專利名稱：花藥絨氈層特異表達啟動子POsABCG15、重組表達載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及花藥絨氈層特異表達啟動子/^5^ 仏75，還涉及花藥絨氈層特異表達啟動子的重組表達載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻(ftrza Miira)是主要糧食作物之一，全世界約有一半人口以稻米為主食。 在我國，水稻播種面積為全國糧食作物播種面積的30%，而總產(chǎn)量卻占糧食作物產(chǎn)量的似％ 以上，其重要原因就是水稻雜種優(yōu)勢的成功應(yīng)用。Jones早在1擬6年就發(fā)現(xiàn)了水稻雜種優(yōu)勢現(xiàn)象。但水稻為自交結(jié)實作物，難以獲得大量的、純度高的雜交種，阻礙了水稻雜種優(yōu)勢利用的進程，直到1970年我國李必湖發(fā)現(xiàn)野敗不育株。1973年“雜交水稻之父”袁隆平的研究團隊，經(jīng)過刻苦專研，實現(xiàn)了三系配套，1976年開始大面積推廣雜交水稻，使水稻雜種優(yōu)勢成為現(xiàn)實。直到現(xiàn)在，不育系仍是水稻雜種優(yōu)勢利用的主要途徑。目前，人們主要通過質(zhì)核互作不育系(三系法)和溫光敏不育系(兩系法)來實現(xiàn)水稻的雜種優(yōu)勢。然而，由于質(zhì)核互作不育系配組不自由，可利用的親本有限，種子生產(chǎn)比兩系法復(fù)雜，溫光敏不育系的育性受自然溫光條件影響，大面積制種風(fēng)險大等原因，使得水稻的雜種優(yōu)勢無法通過這兩種不育系得到充分體現(xiàn)。花藥絨氈層特異表達啟動子能夠調(diào)控下游基因特異表達于花藥絨氈層組織，而通過花藥絨氈層特異表達相關(guān)基因能影響花藥和花粉的發(fā)育獲得雄性不育系。因此，急需一種花藥絨氈層特異表達啟動子，能夠為利用基因工程手段獲得雄性不育系和恢復(fù)系提供有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供花藥絨氈層特異表達啟動子該啟動子調(diào)控目的基因特異表達于花藥絨氈層，控制小孢子發(fā)育成可育花粉的相關(guān)基因的表達，能夠用于產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有重要作用，技術(shù)方案為
花藥絨氈層特異表達啟動子P0sABCG15,所述花藥絨氈層特異表達啟動子P0sABCG15 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 31所示。本發(fā)明的目的之二在于提供花藥絨氈層特異表達啟動子的重組表達載體，其技術(shù)方案為
含有所述花藥絨氈層特異表達啟動子的重組表達載體。優(yōu)選的，所述重組表達載體是在pCAMBIA130021載體Gtt？基因前載入花藥絨氈層特異表達啟動子P0sABCG15。本發(fā)明的目的之三在于提供花藥絨氈層特異表達啟動子的應(yīng)用，技術(shù)方案為所述花藥絨氈層特異表達啟動子在介導(dǎo)外源基因特異表達于花藥絨氈層的應(yīng)用。進一步，所述外源基因為OsABCG 15基因。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明公開的花藥絨氈層特異表達啟動子
該啟動子調(diào)控目的基因特異表達于花藥絨氈層，在水稻中調(diào)控水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因表達，影響花藥和花粉表面脂類積累，當(dāng)表達受阻能夠產(chǎn)生水稻雄性不育系；本發(fā)明還公開了花藥絨氈層特異表達啟動子的重組表達載體，可以用作花藥絨氈層特異表達基因的啟動子，在重組表達載體的花藥絨氈層特異表達啟動子 / ^ ^^調(diào)控下使下游基因定位于花藥絨氈層表達，為植物基因工程領(lǐng)域研究基因在花藥絨氈層特異表達提供了工具，具有廣泛的應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為本發(fā)明突變體和正常的近等基因系II-32B花藥和花粉形態(tài)學(xué)觀察示意圖(Sp表示染色花粉，Ac表示花藥殘渣)。圖2為本發(fā)明0sAB(X15座位定位和突變位點示意圖。圖3為本發(fā)明花藥絨氈層特異表達啟射POsABCG15調(diào)控基因特異表達分析圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。術(shù)語“花藥表皮和花粉壁脂類沉積的基因”指編碼具有運輸脂類到花藥表皮和花粉壁的ABC-2型轉(zhuǎn)運蛋白的核酸序列，堿基序列如SEQ ID NO. 2中第1-2067位所示的核苷酸序列及其簡并序列。簡并序列是指，位于SEQ ID N0. 2序列的編碼框第1-2067位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID N0. 2中第1-2067位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID N0. 2中從核苷酸第1 一 2067位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID N0. 2中從核苷酸第1 一 2067位的核苷酸序列的同源性至少 70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的調(diào)控花藥和花粉壁脂類積累的相同功能的蛋白的SEQ ID N0. 2中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地 1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/ 或3，端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5 個以內(nèi))核苷酸。
術(shù)語“花藥表皮和花粉壁脂類沉積的蛋白”指具有運輸脂類到花藥表皮和花粉壁的ABC-2型轉(zhuǎn)運蛋白活性的、具有SEQ ID NO. 1序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然影響花藥表皮和花粉壁脂類沉積的ABC-2型轉(zhuǎn)運蛋白SEQ ID NO. 1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能；在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。術(shù)語“啟動子”指為RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。在DNA指導(dǎo)下RNA的合成稱為轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的起始由DNA的啟動子控制。實施例中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本實施例的水稻花藥表皮和花粉壁脂類轉(zhuǎn)運相關(guān)多肽時，可以將該蛋白的編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成調(diào)控水稻花藥表皮和花粉壁脂類轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達載體。相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本實施例所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。除了用重組法產(chǎn)生之外，實施例中蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。可以分別化學(xué)合成本實施例蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。 實施例1、OSabCg15突變體植株的獲得和形態(tài)學(xué)的觀察
秈稻縉恢1號突變體，命名為05^/^^75突變體，由本實驗室保存，用II-32B作輪回親本，與05^/^^75突變體雜交和隔代回交，最終將突變體保存下來，該不育材料同II-32B 為一對近等基因系。05^/^^75突變體與II-32B雜交，F(xiàn)l代全部為可育，自交F2代中出現(xiàn)分離，其中正常植株為567，突變株為187，比例符合3:l(x 2 = 0. 0071<x0.05 = 3. 84)，表明該雄性不育突變體表型由一個單核基因突變造成。對突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察II-32B稻穗結(jié)實后下垂(圖IA左)，而05^/^^75突變體小穗不結(jié)實呈直立狀(圖IA 右)；II-32B花藥包含成熟花粉呈現(xiàn)為黃色(圖IB上)，osabcgl5突變體花藥為白色(圖 IB下)；II-32B花粉碘染為黑色(圖IC上)，突變花藥中無花粉，在碘液中搗碎后只有花藥殘渣(圖IC下)。實施例2、OsABCG 15基因的定位和克隆一、定位群體
將OSabcgl5突變體與粳稻日本晴雜交，自交獲得F2代，選擇雄性不育植株為定位群體。二、提取水稻DNA親本采用改進的CTAB法進行提取，包括如下步驟取葉片0. 1-0. 2克(約半片)放到小研缽中，加入適量的液氮，立刻研磨至粉狀，裝入2ml離心管，加入700μ L 100°C預(yù)熱的 1. 5 X CTAB溶液于離心管中，小心混勻后放入65°C水浴，20分鐘后取出離心管，加入等體積氯仿/異戊醇，猛烈混勻，13000rpm離心10分鐘，取上清于新管中，加入900 μ L無水乙醇混勻后-20°C放半小時以上。將析出的DNA離心，HOOOrpm離心10分鐘。去掉上清，將沉淀用 ImL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇清洗一次，離心干燥，溶于200 μ L TE溶液中，4°C冰箱保存。定位群體的單株DNA采用改進的堿煮法提取，包括如下步驟剪碎嫩葉片l-2cm2放入0. 5ml離心管，加入100 μ L濃度為0. 125Μ的NaOH溶液，沸水浴30秒，然后加入50 μ L濃度為1. OM 的Tris-HCl (ρΗ8· 0)，最后加入100 μ L濃度為0. 125Μ的HC1，沸水浴2分鐘后4°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ⑷后w分離分析初定位
設(shè)計137對多態(tài)性標(biāo)記，其中包括42對SSR引物和95對hDel分子標(biāo)記引物。其中SSR引物根據(jù)已發(fā)表的序列合成(具體參見http://www. gramene. org. microsat/ssr. html)，其他InDel分子標(biāo)記設(shè)計是根據(jù)比較粳稻日本晴和秈稻9311兩品系的已公布的核酸序列，對差異的部分設(shè)計引物，驗證2個親本粳稻日本晴和秈稻osabCgl5突變體之間的多態(tài)性。將設(shè)計的137對引物分別擴增水稻雄性不育植株和水稻親本基因組DNA，PCR擴增程序為10 μ L體系中，1 μ L模板，1 μ L IOpmol/ μ L上游引物，1 μ LlOpmol/μ L下游引物， 1 μ L IOXBuffer (Mg2 + )，1 μ L 2mM dNTP，0. 1 μ L Taq，3· 9 μ L 水；PCR 產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10%的PAGE膠電泳，銀染方法檢測。結(jié)果顯示，137對標(biāo)記進行擴增反應(yīng)，Chr6Ind (-37-1)引物(如表1所示)對親本與F2代選擇雄性不育植株存在差異，表明6號染色體上的標(biāo)記Chr6hd (-37-1)與A^SCiWS基因座位有明顯的連鎖關(guān)系。四、精細(xì)定位
用不育單株對6號染色體上的標(biāo)記Chr6hd(-37-l)附近有差異SSR標(biāo)記進行驗證，發(fā)現(xiàn)冊36觀引物對(如表1所示)和RM5371引物對(如表1所示)分別有6個和38個的重組子而且重組子不相互包含，這說明6M召⑶75基因座位應(yīng)位于冊36觀和RM5371兩個分子標(biāo)記之間。為了對OM召CiW^基因進一步精細(xì)定位，將用于定位的突變株擴大到近2157株，又在冊36沘和RM5371間設(shè)計了 20對SSR引物，6對InDel引物和23對STS引物，20對SSR 引物中冊20；356、RM20361、RM20366、冊275和RM275引物對存在差異，6對hDel引物中 Chr6Ind(-30) ,Chr6Ind(-7)和 Chr6hd(4)引物對存在差異，23 對 STS 引物中 Chr6STS20、 Chr6STS13和Chr6STS15引物對存在差異。用有差異的引物對定位群體進行分析，最終將 OsABCG 15基因定位在Chr6hd (-30 )和Chr6STS 13之間，如圖2A所示。經(jīng)分析表明，該區(qū)域只包含1個編碼基因，該基因編碼ABC-2型轉(zhuǎn)運蛋白，編碼該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，與擬南芥雄性不育基因肪同源，通過對該基因的兩次測序，發(fā)現(xiàn)突變體在該基因的第4個外顯子處發(fā)生一個堿基的替換 (A變?yōu)镃)，如圖2B所示。基因定位所用標(biāo)記的序列如表1所示。 表1基因定位分子標(biāo)記及其引物序列
權(quán)利要求
1.花藥絨氈層特異表達啟動子其特征在于所述花藥絨氈層特異表達啟動子P0sABCG15的核苷酸序列如SEQ ID NO. 31所示。
2.含有權(quán)利要求1所述花藥絨氈層特異表達啟動子的重組表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述花藥絨氈層特異表達啟動子的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是在PCAMBIA130021載體Gtt？基因前載入花藥絨氈層特異表達潔動子 P0sABCG15。
4.權(quán)利要求1所述花藥絨氈層特異表達啟動子在介導(dǎo)外源基因特異表達于花藥絨氈層的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述外源基因為基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了花藥絨氈層特異表達啟動子POsABCG15，該啟動子具有如SEQIDNO.31所示核苷酸序列，該啟動子可調(diào)控目的基因特異表達于花藥絨氈層，在水稻中POsABCG15調(diào)控水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因OsABCG15的表達，影響花藥和花粉表面脂類積累，能夠用于產(chǎn)生新的水稻雄性不育系或調(diào)控其他基因在絨氈層中表達，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有重要作用。
文檔編號A01H5/02GK102559685SQ20121006344
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者呂俊, 張毅, 楊昆, 武麗娜, 王忠偉, 管玉圣, 趙勇, 黃遠新 申請人:西南大學(xué)