專利名稱：一種快速獲得三倍體枇杷的方法
技術領域：
本發明屬于生物育種技術領域，具體涉及一種快速獲得三倍體枇杷的方法。
背景技術：
枇杷屬薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(Mriobotrya)植物,原產我國，栽培品種為普通枇杷(E. 已有2100多年的栽培歷史(章恢志,彭抒昂，蔡禮鴻,等.中國枇杷屬種質資源及普通枇杷起源研究.園藝學報，1990，(1):5 11;邱武陵，章恢志.中國果樹志 (龍眼、枇杷卷).北京中國林業出版社，1996 ;黃金松.枇杷栽培新技術.福建福建科學技術出版社，2000)。我國枇杷資源豐富，分布區遍及北緯33.5°以南的19個省(直轄市、 自治區)。枇杷秋萌冬花，春實夏熟，在百果中獨具先天四時之氣，被譽為獨冠時新的佳果珍味。枇杷成熟期正值水果淡季，且果肉柔軟多汁，營養豐富，風味佳美，并具有化痰潤肺之功效。枇杷全身都是寶，除供鮮食外，還可以制罐、果膏、果汁、果露及釀酒，深受人們喜愛。發展枇杷業對調整農業產業結構和增加農民收入起著重要作用。隨著對枇杷深加工及其綜合利用的加強，其深度開發意義深遠。但由于枇杷果實種子較多，可食率相對較低，所以獲得無籽枇杷果實是人們夢寐以求的愿望。尤其是近年來枇杷成為商品價值高的水果后，無籽果的生產要求愈來愈突出。它不僅可以增加可食率、提高果實的商品價值，還可以避免授粉受精不良或冬季低溫凍害而造成的減產。但是，枇杷所固有的基因高度雜合與童期長等特點使常規育種方法受到較大限制，為此數十年來，國內外學者對無籽枇杷的研究主要集中在采用生長調節劑來誘導枇杷的單性結實(丁長奎，章恢志.植物激素對枇杷果實生長發育的影響.園藝學報，1988，15
(3):148 154; 丁長奎，陳其峰，夏起洲，等.生長調節劑對枇杷成熟期和品質的影響.中國果樹，1989 (I) : 13 15 ;Chaudhary, A. S. Singh, M. Singh, C. N. Effect of plant growth regulatora on maturity of loquat iBriobotrya japonica Lindl). Progress Hort, 1990，22:184 190 ;Chaudhary, A. S. Singh, M. Singh, C. N. Effect of NAA , 2, 4, 5-T and GA on loquat cultivar iSafeda Batiaj . India J. Agr. Res., 1993，28:127 132 ;蔣際謀，鄭少泉.‘長紅3號’枇杷噴布生長調節劑的效應.福建果樹， 1998 (2)13 14 ;張谷雄，康麗雪，高志紅，朱順蓮，高凱碧.GA和CPPU對枇杷無核果品質的影響·果樹科學，1999，16 (1):55 59 ;Wu J, Lin S. Effect of naphthaleneacetic acid on fruit in iJie fang zhong’ loquat. Liacer G, Badenes M L. Serie A: Seminaires Mediterraneens, NO. 58, Option Mediterraneens. Zaragoza: Instituto Agronomico Mediterraneo de Zaragoza, 2003. 109 112 ;陳俊偉，馮健君，秦巧平，劉曉坤，吳江，謝鳴.GA3誘導的單性結實‘寧海白’白沙枇杷糖代謝的研究.園藝學報，2006， 33 (3) :471 476)。雖然人工合成的生長調節劑在誘導西瓜(Citrullus vulgaris)、 番石槽(Psidium guajava)、番木瓜(Carica papaya)、油梨(Persea americana)、葡萄 (Vitis vinifera)、祀果(Mangifera indica)等產生無籽果實取得成功(Wong C Y(黃昌賢)·Induced parthenocarpy of watermelon, cucumber and pepper by the useof growth promoting substances . Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 1938, 36:632 636 ；Luckwill L C.The hormones content of the seed in relation endosperm development and fruit drop in the apple. J Hort Sci, 1948，24:32 44 ;黃昌賢·番木瓜的單性結果和單性結子問題.植物生理學通訊，1957 (2) 61 65 ；Crane J C. The chemical induction of parthenocarpy in the Calimyrna fig and its physiological significance. Plant Physiol, 1965，40:606 610),開創了人工刺激單性結實的歷史,但在枇杷上誘導結實均不理想，無論在花前、花后不同時期噴布赤霉素或赤霉素結合其它生長調劑物質(NAA、BA、CPPU、MH)，其結果都只能得到細長的無籽果實，或品質不好有種子的果實，而且無籽果的獲得率低下，效果不穩定，不具有商品價值(丁長奎，章恢志.植物激素對枇杷果實生長發育的影響.園藝學報，1988，15 (3) :148 154;盛寶龍，吳偉民.無核枇杷生產技術研究.中國南方果樹，1998，27 (5) :3 6 ;張谷雄，康麗雪，高志紅，朱順蓮， 高凱碧.GA和CPPU對枇杷無核果品質的影響.果樹科學，1999，16 (I) :55 59 ;張澤煌， 鄭少泉，劉友接，許秀淡，許家輝，蔡際謀，陳秀萍.無籽枇杷研究初報.亞熱帶植物科學， 2002,31 (1):9 13 ;陳俊偉，馮健君，秦巧平，劉曉坤，吳江，謝鳴.GA3誘導的單性結實‘寧海白’白沙枇杷糖代謝的研究·園藝學報，2006,33 (3) :471 476)。要想獲無籽枇杷，最主要同時也是最有效的方法則是選育出三倍體，利用三倍體的特性獲得無籽枇杷果實和新品種。福建農業科學院果樹研究所于1978年用秋水仙素處理‘太城4號’枇杷，再結合6tlCo-Y射線進行誘變，獲得四倍體枇杷‘閩3號’，在花期用GA 處理成功獲得了無籽枇杷果實(鄭少泉，許秀淡.枇杷輻射誘變育種研究I .枝條輻射的適宜劑量及性狀變異.中國南方果樹，1996，25 (3) :25 27)，雖然肉厚，可食率高，單核多，但產量低，很難直接在生產上應用(鄭少泉，許秀淡，蔣際謀等.枇杷品種與優質高效栽培技術原色圖說.北京中國農業出版社，2005:1 16)。我國學者已相繼在枇杷胚乳培養方面獲得了完整植株，經檢查其根尖細胞染色體數目為接近三倍體的非整倍體植株(陳振光，林順權，林慶良.枇杷胚乳培養獲得植株試驗初報.福建農學院學報，1983，12 (4) 343 345 ;林順權.枇杷胚乳離體培養獲得植株的研究.福建農學院學報，1985，14 (2) 115 117;彭嘵軍，王永清.枇杷胚乳愈傷組織誘導和不定芽發生的研究.四川農業大學學報，2002，20 (3) :189 192)。利用胚乳培養獲得三倍體植株是培養無籽枇杷的可能途徑，但至今仍未見其生長結果的進一步報道。最富成效的是日本農業綜合研究中心暖地園藝石開究所的Muranishi (Muranishi S. Effect of gibberellic acid (GA ) on the seedless fruiting of artificial polyploids in loquats (Briobotrya japonica Lind. L). Acta Horticulturae, 1982，137:343 347)與八幡茂木(八幡茂木.生產無核枇杷的新途徑一一利用三倍體.許建國譯.柑桔與亞熱帶果樹信息，1999，(6):32 33)，他們利用在葡萄等果樹上常用的三倍體技術，從上世紀80年代開始，以千葉縣代表性同源四倍體品種 ‘田中’ (Tanaka)為母本，回交二倍體親本，從200個株系篩選出一個最優株系‘希房’，但枇杷單性結實能力弱，無籽果實發育不良，三倍體幾乎都在開花后脫落。因此必須結合激素的使用，才可獲得具商品價值的果實，此果實不會混雜有種子的果實，而且所用植物生長調節劑的濃度低，具有經濟栽培價值。從而使日本在三倍體雜交育種方面處于世界領先地位。但雜交育種存在年限長，需要有四倍體親本供體，同時該四倍體親本還要具有良好的育性，此外，該三倍體枇杷還存在一些不足首先是商品化率不高(只有60%左右)，其次與有籽果實相比，果實品質還是欠佳，有待進一步篩選親本材料以及結合相應的栽培管理措施。國內在這方面的研究尚未見報道。綜上所述，目前已經有學者嘗試利用三倍體培育無籽枇杷果實或植株，但是其周期長、數量少、效率低，而且果實品質不佳，因此快速獲得三倍體枇杷的方法具有重要的實際應用價值，但國內外尚未見相關研究報道。發明目的
鑒于現有技術存在的問題，本發明的目的是提供一種快速獲得三倍體枇杷的方法，其最大的優點就是快速、高效，能夠在短期內獲得大量的三倍體枇杷植株，為無籽枇杷新品種的選育打下堅實的基礎。1993年，在進行“四川枇杷屬種質資源調查與評價”研究時，首次發現枇杷種子獨特的遺傳規律——高頻產生三倍體的現象。1997年本發明申請人對四川主要栽培品種進行了染色體系統研究，又發掘出不同比率的天然三倍體，經重復檢查，均屬純合三倍體，生長正常。之后,本發明申請人開始了大量生產三倍體枇杷的研究。本發明所述的一種快速獲得三倍體枇杷的方法，主要通過對枇杷種子進行根尖染色體檢測從而篩選獲得三倍體，依次通過以下步驟實現
(1)收集枇杷種子，于20°c恒溫萌發催芽；
(2)待枇杷根長至1-2厘米時，取根尖用濃度為O.002摩爾/升的8-羥基喹啉水溶液避光浸泡處理3小時，播種取了根尖的種子；
(3)處理后的根尖用卡諾氏固定液浸泡處理2-24小時，卡諾氏固定液為甲醇冰醋酸體積比=3:1的混合液；
(4)切取1-2毫米根尖，用蒸餾水清洗后，用濃度均為O.03克/毫升的纖維素酶與果膠酶混合酶液浸泡處理3小時；
(5)根尖用蒸餾水浸泡10分鐘，然后用卡諾氏固定液固定，卡諾氏固定液為甲醇冰醋酸體積比=3:1的混合液；
(6)將固定好的根尖均勻涂抹在載玻片上，用磷酸緩沖液(0.01克/毫升的磷酸氫二鈉溶液0. 01克/毫升的磷酸二氫鉀溶液體積比=6 4的混合液)稀釋的體積比濃度為5% 的Giemsa染色液染色，顯微鏡檢查染色體數目，確定根尖對應的三倍體種子；
(7)將三倍體種子進行常規栽培管理，即得到三倍體枇杷植株。


圖I為實生篩選獲得的天然三倍體枇杷幼苗及其體細胞染色體數目(2n=3x=51) 本發明的優點或積極效果
傳統的三倍體選育技術周期長(要獲得三倍體枇杷，雜交育種一般至少6年)、效率低、 成本高、得到三倍體數量較少。利用本發明方法篩選得到的三倍體數量多，比例大，平均達到O. 406%,且不需要特殊的儀器設備，操作簡單，容易掌握，工作效率較高，平均每人每天能夠檢測200-300顆種子，大大提高了枇杷三倍體育種的效率。該發明具有快速(當天即可確定三倍體種子)、高效和一步獲得大量三倍體枇杷的優點。
具體實施方式
實施例現在對本發明進行進一步詳細說明，利于達到最佳效果，但不是對本發明的限制， 本領域技術人員可以對其進行相應的改良。(I)準備河沙，用高壓滅菌鍋在121°C下高溫高壓消毒20分鐘，降溫至室溫備用；
(2)準備帶透氣孔的塑料箱，將消毒后備用的河沙用清水拌濕，以用手捏沙能成團但又不出水為宜，然后將拌好的河沙鋪在塑料箱中，整理松軟平整，厚度約為15-20厘米；
(3)收集枇杷種子，用清水洗凈，然后用100毫克/升的多菌靈溶液浸泡10分鐘，再用清水漂洗I 一 2次備用；
(4)將準備好的種子逐粒播種于塑料箱中的河沙里，種臍朝下，播種深度為種子高度的三分之二，然后在上面加一層塑料沙網，再鋪上1-2厘米厚消毒備用的河沙，置于20°C的室內，保濕萌發催芽；
(5)大約一周左右，種子開始萌發長出新根，當根長至1-2厘米時，用醫用鑷子夾取根尖部分(長度約5毫米)，放入裝有濃度為O. 002摩爾/升的8-羥基喹啉水溶液的I. 5毫升離心管中，將夾取根尖的種子依次播種于裝有已消毒處理河沙的穴盤中，穴盤中的種子編號與離心管中根尖編號對應，將裝有根尖的離心管置于20°C避光浸泡處理3小時；
(6)前一步處理時間達到3小時后，用膠頭滴管吸出離心管中的8-羥基喹啉溶液，加入新配制的卡諾氏固定液(甲醇冰醋酸體積比=3:1)處理2-24小時；
(7)待前一步處理結束，將固定液吸出，并用刀片切取根尖(長度1-2毫米)放入I.5 毫升離心管中，用無菌蒸餾水反復清洗2-3次，加入濃度均為O. 03克/毫升的纖維素酶與果膠酶混合酶液20微升處理3小時；
(8)待前一步處理結束，輕輕吸出酶液，保證根尖不散碎，用無菌蒸餾水浸泡根尖10分鐘，然后輕輕吸出蒸餾水，加入新鮮配制的卡諾氏固定液(甲醇冰醋酸體積比=3:1)；
(9)用尖嘴眼科鑷子輕輕夾出根尖，在載玻片上快速涂抹，直到根尖成細微糊狀，然后滴上少許卡諾氏固定液，向載玻片表面輕輕吹氣，迅速在酒精燈上烘烤1-2秒鐘；
(10)準備干凈的玻璃板，放置兩根干凈直徑約I毫米的竹棍，將制備好的載玻片放于竹棍上，涂抹面朝下，加入用磷酸緩沖液(O. 01克/毫升的磷酸氫二鈉溶液0. 01克/毫升的磷酸二氫鉀溶液體積比=6 4)稀釋的體積比濃度為5%的Giemsa染色液染色5_10分鐘， 用自來水沖洗干凈，空氣晾干；
(10)根據所取根尖的編號，在載玻片上進行標記，然后利用顯微鏡檢查，統計染色體數目，鑒定篩選出所需要的三倍體個體；
(11)根據對應的編號，找出三倍體種子，進行常規栽培管理，從而獲得三倍體植株。1997-2007年，利用本發明方法對國內22個主栽品種和日本引進的5個品種的 63472粒種子進行了檢測，成功獲得258株三倍體突變體，其平均頻率為O. 406% (如表I)。表I 27個枇杷品種的天然三倍體檢出頻率
權利要求
1.一種快速獲得三倍體枇杷的方法，其特征在于依次通過以下步驟實現(1)收集枇杷種子，于20°c恒溫萌發催芽；(2)待枇杷根長至1-2厘米時，取根尖用濃度為O.002摩爾/升的8-羥基喹啉水溶液避光浸泡處理3小時，播種取了根尖的種子；(3)處理后的根尖用卡諾氏固定液浸泡處理2-24小時，卡諾氏固定液為甲醇冰醋酸體積比=3:1的混合液；(4)切取1-2毫米根尖，用蒸餾水清洗后，用濃度均為O.03克/毫升的纖維素酶與果膠酶混合酶液浸泡處理3小時；(5)根尖用蒸餾水浸泡10分鐘，然后用卡諾氏固定液固定，卡諾氏固定液為甲醇冰醋酸體積比=3:1的混合液；(6)將固定好的根尖均勻涂抹在載玻片上，用磷酸緩沖液稀釋的體積比濃度為5%的 Giemsa染色液染色，顯微鏡檢查染色體數目，確定根尖對應的三倍體種子；磷酸緩沖液為O.01克/毫升的磷酸氫二鈉溶液0. 01克/毫升的磷酸二氫鉀溶液體積比=6 4的混合液；(7)將三倍體種子進行常規栽培管理，即得到三倍體枇杷植株。
全文摘要
一種快速獲得三倍體枇杷的方法，通過將枇杷種子催芽、取尖用8-羥基喹啉水溶液避光浸泡處理、卡諾氏固定液浸泡處理、纖維素酶與果膠酶混合酶液浸泡處理、卡諾氏固定液固定后，涂抹于載玻片上，顯微鏡檢查染色體數目，確定根尖對應的三倍體種子。利用本發明方法篩選得到的三倍體數量多，比例大，平均達到0.406％，且不需要特殊的儀器設備，操作簡單，容易掌握，工作效率較高，大大提高了枇杷三倍體育種的效率。該發明具有快速(當天即可確定三倍體種子)、高效和一步獲得大量三倍體枇杷的優點。
文檔編號A01H1/08GK102577940SQ20121005840
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者何橋, 向素瓊, 孫海燕, 李曉林, 李艷梅, 梁國魯, 汪衛星, 郭啟高 申請人:西南大學