專利名稱：：一種利用RNAi技術培育抗TYLCV番茄的方法
技術領域：
：本發明涉及ー種利用RNAi技術培育抗TYLCV番茄的方法，專用于農作物(番茄)遺傳轉化和轉基因新品種的選育，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：番茄黃化曲葉病毒(TomatoYellowLeafCurlVirus，TYLCV)隸屬雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)0大多數Begomovirus包含2個閉合環狀單鏈、大小為2.5-3.OKb基因組，即DNA-A和DNA-B組份；少數僅含有一個DNA-A組份，其基因組結構相當于雙組份病毒的DNA-A。DNA-A編碼6個0RF，分別是位于病毒鏈上的Vl基因(編碼外殼蛋白capsidprotein,CP)、V2基因(編碼移動蛋白movementprotein,MP)以及位于互補鏈上的Cl基因(編碼復制起始蛋白implicationinitiatorprotein,Rep)>C2(^^transcriptionalactivatorprotein,TrAP)>C3基因(編碼復制增強蛋白implicationenhancerprotein,REn)和C4基因(編碼的蛋白參與病毒的系統運動或癥狀形成)；在基因V2與Cl之間有非編碼區(intergenicregion,IR)，該區含有病毒復制和轉錄所需的調控元件，包括莖環結構域和保守的9堿基TAATATTAC序列等。DNA-B編碼的蛋白涉及到病毒的移動，其中病毒鏈編碼的BVl是ー個核穿梭蛋白(Nuclearshuttleprotein，NSP)，具有結合DNA的活性，能夠促進病毒DNA在細胞核與細胞質之間進行穿梭運動；互補鏈上的BCl編碼MP，參與病毒的胞間移動(CzosnekHandGronenbornB.ihetomatoyellowleafcurlvirusgenomeandfunction01itsproteins.TomatoYellowLeafCurlVirusDisease,2007:67-84).感染TYLCV番茄早期主要表現為植株生長遲緩或停滯，節間變短，明顯矮化，葉片變小，變厚，葉質脆硬，有褶自皮，向上卷曲，變形，葉片邊緣至葉脈區域黃化，以植株上部葉片癥狀典型，下部老葉癥狀不明顯；植株感病后期坐果很少，果實變小，膨大速度極慢，成熟期的果實不能正常轉色，致使番茄品質下降，基本失去商品價值，產量減少，甚至絕收，給當地番茄生產造成巨大的損失(趙統敏，余文貴，楊瑪麗，趙麗萍，季英華，周益軍.番茄黃化曲葉病毒病在江蘇的暴發與綜合防治.江蘇農業科學，2008:114-115)。ITLCV通過煙粉虱以長久方式傳播。煙粉虱繁殖力強且極易產生抗藥性，如片面施用化學農藥往往在1-3年后難以防治，而且該蟲寄主廣泛，幾乎涵蓋所有常見蔬菜、多種花卉等作物，要將TYLCV限制在ー個地點和阻止其傳播與擴散有很大難度。同時ITLCV危害重，又幾乎無藥可治，因此培育抗ITLCV優良品種，是消除ITLCV威脅的主要策略。目前，抗TYLCV的基因僅在醋栗番茄(LvcopersiconDiiminellifoliim)、播M芳口(Lycopersiconperuvianum)、多毛畨カロ(Lycopersiconnabrochaites)、智利備芳ロ(LycopersiconcAi^ewseノ禾ロ契5^尼播安口{Lycopersiconcheesmanii)ぜ近緣野生禾中中發現，在番茄栽培種中還未發現。番茄栽培種與野生種雜交才可獲得抗TYLCV的番茄栽培種質，但這需要大量且長期的選育和鑒定工作(JiY,ScottJ,HansonP,GrahamΕ,MaxwellD.Sourcesofresistance,inheritance,andlocationofgeneticlociconferringresistancetomembersofthetomato—infectingbegomoviruses.iomatoYellowLeafCurlVirusDisease,2007:343-362)。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。其作用機制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產生干擾小RNA(siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補結合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調基因表達。RNAi是普遍存在于動物和植物界的一種防御反應，已經發展成為基因治療、基因功能研究和植物新種質創制的有效的方法。因此，利用RNAi技術特異地對抗番茄黃化曲葉病毒，可以培育抗TYLCV番茄。
發明內容技術問題本發明的目的是針對TYLCV危害番茄生產的現狀，提供ー種利用RNAi技術培育抗TYLCV番茄的方法。技術方案ー種利用RNAi技術培育抗TYLCV番茄的方法，包括1)將TYLCV的V2和Cl基因中的保守序列嵌合并構建反向重復序列的RNAi載體；2)利用農桿菌介導轉化法轉化番茄無菌苗子葉或下胚軸外植體；3)轉基因番茄經ITLCV的農桿菌侵染性克隆注射接種和攜帯ITLCV的煙粉虱接種鑒定抗病性，獲取抗TYLCV番茄。本發明所述的方法，具體步驟如下1)分別利用下列兩對引物F1/R1和F2/R2進行PCR擴增，從有ITLCV典型癥狀的番茄植株病葉樣品DNA中擴增V2基因和Cl基因，所述V2基因和Cl基因的序列分別為SEQIDNO.1和SEQIDN0.2所示；FlCAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCTRlAACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGGF2GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGCR2GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG2)將SEQIDNO.1和SEQIDNO.2PCR產物混合，以引物Fl和R2進行PCR擴增，得到V2和Cl的嵌合基因，嵌合基因序列為SEQIDN0.3所示，SEQIDNO.3PCR產物與pGEM-Τ載體連接，得到T-V2C1；3)以T-V2C1為模板，利用下列F3/R3引物進行PCR擴增，將PCR產物和植物表達載體載體iHp用BamHI和HindIII酶切，酶切片段進行連接，得到iHp-T_V2Cl；F3CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCAR3TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG4)以T-V2C1為模板，利用下列F4/R4引物進行PCR擴增，將PCR產物和iHp-T_V2Cl以B10I和McI酶切，酶切片段進行連接，得到iHp-V2Cl；F4GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTGR4GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA5)用BamHI和McI酶切植物表達載體pBI121和iHp_V2Cl，回收酶切的目的片段，用T4-DNA連接酶連接，構建RNAi載體pB1121-V2C1。6)農桿菌介導法將RNAi載體pBI121-V2Cl轉化番茄無菌苗的子葉或下胚軸外植體，通過硫酸卡那霉素篩選，抗性再生苗生根、移栽，PCR鑒定獲取轉基因番茄。7)將含有TYLCV的農桿菌侵染性克隆采用農桿菌注射法對4-6葉期苗齡轉基因番茄進行注射接種，篩選抗TYLCV轉基因番茄或者將轉基因番茄植株置于防蟲溫室，通過攜帯TYLCV的煙粉虱進行捕食和傳毒，篩選抗TYLCV轉基因番茄。有益效果本發明方法利用RNAi技術可以培育具有優良抗TYLCV的轉基因番茄，轉基因番茄經TYLCV的農桿菌侵染性克隆注射接種和攜帯TYLCV的煙粉虱傳毒接種后，未表現TYLCV感染癥狀，而非轉基因番茄植株的頂端新葉則產生卷曲皺縮、耳突，植株表現矮化等典型TYLCV感染癥狀。圖1pBI121-V2C1載體轉基因番茄PCR檢測CK:非轉基因番茄；M:IkbDNA分子量標準；1-15:pBI121_V2Cl轉化番茄再生植株。除了6和14號再生植株，其他13株番茄再生植株能擴增出400bp大小的片段，而非轉基因植株沒有擴增到特異條帶，證明RNAi框架已經整合至番茄基因組。圖2PCR檢測pBI121-V2Cl轉基因番茄植株體內病毒CK:非轉基因番茄；1-5，7-13，15:pBI121-V2Cl轉基因番茄。對照植株能擴增明亮的病毒特異條帯，部分轉基因植株(2、3、4、5、7、9、11、15號植株)也能檢測到該特異條帶，但條帶亮度比對照植株暗，而1、8、10、12和13號轉基因植株沒有檢測到病毒特異條帯，初歩表明該幾個轉基因株系對TYLCV有抗性。圖3煙粉虱傳毒ー個月后番茄植株表現A非轉基因植株上半部分的新葉明顯卷曲皺縮；B轉基因植株上半部分的葉片無卷曲皺縮現象；C非轉基因植株整體表現植株矮化；D轉基因植株整株表現正常，無感染ITLCV癥狀。具體實施例方式1、TYLCV的V2和Cl基因RNAi載體的構建1.1植物總DNA提取利用CTAB法提取有TYLCV典型癥狀(頂端新葉出現卷曲、產生耳突)的番茄植株病葉樣品DNA，具體步驟如下取Ig新鮮葉片，液氮研磨成粉末，轉入1.5ml離心管，加入600μ1預熱CTAB裂解液(表1)，渦旋混勻，65°C水浴lh，加入600μ1氯仿-異戊醇(24:1)，顛倒50次混勻，IOOOOrpm離心15min，取上清于新1.5ml離心管，加入等體積的預冷異丙醇，充分混勻，-20°C放置30min，12000rpm離心15min，棄上清，加入Iml75%酒精洗滌DNA沉淀，棄酒精，風干，加ΙΟΟμΙTE溶解DNA，4°C儲存備用。表1CTAB裂解液組成成分用量1.4MNaCl40.908g0.IMTris-HCl50mll.OMTris-HCl(pH8.0)20mMEDTA20ml0.5MEDTA(pH8.0)2%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)IOg2%聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)IOg1%(V/V)β-巰基乙醇5ml去離子水425ml總體積500ml1.2PCR分別擴增V2和Cl基因片段V2基因片段PCR引物為FlCAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCT和RlAACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGG，Cl基因片段PCR引物為F2GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGC和R2GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG。PCR反應條件94°C預變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸40sec)35個循環，72°C繼續延伸lOmin。PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)分別回收純化V2基因453bp(SEQIDNO.1)和Cl基因1103bp(SEQIDNO.2)的目的片段。1.3PCR擴增V2禾ロCl的嵌合基因將步驟1.2的目的片段(SEQIDNO.1，SEQIDNO.2)混合做模板，以上述引物Fl和R2進行PCR擴增。PCR反應條件94°C預變性:3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸40sec)35個循環，72°C繼續延伸lOmin。PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收純化嵌合基因392bp(SEQIDNO.3)。1.4載體T-V2C1構建和質粒提取將步驟1.3的嵌合基因與pGEM-T載體(Promega公司)連接，反應體系如下2XBuffer5.0μ1、ρ6ΕΜ_Τ載體0.7μ1、PCR產物3.3μ1、T4DNA連接酶Ι.ΟμΙ，上述成分混勻后16°C連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌JM109(Takara公司)，步驟如下取一管_70°C保存的感受態細胞，冰盒上融化，加入10μ1連接產物，輕搖混勻，冰浴30min；42°C熱激90sec后迅速置冰浴anin，加入400μ1液體LB，37°CIOOrpm振蕩培養Ih；取200μ1培養液均勻涂布于涂有4μ1IPTGQOOmg/ml)和40μ1X-GAL(20mg/ml)的氨芐青霉素(50mg/1)平板上，37°C靜置培養12h。挑取平板上長出的單克隆，在含有氨芐青霉素(50mg/1)的LB液體培養基中37°C、220rpm培養16h，經引物Fl和R2進行PCR鑒定為陽性克隆，測序驗證含有V2和Cl的嵌合基因序列(SEQIDN0.3)，命名為T-V2C1，用質粒DNA提取試劑盒(Axygen公司)提取T-V2C1質粒DNA。1.5載體iHp-T_V2Cl構建和質粒提取以T-V2C1DNA為模板，利用引物F3CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCA和R3TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG進行PCR擴增，PCR反應條件94°C預變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸40sec，)35個循環，72°C繼續延伸IOmin。PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收純化目的片段6(413bp)。將目的片段和植物表達載體iHp(PeterA.Stoutjesdijk,SurinderP.Singh,QingLiu,etal.hpRNA—mediatedtargetingoftheArabidopsisFAD2genegiveshighlyefficientandstablesilencing.Plantphysiology,2002,129:1723-1731.)用BamHI和HindIII酶切，酶切產物用T4-DNA酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109(Takara公司)。挑取平板上長出的單克隆，在含有50mg/l卡那霉素的LB液體培養基中370C、220rpm培養16h，經引物F3和R3進行PCR鑒定為陽性克隆后，命名為iHp-T_V2Cl，用質粒DNA提取試劑盒(Axygen公司)提取iHp-T_V2Cl質粒DNA。1.6載體iHp_V2Cl構建和質粒提取以T-V2C1DNA為模板，利用弓丨物F4GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTG和R4GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA進行PCR擴增，PCR反應條件94°C預變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸40sec，)35個循環，72°C繼續延伸IOmin。PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收純化目的片段(410bp)。將目的片段和iHp-T-V2Cl以XhoI和SacI酶切，酶切產物用T4-DNA酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109(Takara公司)。挑取平板上長出的單克隆，在含有50mg/l卡那霉素的LB液體培養基中37°C、220rpm培養16h，經引物F4和R4進行PCR鑒定為陽性克隆后，命名為iHp-V2Cl，用質粒DNA提取試劑盒(Axygen公司)提取iHp_V2Cl質粒DNA。1.7載體pBI121_V2Cl構建用BamHI和SacI酶切植物表達載體pBI121(Clontech公司)和iHp_V2Cl，酶切產物在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收純化酶切片段，用T4-DNA連接酶連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109(Takara公司)。挑取平板上長出的單克隆，在含有卡那霉素的LB液體培養基中37°C、220rpm培養16h，用質粒DNA提取試劑盒(Axygen公司)提取質粒DNA，經BamHI/SacI雙酶切驗證后，命名為pBI121_V2Cl。2、農桿菌介導轉化番茄2.1農桿菌感受態細胞的制備取_70°C保存農桿菌EHA105(北京Biovector公司)劃線于LB(含有20mg/l利福平)平板，觀で培養2d。挑單菌落培養于50ml液體LB(含20mg/l利福平)，140rpm,觀で培養至OD600=0.5；農桿菌菌液轉入無菌50ml離心管，4000rpm離心％iin，棄上清液，加入5ml預冷0.15MNaCl懸浮細胞，4000rpm離心4min，去上清液；再用0.15MNaCl懸浮細胞，4000rpm離心％iin，去上清液；加入3ml預冷20mMCaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置30min，加入終濃度為15%甘油，混勻后每管分裝100μ1，立即凍存于-70°C。2.2RNAi載體pBI121_V2Cl轉化農桿菌取IPg左右的PBI121-V2C1質粒DNA加入到100μ1農桿菌感受態細胞中，混勻后，冰浴30min；液氮冷凍lmin，取出后37°C水浴2min，冰浴^iiin；加入Iml液體LB，28°C、140rpm搖培2-；離心，100μ1液體LB重懸后涂在含50mg/l卡那霉素LB平板上，觀で培養到形成單菌落；單菌落培養于含有50mg/1卡那霉素的液體LB，280C、140rpm搖培16h，取2μ1菌液進行PCR驗證，陽性克隆保存備用。2.3農桿菌轉化番茄子葉或下胚軸感病自交系番茄品種Ε_6(彭宏，余文貴，趙統敏，張保龍，倪萬潮，吳丹，楊瑪麗，趙麗萍.基因抗番茄黃化曲葉病毒(ITLCV)的研究，江蘇農業學報，2011，27(2)371-377)種子用70%乙醇浸泡30sec，然后用10%次氯酸鈉消毒15min，期間不斷搖動，隨后用無菌水沖洗3遍，接種于1/2MS培養基上培養IOd；取番茄無菌苗的子葉或下胚軸為外植體，用0D600=0.3左右的農桿菌菌液浸泡感染外植體5min。取出外植體，置于無菌干燥濾紙上吸干殘留菌液，轉入MS+IAA0.5mg/L+6-BA2.Omg/L培養基上黑暗處共培養48h，然后轉入MS+IAA0.5mg/L+6-BA2.Omg/L+頭孢霉素500mg/L+卡那霉素50mg/L篩選培養基上，25°C、18/光照周期進行培養。每三周換一次培養基。約40d左右分化出緑色芽點；待再生芽長到34Cm時切下并轉入1/2MS+IBA1.Omg/L+頭孢霉素400mg/L生根培養基中培養；根系發達后移栽至土壌。2.4轉基因番茄的DNA提取利用CTAB法提取再生番茄植株葉片DNA，具體步驟如下取0.1-0.5g新鮮葉片，液氮研磨成粉末，轉入1.5ml離心管，加入600μ1預熱CTAB裂解液(表1)，渦旋混勻，65°C水浴lh，加入600μ1氯仿-異戊醇(24:1)，顛倒50次混勻，IOOOOrpm離心15min，取上清于新1.5ml離心管，加入等體積的預冷異丙醇，充分混勻，-20°C放置30min，12000rpm離心15min，棄上清，加入Iml75%酒精洗滌DNA沉淀，棄酒精，風干，加ΙΟΟμΙTE溶解DNA，4°C儲存備用。2.5轉基因番茄的PCR檢測用特異引物V2C1-93FTCCAAGGCACAAACAAGCGACGA和FAD_intron96R:TATCGTGAGCGGAGAAATTCACAG進行PCR檢測RNAi載體的V2C1嵌合基因序列和內含子部分序列，目的片段大小為400bp左右，非轉基因番茄為對照。PCR擴增程序如下95°C預變性5min;94°C變性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸50sec，30個循環；72°C延伸5min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳檢測結果顯示有13株番茄再生植株能擴增出400bp大小的片段，而非轉基因植株沒有擴增到特異條帶(圖1)，證明RNAi框架已經整合至番茄基因組。3、轉基因番茄的TYLCV抗性鑒定3.1農桿菌注射接種采用農桿菌注射法將含有TYLCV的農桿菌侵染性克隆(葉劍，青玲，周雪平.與中國番茄黃化曲葉病毒伴隨的DNAii分子βCl缺失突變體介導的交叉保護作用初歩研究.浙江大學學報(農業與生命科學版)，2006，32:479-482.)對4-6葉期苗齡的非轉基因和轉基因番茄進行注射接種，具體操作如下Iml—次性注射器吸取含有TYLCV的農桿菌侵染性克隆，在距離根部l-2cm處取三點進行韌皮部注射，或者在植株葉柄處取三點進行韌皮部注射，或者在上部嫩葉背部用帶有菌液的針頭劃傷，接種植株置于防蟲溫室，在25°C、16/光照周期下培養。3.2農桿菌注射接種轉基因番茄植株體內病毒的PCR檢測和抗病鑒定提取農桿菌注射接種15d的番茄葉片DNA，用病毒特異引物TYLCV-V1F:CGCCCGTCTCGAAGGTTC和TYLCV-V1R:GCCATATACAATAACAAGGC進行PCR檢測，PCR擴增程序如下95°C預變性5min;94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸50s，30個循環；72°C延伸5min。結果發現對照植株能擴增明亮的病毒特異條帯，部分轉基因植株(2、3、4、5、7、9、11、15號植株)也能檢測到該特異條帶，但條帶亮度比對照植株暗，而1、8、10、12和13號轉基因植株沒有檢測到病毒特異條帯，初歩表明該幾個轉基因株系對TYLCV有抗性。病癥表現方面，非轉基因番茄植株的頂端新葉出現卷曲、產生耳突，嚴重者葉片向上卷曲皺縮，植株表現矮化，而1、8、10、12和13號轉基因植株未表現發病癥狀(圖2)。3.3畑粉虱傳毒實驗將轉基因番茄植株和非轉基因對照置于防蟲溫室，25°C、16/光照周期進行培養，通過攜帶TYLCV的煙粉虱(糾敏，周雪平，劉樹生.畑粉虱傳播雙生病毒研究進展.昆蟲學報，2006，49:513-520;吳丹，張保龍，楊郁文，倪萬潮，趙統敏，張云華，王榮富.不同啟動子在轉基因煙草中抗番茄黃化曲葉病毒的研究.江蘇農業學報，2010,26(1):55-60)進行捕食和傳毒，30d內觀察植株癥狀。結果發現非轉基因植株嚴重感病，植株上半部分的新葉明顯卷曲皺縮，植株矮化，生長期后期開花不暢；而10和13號轉基因植株未觀察到明顯的發病癥狀(圖3)，表明轉基因植株對TYLCV有良好抗病性。SEQIDNO.1V2基因片段cagaagctttcaaccaatcaaattgcatcctcaaacgttagataagtgttcatttgtctttatatacttggtccccaagtagtttgtcttgcactatgtgggatccacttctaaatgaatttcctgaatctgttcacggatttcgttgtatgttagctattaaatatttgcagtccgttgaggaaacttacgagcccaatacattgggccacgatttaattagggatcttatatctgttgtaagggcccgtgactatgtcgaagcgaccaggcgatataatcatttccacgcccgtctcgaaggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgetgetgtccccattgtccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaatatacagaatgtatcgaagcccatgcctcgttSEQIDNO.2Cl基因片段gtatcgaagcccatgcctcgtttatttaaaatatatgccaaaaattatttcctaacatatcccaattgttctctctctaaagaggaagcactttcccaattgaaaaacctagaaaccccaacaaataaaaaatacatcaaagtttgcagagaactccacgagaatggggaaccacatctccatgtgcttatccaattcgaaggcaaataccaatgtaagaaccaacggttcttcgacctggtatccccaaacaggtcagcacatttccatccgaacattcaggcagctaagagctcaacagatgtcaagacctacgtggaaaaagacggagacttcattgattttggagttttccaaatcgatggcagatcagctagaggaggtcagcaatctgccaacgacgcatatgccgaggcactcaattcaggcagtaaatccgaggccctcaatatattaaaagagaaggccccaaaggactatattttacaatttcataatttaagttcaaatttagataggatttttagtcctcctttagaagtttatgtttctccatttctttcttcttcttttaatcaagttccagatgaacttgaagagtgggtcgccgagaacgtcgtatcttccgctgcgcggccatggagacccataagtattgtcgttgagggtgatagcagaacaggcaaaacaatgtgggccaggtctctaggcccacataattatttatgtggacatttagacctaagcccaaaggtgtacagtaatgatgcgtggtacaacgtcattgatgacgtagacccgcattatttaaagcacttcaaggaattcatgggggcccagagggactggcaaagcaacacaaagtacgggaagcccattcaaattaaagggggaattcccactatcttcctctgcaatccaggacctacctcctcatatagggaatatctagacgaagaaaaaaacatatccttgaaaaattgggctctcaagaatgcaaccttcgtcaccctctacgagccactgttcgcaagtatcaatcaaggtccaacacaagatagccaagaagaaaccaataaggcgtaagcgtgtagaagcttgacSEQIDNO.3V2C1嵌合基因片段aggcgatataatcatttccacgcccgtctcgaaggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgctgcxgtccccattgtccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaatatacagaatgtatcgaagcccatgcctcgtttatttaaaatatatgccaaaaattatttcctaacatatcccaattgttctctctctaaagaggaagcactttcccaattgaaaaacctagaaaccccaacaaataaaaaatacatcaaagtttgcagagaactccacgagaatggggaaccacatctccatgtgcttatccaattcgaaggcaaataccaatgtaagaaccaacggtt權利要求1.ー種利用RNAi技術培育抗TYLCV番茄的方法，包括1)將番茄黃化曲葉病毒TYLCV的V2基因和Cl基因中的保守序列嵌合并構建反向重復序列的RNAi載體；2)利用農桿菌介導轉化法轉化番茄無菌苗子葉或下胚軸外植體；3)轉基因番茄經ITLCV的農桿菌侵染性克隆注射接種或攜帯ITLCV的煙粉虱接種鑒定抗病性，獲取抗TYLCV番茄。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于1)分別利用下列兩對引物F1/R1和F2/R2進行PCR擴增，從有ITLCV典型癥狀的番茄植株病葉樣品DNA中擴增V2基因和Cl基因，所述V2基因和Cl基因的序列分別為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；FlCAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCTRlAACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGGF2GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGCR2GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG2)將SEQIDNO.1和SEQIDNO.2PCR產物混合，以引物Fl和R2進行PCR擴增，得到V2和Cl的嵌合基因，序列為SEQIDNO.3所示，嵌合基因SEQIDNO.3PCR產物與pGEM-Τ載體連接，得到T-V2C1；3)以T-V2C1為模板，利用下列F3/R3引物進行PCR擴增，將PCR產物和植物表達載體iHp用BamHI和HindIII酶切，將酶切片段進行連接，得到iHp-T_V2Cl；F3CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCAR3TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG4)以T-V2C1為模板，利用下列F4/R4引物進行PCR擴增，將PCR產物和iHp-T_V2Cl以B10I和McI酶切，將酶切片段進行連接，得到iHp-V2Cl；F4GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTGR4GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA5)用BamHI和McI酶切植物表達載體pBI121和iHp_V2Cl，回收酶切的目的片段，用T4-DNA連接酶連接，構建RNAi載體pBI121_V2Cl；6)農桿菌介導法將RNAi載體pBI121-V2Cl轉化番茄無菌苗的子葉或下胚軸外植體，通過硫酸卡那霉素篩選，抗性再生苗生根、移栽，PCR鑒定獲取轉基因番茄；7)將含有TYLCV的農桿菌侵染性克隆采用農桿菌注射法對4-6葉期苗齡轉基因番茄進行注射接種，篩選抗TYLCV轉基因番茄；或者將轉基因番茄植株置于防蟲溫室，通過攜帶TYLCV的煙粉虱進行捕食和傳毒，篩選抗TYLCV轉基因番茄。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在干所述轉基因番茄含有SEQIDIDNO.3所示的部分或全部核苷酸序列。全文摘要本發明涉及一種利用RNAi技術培育抗TYLCV番茄的方法，屬于生物
技術領域：
。該方法將TYLCV的V2和C1基因中的保守序列嵌合并構建反向重復序列的RNAi載體，通過農桿菌介導轉化法轉化番茄無菌苗子葉或下胚軸外植體，轉基因番茄經TYLCV的農桿菌侵染性克隆注射接種和攜帶TYLCV的煙粉虱接種病毒后都表現對TYLCV抗性，未觀察到明顯的發病癥狀。本發明利用RNAi技術可以培育抗TYLCV番茄轉基因株系，為防治TYLCV提供了技術支持。文檔編號A01H5/00GK102533853SQ20121005173公開日2012年7月4日申請日期2012年3月2日優先權日2012年3月2日發明者余文貴,張保龍,朱成松,楊郁文,趙統敏,陳天子申請人:江蘇省農業科學院