22. 3mg、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25 mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、CoCl2 · 6H20 0. 025mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、H3BO3 6. 2mg, KI 0. 8;3mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、維生素 Bl 0. 5mg和甘氨酸ang。本發明中，所說的農桿菌的菌株為EHA105，內含質粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA 區域攜帶目的基因插入序列，包括目的基因查耳酮合酶基因CHS、標記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因查耳酮合酶基因CHS片段長 960bp，與35S和nos終止子共同構成表達框架。查耳酮合酶基因CHS是類黃酮生物合成中第一個關鍵酶，CHS的活性直接關系到類黃酮的合成，可以調控提高黃酮的含量。菌株為 EHA10方便購買或贈送獲得，在一般植物遺傳實驗室均有保存，參見文獻吳關庭等，中國農業科學，2005，38 (12) :2395-2402。上述的標記基因葡糖苷酸酶基因⑶S的組織化學染色方法參見Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989，(6): 168-169，篩選基因抗潮霉素基因 HPT 的分子檢測方法參見文獻吳關庭等，中國農業科學，2005，38 (12) :2395-對02。本發明中，所說的黃酮含量檢測方法，以蘆丁為標樣的比色法在波長510nm處測定，參見文獻楊美華，盧充偉，匡巖巍，等.柱色譜-紫外分光光度法測定廣金錢草中總黃酮的含量.中草藥，2004，35(6) 688 690。上述的穩定性是指入選杭白菊中黃酮含量在不同年份間(2年以上)、季節間(2季以上)以及地點間(2個地點以上)的含量變化不顯著。本發明培育的高黃酮含量的杭白菊，具有以下優點
本發明首先利用查耳酮合酶基因CHS，通過調控類黃酮合成第一個關鍵酶的活性，顯著提高黃酮的含量，培育出高黃酮含量杭白菊，進行高效生物提取，發展新型保健食品添加劑和營養強化劑，用于食品、醫藥領域。


圖1是本發明所用的查耳酮合酶基因CHS插入序列的載體構建示意圖。
具體實施方式
以下通過具體實例進一步說明本發明。實施例1
以取杭白菊品種“遲小洋菊”的子葉為外植體，接種至誘導培養基，在25士 1°C、光強 3000勒克斯光條件下誘導形成愈傷組織；
取誘導形成3周的愈傷組織，轉移至繼代培養基，繼代培養至愈傷組織進入成倍增殖
期；
取成倍增殖的愈傷組織，在25士 1°C、避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養2天；
取經過預培養的愈傷組織(約400個培養皿，含2500塊以上的愈傷組織)，在農桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養基上，在25士 1 °C、避光的黑暗條件下共培養2天；
取上述共培養愈傷組織，洗凈、晾干后，轉移到篩選培養基，在25士 1°C、避光的黑暗條件下培養6周，收集新長出的抗性愈傷組織(約420塊愈傷組織)，轉移至新的篩選培養基上，再進行連續2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；
取3輪篩選后的抗性愈傷組織(約60塊愈傷組織)，轉移至分化培養基，在25士 1°C、光強3000勒克斯光條件下誘導分化成苗75株，對抗性植株進行標記基因GUS組織化學染色和篩選基因HPT分子檢測，選留含目的基因查耳酮合酶基因CHS插入序列的轉基因植株21 株(目的基因插入序列的載體構建如圖1所示)。取入選的轉基因植株，田間種植后收獲種子，進行葉片內黃酮含量檢測，選留總黃酮含量高于10%的轉基因植株7株，繼續種植轉基因株系；
2008-2010連續3年，分別在浙江杭州、臨安、富陽三地三季評價黃酮含量的表達穩定性，繁殖總黃酮含量穩定高于10%的優良株系，最終培育高黃酮含量杭白菊2個=T-HBJ-I 和T-HBJ-2，其花瓣中總黃酮含量分別為11.9%、10. 3%，而原杭白菊的總黃酮含量僅為 6. 93%。
權利要求
1.一種高黃酮含量杭白菊的培育方法，包括以下步驟1)取杭白菊的子葉為外植體，接種至誘導培養基，在25士1°C、光強3000勒克司光條件下誘導形成愈傷組織；2)將誘導形成3周的愈傷組織，轉移至繼代培養基，繼代培養至愈傷組織進入成倍增殖期；3)將成倍增殖的愈傷組織，在25士1°C避光的黑暗條件下進行受體愈傷組織的預培養 2天；4)將經過預培養的愈傷組織，在農桿菌懸浮液中浸泡15分鐘，之后棄去菌液，用無菌濾紙吸干，接種于共培養基上，在25士 1°C避光的黑暗條件下共培養2天；5)將上述共培養愈傷組織，洗凈、晾干后，轉移到篩選培養基，在25士1°C避光的黑暗條件下培養6周，收集新長出的抗性愈傷組織，轉移至新的篩選培養基上，再進行連續2輪繼代篩選，每隔3周轉繼1次；6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉移至分化培養基，在25士1°C、光強3000勒克司光條件下誘導分化成苗，對抗性植株進行組織化學染色和分子檢測，選留含目的基因插入序列的的轉基因植株，所說的目的基因插入序列是指目的基因查耳酮合酶基因CHS、標記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因查耳酮合酶基因 CHS片段長960bp ；7)取入選的轉基因植株，田間種植測定花瓣中總黃酮含量，選留總黃酮含量高于3%的轉基因植株；8)繼續種植步驟7)篩選的轉基因株系，評價黃酮含量的表達穩定性，繁殖總黃酮含量穩定高于3%的優良株系，為培育的高黃酮含量杭白菊。
2.根據權利要求1所述的高黃酮含量杭白菊的培育方法，其特征在于所說的誘導培養基為MS基本培養基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 7。
3.根據權利要求1所述的高黃酮含量杭白菊的培育方法，其特征在于所說的繼代培養基為MS基本培養基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 7。
4.根據權利要求1所述的高黃酮含量杭白菊的培育方法，其特征在于所說的共培養基為MS基本培養基添加IAAO. 3mg,6-BA12mg,乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前5. 7。
5.根據權利要求1所述的高黃酮含量杭白菊的培育方法，其特征在于所說的篩選培養基為MS基本培養基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 7。
6.根據權利要求1所述的高黃酮含量杭白菊的培育方法，其特征在于所說的分化培養基為MS基本培養基添加IAAO. ;3mg、6-BA4mg/L、羧卞200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前5. 7。
7.根據權利要求2-6所述的高黃酮含量杭白菊的培育方法，其特征在于所說的MS基本培養基為 KNO3 1900mg、(NH4)2NO3 1650mg、CaCl2 · 2H20 440mg、MgSO4 · 7H20 370mg、KH2PO4 170mg、MnSO4 · 4H20 22. 3mg、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25 mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、CoCl2 · 6H20 0. 025mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg、H3BO3 6. 2mg、KI 0. 83mg、肌醇lOOmg、煙酸0. 5mg、維生素B6 0. 5mg、維生素Bl 0. 5mg和甘氨酸ang。
全文摘要
本發明涉及一種高黃酮含量杭白菊的培育方法，步驟包括取杭白菊的子葉為外植體，誘導愈傷組織，繼代培養至成倍增殖期，暗條件預培養，進行農桿菌共培養轉化，轉移到篩選培養基進行3輪篩選，取抗性愈傷組織誘導分化成苗，對抗性植株進行標記基因組織化學染色和篩選基因分子檢測，鑒定含目的基因查耳酮合酶基因CHS插入序列的分化小苗，對入選的轉基因植株進行花瓣中總黃酮含量檢測，選留總黃酮含量高于10%的轉基因植株，繼續種植評價黃酮含量的表達穩定性，繁殖總黃酮含量穩定高于10%的優良株系。本發明的高黃酮含量杭白菊，可發展新型保健食品添加劑和營養強化劑。
文檔編號A01H1/06GK102524075SQ20121002830
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月9日 優先權日2012年2月9日
發明者葉紅霞, 吳殿星, 張寧, 張琳琳, 沈曉霞, 舒小麗 申請人:浙江大學