一種利用病毒載體誘導番茄抗tylcv的方法
【專利摘要】本發明為一種利用病毒載體誘導番茄抗TYLCV的方法，其特征在于：利用病毒載體在番茄體內表達病毒序列而誘導番茄對病毒產生抗性，根據已經報道的TYLCV基因組序列，利用生物信息學軟件(DNAStar，Madison，WI，USA)分析尋找其保守區段(ΔRep)，設計引物，以TYLCV侵染的番茄葉片總DNA為模板，擴增克隆目的保守片段(約350nts)。將該片段反向重復插入TYLCV隨機序列兩側(約200nts)。再用限制性酶BamHI和EcoRI介導克隆至沉默載體TRV2中，構建基于RNA干擾的表達hpRNA的植物沉默載體TRV2-ΔRep，利用電擊法導入農桿菌EHA105，浸潤番茄幼苗上部剛剛完全展開的葉片，從而使番茄獲得對TYLCV的抗性。采用本發明的方法，可以快速使番茄獲得對TYLCV的抗性，大大節約了傳統育種的成本。
【專利說明】一種利用病毒載體誘導番茄抗TYLCV的方法
一、【技術領域】:
[0001]本發明涉及簡便誘導番茄對TYLCV產生抗性的方法，具體是一種利用番茄自身抗病毒的規律，通過在番爺植株體內表達病毒序列從而使番爺植株產生對病毒的抗性。
二、【背景技術】:
[0002]番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow lea fcurl virus,TYLCV)是世界范圍內廣泛存在的一種植物單鏈DNA病毒，該病毒對番茄生產造成了嚴重的危害。自2006年該病害首次在我國上海地區發現以來，該病害已經蔓延到了浙江、江蘇、山東、河北等地，對我國的番茄生產構成了很大的威脅。RNA干擾(也稱RNA沉默)是近年發現的植物對病毒的自然抗性機制，利用該機制進行番茄抗TYLCV的研究有望獲得廣譜高抗的番茄材料，同時可為進一步揭示RNA介導的抗病機理研究提供理論依據，因而具有重要的理論意義和應用前景。
三、
【發明內容】
:
[0003]本發明提出一種通過利用病毒載體在番茄植株體內表達TYLCV序列從而誘導番茄對TYLCV產生抗性的方法。
[0004]本發明是這樣實現的:利用病毒載體在番茄體內表達病毒序列而誘導番茄對病毒產生抗性，根據已經報道的TYLCV基因組序列，利用生物信息學軟件(DNAStar，Madison,WI,USA)分析尋找其保守區段(Λ Rep)，設計引物，以TYLCV侵染的番茄葉片總DNA為模板，擴增克隆目的保守片段(約350nts)。將該片段反向重復插入TYLCV隨機序列兩側(約200nts)。再用限制性酶BamHI和EcoRI介導克隆至沉默載體TRV2中，構建基于RNA干擾的表達hpRNA的植物沉默載體·TRV2- Δ Rep,利用電擊法導入農桿菌EHA105，浸潤番茄幼苗上部剛剛完全展開的葉片，從而使番茄獲得對TYLCV的抗性。采用本發明的方法，可以快速使番茄獲得對TYLCV的抗性，大大節約了傳統育種的成本。
[0005]本發明的有益效果是:這種方法可以快速使番茄獲得對TYLCV產生抗性，省去傳統育種多代雜交選育的過程，節省了勞動力，降低成本。
四、【具體實施方式】:
[0006]1.病毒序列的選擇與克隆
[0007]根據已經報道的TYLCV基因組序列，利用生物信息學軟件(DNAStar，Madison，WI，USA)分析尋找其保守區段(Λ Rep)，設計引物，以TYLCV侵染的番茄葉片總DNA為模板，擴增克隆目的保守片段(約350nts)。
[0008]2.病毒表達載體構建
[0009]將該片段反向重復插入雙生病毒隨機序列兩側(約200nts)。再用限制性酶BamHI和EcoRI介導克隆至沉默載體TRV2中，構建基于RNA干擾的表達hpRNA的植物沉默載體TRV2- Δ R印，利用電擊法導入農桿菌EHA105。
[0010]3病毒載體的接種[0011]將農桿菌在平板培養基上劃線培養，挑取單菌落用液體培養基振蕩培養至OD值
0.6~1.0，利用注射器注射浸潤番茄幼苗上部剛剛完全展開的葉片，番茄苗嶺控制在3~4片 真葉期。
【權利要求】
1.一種利用病毒載體誘導番爺抗TYLCV的方法,其特征在于:利用病毒載體表達病毒序列從而誘導番茄對TYLCV產生抗性。
2.根據權利要求1所述的利用病毒載體誘導番茄抗TYLCV的方法，其特征在于:所使用的病毒載體為TRV2，所表達的序列為TYLCV序列。
3.根據權利要求1或2所述的利用病毒載體誘導番茄抗TYLCV的方法，其特征在于:構建的載體利用電擊法導入農桿菌，再通過農桿菌浸潤番茄葉片將病毒載體導入番茄植株內表達。·
【文檔編號】C12N15/113GK103849649SQ201210508803
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月3日 優先權日:2012年12月3日
【發明者】張輝, 朱為民, 朱龍英, 萬延慧, 劉娜, 田守波 申請人:上海市農業科學院, 上海科園種子有限公司