GhTZF1基因在增強植物抗旱性及延緩衰老中的應用的制作方法【專利摘要】本發明屬于植物基因工程【
技術領域：
】，具體涉及一種分離自棉花的GhTZF1基因的分離克隆、功能驗證及應用。本發明克隆的GhTZF1基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；其編碼基因的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本發明還公開了該基因在提高擬南芥對干旱的耐受性及延緩干旱脅迫下的植株衰老中的應用。【專利說明】GhTZFI基因在增強植物抗旱性及延緩衰老中的應用【
技術領域：
】[0001]本發明屬于植物基因工程【
技術領域：
】。具體涉及一種從棉花中分離、鑒定的CCCH型轉錄因子GhTZFl的功能驗證與應用。功能驗證表明GhTZFl基因能提高擬南芥對干旱的耐受性以及能夠延緩干旱誘導的衰老，同時也能延緩H2O2誘導的衰老。利用本發明克隆的GhTZFl基因，通過遺傳轉化可應用于增強植物對干旱的耐受性以及延緩干旱造成的衰老。【
背景技術：
】[0002]干旱是指可充足利用的水分短缺而導致產量減少，或者指一段時間沒有降雨或者灌溉而影響作物的生長的一種狀態(Bernieretal.,2008,Breedinguplandricefordroughtresistance.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,88:927-939)。據統計，全球約1/3的可耕地處于供水不足的狀態，而其他耕地也常受到周期性的難以預料的旱災影響，干旱嚴重制約著農業生產(Salekdehetal.,2009,Conceptualframeworkfordroughtphenotypingduringmolecularbreeding.Trendsinplantscience,14:488-496)。在非生物逆境脅迫中，干旱是影響農作物產量的主要非生物因素。干旱在我國平均每兩年發生一次，嚴重影響了糧食作物和經濟作物的生長與產量，因此通過抗旱育種提高作物的抗旱性或耐旱性已成為干旱和半干旱地區發展農業的重要手段之O[0003]植物的葉片衰老是植物發育進程的一部分，伴隨著年齡增長而發生。但是，植物的葉片衰老也受各種各樣的內部和外部環境因子影響。對農作物而言，葉片衰老會限制農作物產量。影響葉片衰老的環境因子包括生物和非生物逆境，如:干旱、極端溫度、饑餓、氧化脅迫、病原侵染等(Limetal.，2007，LeafSenescence.AnnualReviewofPlantBiology,58:115-136)。作物受到干旱脅迫后，葉片的光合速率和呼吸速率受到影響，葉片衰老加速，作物生長受到抑制，在細胞水平上，膜脂過氧化，細胞物質代謝紊亂(黃沆和陳光輝，2010，水稻抗旱機制及相關基因研究進展，科技信息)。[0004]由逆境脅迫引起的葉片衰老可能是由活性氧的產生而造成的葉綠體降解(RenuKhanna-Chopraj2012，Leafsenescenceandabioticstressessharereactiveoxygenspecies-mediatedchloroplastdegradation.Protoplasma,249:469-481)。前人研究表明干旱誘導的衰老是由于葉綠體抗氧化保護的缺失而引起的(Boschetal.，2001，Drought-1nducedsenescenceischaracterizedbyalossofantioxidantdefencesinchloroplast.Plant,CellandEnvironment,24:1319-1327)0黑暗誘導的葉片衰老是由于活性氧增加而導致葉綠素降解(Rosenvasseretal.，2006，Increaseinreactiveoxygenspecies(ROS)andinsenescence-associatedgenetranscript(SAG)levelsduringdark-1nducedsenescenceofPelargoniumcuttings,andtheeffectofgibberellicacid.Plantscience，170(4):873-879)。通過對耐干旱和不耐干旱的作物比較發現作物對干旱的耐受性是由于增強了抗氧化脅迫的能力(ChopraandSelotej2007，EnvironmentalandExperimentalBotany.60，276-283)。通過轉基因技術來延緩葉片的衰老而增強了植株的抗旱性的研究也有少量報道。在煙草中通過SARK啟動子驅動表達IPT基因，發現轉基因植株抗旱性顯著提高；在干旱脅迫下，轉基因植株衰老延緩，體內雙氧水含量低于野生型，同時抗氧化保護的物質高于野生型(Riveroetal.，2007.Delayedleafsenescenceinducesextremedroughttoleranceinafloweringplant.PNAS)。將擬南芥14_3_3蛋白轉入棉花后,發現轉基因植株衰老延緩,抗旱性提高(Yanetal.,2004,OverexpressionoftheArabidopsisl4-3_3proteinGF14Aincottonleadstoa“stay-green，，phenotypeandimprovesstresstoleranceundermoderatedroughtconditions.Plantandcellphysiology,45，1007-1014)。綜合前人研究表明，植株調控活性氧水平的能力與其耐逆境脅迫的能力相關，植物具有一套自我保護和修復機制來抵御體內的氧化脅迫，包括一些將(V離子轉化成雙氧水以及清除雙氧水的酶和一些維持細胞內氧化還原穩態的抗氧化保護物質。[0005]在擬南芥中，CCCH類鋅指蛋白具有68個成員，它們具有一個典型的鋅指結構域由CX6_14Cx4_5Cx3H組成，其中X代表任意氨基酸。CCCH類鋅指蛋白具有1-6個CCCHmotifs，根據鋅指結構域中半胱氨酸和組氨酸的距離和鋅指結構域的數目，將擬南芥CCCH超家族分為11個亞家族。其中第九亞家族是植物所特有的串聯鋅指蛋白，該亞家族除具有典型的Cx7Cx5Cx3H-X16-Cx5Cx4Cx3H串聯鋅指結構域外，在其上游還具有一個植物所特有的鋅指結構域Cx5H-X4-Cx3H,其中X代表任意氨基酸。表達分析表明該亞家族成員可能參與了植物對逆境的響應(Wangetal.,2008,Genome-wideanalysisofCCCHzincfingerfamilyinArabidopsisandrice.BMCGenomics,9，44)。迄今為止，一些植物特有的TZF基因的功能相繼被報道。PEIl(AtTZF6)參與了擬南芥胚胎發育過程(ZhongsenLiandTerryL.Thomas,1998,ThePlantCell,10,383-398)；SOMNUS(AtTZF4)參與了光依賴的種子萌發(Kimetal.,2008,S0MNUS,aCCCH-TypeZincFingerProteininArabidopsis,NegativelyRegulatesLight-DependentSeedGerminationDownstreamofPIL5.ThePlantCell,20,1260-1277)；AtSZFl(AtTZFll)和AtSZF2(AtTZFlO)負調控了鹽響應基因的表達而參與了植物對高鹽的響應過程(Sunetal.,2007,TheCCCH-TypeZincFingerProteinsAtSZFlandAtSZF2RegulateSaltStressResponsesinArabidopsis.PlantCellPhysiol.48(8)，1148-1158)。這些植物特有的TZF基因參與了一些發育和逆境響應過程，但是對相應的調控機制仍然有待挖掘。在煙草中超量表達GhZFPl增強了轉基因煙草的耐鹽性以及提高了轉基因煙草的抗病性，酵母雙雜交結果顯示該基因可能與RD21A和PR5互作(Guoetal.,2009,GhZFPl,anovelCCCH-typezincfingerproteinfromcotton,enhancessaltstresstoleranceandfungaldiseaseresistanceintransgenictobaccobyinteractingwithGZIRD21AandGZIPR5.NewPhytol,183，62-75)。目前，尚未有從棉花中分離克隆的TZF類基因參與植物的抗旱性及延緩干旱誘導的衰老的報道。【
發明內容】[0006]本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，從陸地棉中分離克隆一個與棉花抗逆和發育相關的轉錄因子，通過轉化擬南芥，驗證其在抗旱和延緩葉片衰老中的功能。[0007]我們基于棉花細胞壁重建的差減文庫(Yangetal.,2008,Expressionprofileanalysisofgenesinvolvedincellwallregenerationduringprotoplastcultureincottonbysuppressionsubtractivehybridizationandmacroarray.JExpBot，59:3661-3674)，分離到在細胞壁重建過程中差異表達的GhTZFl基因，超量表達與GhTZFl具有較高同源性的AtTZFl基因后增強了擬南芥的抗旱性和耐冷性(Linetal.,2011,TheArabidopsistandemzincfingerproteinAtTZFlaffectsABA—andGA—mediatedgrowth,stressandgeneexpressionresponses.PlantJournal,65，253-268);超量表達AtTZF2和AtTZF3增強了擬南芥的抗旱性(Leeetal.,2012,ArabidopsisZincFingerProteinsAtC3H49/AtTZF3andAtC3H20/AtTZF2areInvolvedinABAandJAResponses.PlantCellPhysiol,53，673-686)。但是這些基因都是通過ABA或JA介導的。GhTZFl基因對ABA沒有響應，我們發現GhTZFl基因參與植株抗旱性及延緩干旱誘導的衰老，同時能延緩多種逆境脅迫下地植株衰老可能是通過調控植株體內的氧化還原平衡穩態而介導的。[0008]本發明通過如下技術方案實現:[0009](I)本發明從棉花中分離得到一個與棉花抗逆和發育相關的轉錄因子基因GhTZFl，它的核苷酸序列如序列表SEQNO:1所示，在該序列表中的第20-1109位所示的序列是該基因的編碼區，其編碼的蛋白與擬南芥中的AtTZFl，AtTZF2，AtTZF3基因的同源性分別為52.69%，54.92%和52.13%，聚類分析表明該基因編碼的蛋白與AtTZFl同源度最高，我們將這個基因命名為GhTZFl基因。根據測序驗證后的該基因全長cDNA序列信息構建了該基因的超表達載體，它是序列表SEQNO:2中的第1-362位所示的DNA序列。[0010]本發明的轉錄因子的基因(核苷酸序列見SEQIDN0:1)來源于棉花，其由1089個堿基組成，蛋白質編碼序列有362個氨基酸組成，它是SEQIDNO:1所示序列的自5’端第20位堿基到1109位堿基組成。該基因在對逆境脅迫，激素以及棉花生長發育的影響上尚未有任何報道。通過不同的脅迫處理及激素處理野生型(非轉基因)棉花，檢測該基因在野生型棉花中的表達情況，發現該基因受干旱(PEG)、鹽(NaCl)，茉莉酸(JA)的誘導表達(見圖2)。通過構建該基因的超量表達載體PK2GW7.0(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)，獲得轉化載體PK2GW7.0-GhTZFl(見圖3C)，將該轉化載體轉化到哥倫比亞生態型擬南芥中，得到該基因的超表達轉基因陽性擬南芥植株，檢測其表達量并選取具有合適表達量的兩個純系進行后續實驗(見圖4)。當對野生型擬南芥以及超表達轉基因擬南芥植株進行PEG(水勢為-0.5MPa)模擬干旱處理時，發現在正常條件的培養基上，超表達擬南芥和野生型擬南芥的萌發率一致，而在PEG存在的培養基上，轉基因擬南芥的萌發率明顯高于野生型擬南芥，說明該基因的超量表達可以提高擬南芥對PEG的抗性(見圖5A和圖5B)。通過黑暗處理離體葉片時，相對于對照而言，黑暗促進了葉片衰老，但是與野生型比較而言，超表達擬南芥植株葉片受黑暗誘導的衰老被顯著延緩(圖5C)。表明該基因可以抑制黑暗誘導擬南芥葉片的衰老。通過用茉莉酸甲酯處理擬南芥離體葉片時，相對于平行對照而言，擬南芥葉片的衰老加速，但是與野生型擬南芥相比，超表達擬南芥植株葉片受茉莉酸甲酯誘導的衰老被顯著延緩(圖OT)。表明該基因能夠抑制茉莉酸所調控的擬南芥葉片衰老。通過用雙氧水處理離體擬南芥葉片時，相對于平行對照，擬南芥葉片的衰老加速，但是野生型的擬南芥葉片衰老顯著快于超表達擬南芥植株葉片(圖5E)。這說明該基因能夠延緩雙氧水誘導的擬南芥葉片衰老，即該基因能夠增強植株耐氧化脅迫的能力。通過干旱處理成株期擬南芥發現，超量表達擬南芥轉基因植株的萎焉程度明顯低于野生型擬南芥(圖6A-a，b)，對其相對含水量的測定發現，正常情況下轉基因植株與野生型植株的相對含水量一致，但是受到干旱脅迫后，野生型擬南芥的相對含水量顯著低于轉基因擬南芥植株(圖6B)。說明超量表達該基因能提高擬南芥植株的抗旱性。對植株體內雙氧水含量的測定發現，受到干旱脅迫后，野生型擬南芥雙氧水含量的升聞聞于超表達擬南芥植株(圖6C),檢測與氧化脅迫相關的裳老相關基因的表達，發現在干旱情況下，野生型擬南芥中這些基因的表達明顯高于超表達系(圖6D)。說明該基因會影響植株體內雙氧水含量，并且會影響植株在逆境脅迫下的衰老。通過進一步延長干旱時間后發現，轉基因植株顯著延緩了干旱誘導的衰老(圖6A中的c至圖6A中的h)，通過測定MDA的含量來評價膜脂過氧化的程度發現，在受到干旱脅迫后，超表達擬南芥植株的MDA含量顯著低于野生型擬南芥(圖6E)，表明超表達擬南芥植株的膜脂過氧化程度顯著低于野生型擬南芥植株，這些說明該基因具有調控擬南芥植株在逆境脅迫下的氧化還原穩態的能力。[0011]具體地，本發明的操作步驟如下:[0012]I)通過RACE擴增出GhTZFl的5’和3’端，將序列拼接后得到GhTZFl的cDNA序列,根據測序的序列設計超表達載體的引物，以棉花cDNA為模板，擴增其全長(翻譯起始位點至下游1086個堿基)，獲得DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0013]2)將步驟I)中擴增得到的全長ORF片段連接到中間載體HX)NRtm221(購自Invitrogen公司，美國，)上，通過BP-LR反應，將該片段連接到超表達載體PK2GW7.0(比利時國立根特大學惠贈)上，再通過熱激轉化大腸桿菌感受態細胞TOPlO中，獲得GhTZFl超表達轉化載體。利用農桿菌介導的轉基因方法，將所述的載體導入擬南芥中，獲得轉化植株GhTZFl。[0014]3)借助卡那霉素篩選及分離比統計的方法獲得轉基因陽性純和植株，通過RT-PCR的方法，檢測轉基因植株的表達量。鑒定轉基因植株的表型，并進行統計分析。[0015]4)用干旱、高鹽以及各種激素處理野生型棉花品種YZl兩葉一心的幼苗，檢測GhTZFl基因對不同脅迫條件的應答。[0016]5)用GhTZFl超表達植株進行各種逆境和激素脅迫，觀察其表型。[0017]6)將生長5周的用GhTZFl超表達轉基因陽性擬南芥植株和野生型擬南芥植株進行干旱處理，觀察其表型，并測定干旱脅迫下相關指標及基因的表達。[0018]本發明的優點在于:[0019]1.本發明克隆的GhTZFl基因可提高植物對干旱的耐受性，因此能夠利用基因工程技術有目的提高植物耐干旱的能力。[0020]2.本發明能夠利用基因工程技術有目的延長植株在逆境脅迫下的生命周期，進而可用于提高植株在逆境脅迫下產量的提高，并能用于研究干旱和葉片衰老的分子機制。【專利附圖】【附圖說明】[0021]序列表SEQIDNO:1是本發明分離克隆GhTZFl基因的核苷酸序列，序列長度為1318bp,ORF長度為1086bp。[0022]序列表SEQIDNO:2是GhTZFl基因編碼的蛋白質的序列，編碼362個氨基酸。[0023]圖1:一種采用ClustalW軟件和MEGA4.0軟件(公開使用軟件)對GhTZFl編碼序列與擬南芥中的CCCH型第九亞家族成員基因和AtC3H14，AtC3H15聚類分析的結果。通過聚類分析表明，GhTZFl編碼序列與擬南芥中的TZF編碼序列中的AtTZFl同源性最高，因而命名為GhTZFl。[0024]圖2:使用Real-timePCR和RT-PCR的方法檢測GhTZFl基因對逆境處理和其組織的表達模式分析。圖2A為PEG處理下GhTZFl的表達情況；圖2B為NaCl處理下GhTZFl的表達分析；通過表達分析表明=GhTZFl受PEG和NaCl誘導表達，在24h時誘導表達量最高。圖2C為GhTZFl隨著葉片衰老，其表達量降低。[0025]圖3:構建超表達載體所用的載體。圖3A為BP反應的中間載體pD0NR?221，圖3B為所使用的超量表達載體PK2GW7.0的示意圖，圖3C為一種基因所使用的超量表達載體p35S-GhTZFl的構建示意圖。[0026]圖4為GhTZFl超量表達轉基因擬南芥PEG處理下表型分析示意圖。圖中:圖4A為轉基因擬南芥表達量的檢測，其中左起第一個泳道為野生型，第二個泳道為轉基因系GhTZF1-3(后面的標注為0X3)，第三個泳道為轉基因系GhTZFl-4(后面的標注為0X4)，Actin2為擬南芥肌動蛋白，作為內參基因以檢測上樣量是否一致。圖4B為PEG處理下(-0.5MPa)種子的萌發情況，其中a，b，c分別為野生型，GhTZFl超表達系0X3以及GhTZFl超表達系0X4在正常培養基上的萌發情況；d，e，f分別為野生型，GhTZFl超表達系0X3以及GhTZFl超表達系0X4在水勢為-0.5MPa的PEG培養基上的萌發情況。圖4C為PEG處理下(-0.5MPa)種子的萌發速率統計結果。正常情況下，野生型與超表達系的萌發速率一致，在PEG存在的條件下，野生型的萌發速率遠低于兩個超表達系。[0027]圖5為GhTZFl基因在延緩葉片衰老中的應用。圖5中:圖5A為轉基因和野生型擬南芥離體葉片在黑暗處理下的衰老表型，其中左邊的為未處理前的對照，從上往下第一排為野生型，第二排為0X3，第三排為0X4;右邊的為黑暗處理7天后的結果。圖5B為轉基因和野生型擬南芥離體葉片在茉莉酸甲酯處理下的衰老表型，其中上排的為平行對照，下排的為45uM茉莉酸甲酯處理4天后的結果，左起第一個為野生型，第二個為0X3，第三個為0X4。圖5C為雙氧水(H2O2)處理離體葉片的表型，其中上排的為平行對照，下排的為IOmMH2O2處理4天后的結果，左起第一個為野生型，第二個為0X3，第三個為0X4。[0028]圖6為GhTZFl能夠提高植株的抗旱性并能延緩干旱誘導的衰老。圖中:圖6A為干旱處理后的表型，其中上排的為干旱處理7天后的表型，下排的為干旱處理15天后的表型；左邊的均為正常條件下植株的生長情況，右邊的均為干旱處理情況下的表型鑒定，每種生長條件下，從左往右依次為野生型，0X3，0X4。圖6B為干旱處理7天后植株體內相對含水量的統計結果。圖6C為干旱處理7天后植株體內雙氧水含量的統計結果。圖6D為干旱處理7天后與氧化脅迫相關的衰老相關基因的表達情況，其中左邊的3個泳道代表正常條件下，右邊的3個泳道代表干旱處理情況下，3個泳道從左往右依次代表野生型，0X3，0X4。圖中CK均代表正常生長情況，DT均代表干旱處理情況。圖6E為干旱處理15天后植株體內丙二醛含量的統計結果。【具體實施方式】[0029]以下實施例定義了本發明，并描述了本發明在分離克隆包含有GhTZFl基因完整編碼區段的DNA片段，以及驗證GhTZFl基因功能的方法。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。[0030]實施例1GhTZFl基因的分離克隆及表達模式分析[0031]本申請人:在華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室的前期工作中從建立細胞壁再生的SSH文庫(Yangetal.,2008,Expressionprofileanalysisofgenesinvolvedincellwallregenerationduringprotoplastcultureincottonbysuppressionsubtractivehybridizationandmacroarray.JExpBot,59:3661-3674)中分離出的一段EST序列(NCBIEST登錄號FF403655，提交時間2009年4月)，對該EST序列序列在NCBI基因庫中進行tBLASTx比對，發現這個序列可能是CCCH-type轉錄因子。這條EST序列沒有包含完整地開放讀碼框，我們采用RACE(rapid-amplificationofcDNAends)法通過PCR進行cDNA末端快速克隆技術以得到這個基因完整的編碼序列。具體步驟如下所述:A.RNA的提取及cDNA的獲得[0032]從陸地棉C201(來自中國棉花種植資源庫，中國河南安陽，中國農業科學院棉花研究所管理)細胞壁再生3h的樣品中提取總RNA(參照Zhuetal.報道的方法，文獻見:Zhuetal.,2005,AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica,31,1657-1659),利用反轉錄酶SuperscriptIIK購自Invitrogen公司，美國)將其反轉錄合成cDNA，反應條件為:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin0[0033]B.GhTZFl基因全長序列的獲得[0034]米用RACE方法(rapid-amplificationofcDNAends)(Frohmanetal.,1988,Rapidproductionoffull-lengthcDNAsfromraretranscripts:amplificationusingasinglegene-specificoligonucleotideprimer.PNAS,85,8998-9002.)分別擴增出GhTZFl基因的5，端和3，端，采用的引物序列分別為GhTZF5r-l(5，-CATGGGCGAACCAACATAATCCAAATC-3’)和GhTZF5r_2(5，-AAGCGGACCCATTTCCTCTCGGACTC-3’)，GhTZF3r_l(5，-AATGAATGGTGCTTGTTCCTGGGGC-3’)和GhTZF3r_2(5，-TTCCACACTCCGACCCGGTTTTTGC-3’)。將序列拼接后得到GhTZFl的cDNA序列。根據上述所得的拼接序列設計ORF引物，其上下游引物分別為=GhTZFl-F(5’-CAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFl-R(5’-TCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)，以細胞壁再生3h的cDNA為模板利用PCR技術擴增GhTZFl的0RF。PCR條件為94°C預變性3min；94°C30sec，55°C30sec,72°Clmin，28個循環；72°C延伸7min。將擴增獲得的PCR產物連入pGEM_T載體(購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，即美國Promega公司)，篩選陽性克隆并測序。其序列為SEQIDNO:1所不的核苷酸序列。再通過ORFFinder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)對獲得的cDNA進行分析，確定包含一個完整的0RF，其表達的蛋白為SEQIDN0:2所示的蛋白質的氨基酸序列。[0035]C.PEG和NaCl處理、不同發育階段擬南芥葉片的總RNA的提取、cDNA的獲得及GhTZFl基因的表達分析[0036]以陸地棉YZl為材料(金雙俠，即Jinetal.,Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiolPlant,2006,50:519-524)，提取新葉、成熟葉、老葉以及聚乙二醇(PEG)和NaCl處理不同時間點各樣品的RNA(方法同前)，選取的PEG和NaCl處理的時間點分別是Oh，lh，3h，6h，12h，24h。正常生長的YZl選取相對應的時間點以作平行對照。利用反轉錄酶SuperscriptIII(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉錄合成cDNA,反應條件為:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin0以上述反轉合成的cDNA為模板，采用Real-timePCR檢測GhTZFl的表達水平，所用引物為:GhTZFl-RTS:(5，-TCGGTGGCCTTTGATTCTTCT-3’)和GhTZFl-RTA:5’-(AGGCAGTAGCACCACMMTAGAG-3’)。同時用引物GhUbiquitin7_F:(5，-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’)和GhUbiquitin7-R:(5，-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’)對棉花GhUbiquitin7(GenBank登陸號:DQ116441)基因做特異擴增，作為內對照進行相對定量分析。定量PCR儀為ABI7500，定量PCR試劑購自Bio-Rad公司。PCR反應體系(20μI)包括:1μI稀釋后的cDNA(等于IOng起始總RNA)，10μ12XPCRMasterMix,200nM的引物。反應條件為:95°C30sec；95°C5sec，60°C35sec，40個循環。反應過程中進行熒光檢測實時定量分析。結果表明:本發明克隆的基因GhTZFl受PEG和NaCl處理誘導表達，均在處理24h時表達量最高，GhTZFl的表達量隨葉片發育而降低。[0037]實施例2:GhTZFI基因植物超量表達載體的構建[0038]根據得到的SEQIDNO:1序列設計引物用于構建表達載體，在引物兩端分別加上BP-LR反應的接頭堿基，引物序列分別為GhTZFlBP-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFlBP-R(5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)，以T-GhTZFl質粒為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為:94°C預變性3min；94°C30sec,58°C30sec,72°Clmin，共28個循環；72°C延伸7min，經PCR擴增得到包含完整ORF的PCR產物。PCR產物經BP反應連接至pD0NR?221載體(購自Invitrogen公司，美國，)上效果見圖3A，后轉化大腸桿菌感受態細胞T0P10，以GhTZFl的特異引物GhTZFlBP-F(5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3，)和GhTZFlBP-R5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3，)進行PCR檢測來挑取陽性克隆，并活化提取質粒。PCR反應條件為:94°C預變性3min；94°C30sec,55°C30sec，72°Clmin，25個循環；72°C延伸7min。再用LR反應將GhTZFl基因連接至植物表達載體pK2GW7.0(比利時國立根特大學惠贈，LR酶購自Invitrogen公司，美國，室溫反應4小時，圖3B)，反應產物轉化大腸桿菌感受態細胞T0P10。以GhTZFl的特異引物GhTZFlBP-F(5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFlBP-R(5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)進行PCR檢測來挑取陽性克隆，并活化提取質粒。PCR反應條件為:94°C預變性3min；94°C30sec，55°C30sec,72°Clmin，25個循環；72°C延伸7min。確定為陽性的克隆即為獲得了用于轉化的超量表達質粒p35s-GhTZFl(圖3C)。[0039]將構建得到的的p35s_GhTZFl載體轉化農桿菌菌株GV3101(Rogeretal.,2000,AguidetoAgrobacteriumbinaryTivectors.TrendsPlantSci,5，1360-1385),挑取單菌落接于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液體培養基中于150rpm,28°C搖48h,按菌液和甘油體積比為1:1加入1.5mL離心管混勻，-70°C保存。再通過農桿菌介導的轉化方法轉化擬南芥。[0040]以上及以后所述的LB培養基配方為:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L；用5mMNaOH調pH=7.2;用蒸餾水定容至IL;在高溫121_125°C高壓滅菌15_20min。LB固體培養基為每升加入Sg瓊脂。[0041]實施例3GhTZFl基因的遺傳轉化及篩選鑒定[0042]A.擬南芥的準備[0043]供試材料為野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaL.Columbiaecotype)。野生型擬南芥種子經過春化處理后點播擬南芥種植專用營養土(培蕾牌，中國，江蘇，鎮江生產，商品營養土)并放入人工培養室(16小時光照，22±2°C)等擬南芥長到4葉左右進行定苗，以控制擬南芥的生長密度。待擬南芥生長6周左右開始開花時即可轉化，轉化前一天給擬南芥澆足水。[0044]B.農桿菌的活化[0045]從超低溫冰箱內取出保存的含有目標基因(即本發明克隆的GhTZFl基因)的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，后于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB固體培養基上劃線，28°C暗培養36-48h，待皿內長出清晰的單菌落，挑取單菌落在加50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液體培養基中過夜培養(26.5°C，IOOrpm)，其OD6tltl=0.8-1.0時即可用于轉化；[0046]將菌液轉移到離心管中5000rpm離心5min，棄上清培養基。加入IOOml濃度為5%(W/V)的蔗糖溶液，重懸農桿菌GV3101，在28°C搖床中復蘇1_2小時。加入表面活性劑0.05%(V/V)SilwetL-77，震蕩搖混勻。[0047]C.農桿菌介導的花序法轉化擬南芥及轉基因擬南芥的篩選[0048]農桿菌介導的花器浸醮法轉化擬南芥的轉化方法和程序參照參考Zhangetal.，2006報道的方法(Zhangetal.,2006,Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.NatureProtocols,1，641-646)。具體步驟如下:[0049](I)將擬南芥花器浸入農桿菌懸液，并輕輕攪動約30秒鐘，用紙巾吸掉過多的菌液，并用黑色塑料袋將擬南芥植株包裹起來，保濕避光處理24小時；[0050](2)24小時之后將塑料袋逐漸揭開透氣，正常培養；[0051](3)—個星期之后重復上述(I)的操作；[0052](4)待種子成熟可以停止澆水并收獲種子，即為T1代種子。[0053](5)將收獲的種子消毒:先用70%(V/V)乙醇溶液浸泡I分鐘，在上述處理時要不時地使種子懸浮；然后用無菌水洗四次；[0054](6)處理后的種子用Topagar(0.1%(W/V)瓊脂水溶液)均勻涂布在含卡那霉素的擬南芥生長培養基(含有100mg/L卡那霉素的1/2MS培養基，MS培養基為通用培養基，1/2MS是指無機鹽成分減半)表面；[0055](7)4°C下春化處理3天，移入培養室培養10天后，共選取具有卡那霉素抗性植株20株；[0056](8)將20株轉基因T1代擬南芥植株移栽到土壤培養，待成熟后按單株收取種子，即T2代種子。[0057](9)將收取的T2代種子按操作步驟(5)-(6)進行操作I次；[0058](10)4°C下春化處理3天，正常培養10天后計算具有卡那霉素抗性植株與非抗性植株的分離比，并進行統計分析；[0059](11)符合抗性與非抗性植株的分離比為3:1的株系認為是單拷貝株系，移栽土壤培養，待成熟后按單株收取種子，即為T3代種子。[0060]D.轉基因擬南芥植株的純系檢測[0061]將收取的T3代轉基因擬南芥種子按實施例3中農桿菌介導的花序法轉化擬南芥及轉基因擬南芥的篩選的操作步驟(5)-(6)進行操作I次；然后4°C春化3天，移入培養室培養10天后查看轉基因植株在固體篩選培養基(含有100mg/L卡那霉素的MS培養基)上是否發生抗性分離，不發生抗性分離的株系即認為是轉基因純系T4代種子，用作下一步表型分析和功能鑒定。[0062]實施例4:轉基因擬南芥的表達分析[0063]收集T3代種子生長的擬南芥植株地上部分以提取RNA，RNA的抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)。[0064]cDNA的合成是以3μg總RNA為模版，與Iμ1500μg/mloligo-dT(15)引物(購自Promega公司)，IμII0mMdNTP,DEPC-water混合，總體積為I2μI;然后65°C變性5min冰上驟冷；再加入8μI含有4μIRTbuffer,2μ10.1Mdithiothreitol,40unitsofRNasin#RibonucleaseInhibitor(購自Promega公司，美國)，和200unitsofSuperscriptIII反轉錄酶(購自Invitrogen公司，美國)的混合液；50°C溫浴Ih合成第一鏈；反應結束后75°C處理15min使SuperscriptIII反轉錄酶失活。每份cDNA稀釋到200μI后-20°C保存待用。[0065]以上述反轉錄合成的cDNA為模板，用引物GhTZFl-AtOS和GhTZFl-AtOA對GhTZFl基因進行特異的PCR擴增(擴增產物長284bp)。同時用擬南芥Atactin2(GenBank登陸號:NM_179953)基因作為內對照基因做特異擴增(擴增產物長216bp)。PCR反應體系的總體積為20μ1，DNA模板Iul(約50叩)、1父13卩酶反應緩沖液、251111MgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶，加ddH20至20μI。反應程序為:94°C變性5min，94°C30s,55°C30s,72°C30s30cycles，72°C延伸5min。獲得的PCR產物取10μI以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。[0066]結果表明:本發明克隆的GhTZFl基因在擬南芥中能夠表達，并且在不同轉基因系中的表達量有差異。后續的功能驗證研究中選取具有合適表達量的0X3和0X4兩個系來進行分析(圖4Α)。[0067]所用引物為:[0068]GhTZFl-AtOS:5’-GTGAGGAGGTGTGCTCGTGGAAG-3’[0069]GhTZFl-AtOA:5’-CGAAGCTGCTCCGGTGTGTG-3’[0070]actin-f:5’-CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3’[0071]actin-r:5，-CACAAACGAGGGCTGGAACAAG-3’[0072]實施例5:利用轉基因擬南芥對GhTZFl基因進行功能驗證，[0073]具體步驟如下:[0074]A.PEG處理萌發實驗[0075]將超表達兩個家系0X3，0X4和野生型WT的T3代種子置于1/2MS培養基和含有PEG(-0.5MPa)的1/2MS培養基上，觀察種子萌發。在正常培養基上，WT、0X3和0X4的萌發一致，在PEG(-0.5MPa)培養基上，WT的萌發慢于超表達兩個家系0X3和0X4，這說明該基因的超表達可以提高對PEG的抗性，結果見圖5A。對萌發速率進行統計發現超表達家系的萌發速率在前期遠高于野生型，隨著時間延長，超表達系可以完全萌發，而野生型的萌發率仍低于超表達系，統計結果見圖5B。[0076]B.黑暗處理離體葉片[0077]選取超表達兩個家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的蓮座葉置于黑暗條件下離體培養7天，平行對照為正常光照條件下的葉片，發現與平行對照相比，黑暗處理誘導了葉片衰老，但是黑暗處理7天后，相比于野生型，轉基因葉片的葉綠素降解被顯著延緩，表明超表達該基因可以延緩黑暗誘導的衰老，結果如圖5C。[0078]C.MeJA處理離體葉片[0079]選取超表達兩個家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的蓮座葉在含有45uM的茉莉酸甲酯(MeJA)溶液中避光處理4天，平行對照為在水溶液中避光處理4天，發現與平行對照相比，茉莉酸甲酯加速了葉片衰老，但是在茉莉酸甲酯的處理下，超表達系的葉片衰老程度明顯低于野生型，表明該基因可以延緩茉莉酸甲酯誘導的衰老，結果見圖[0080]D.雙氧水處理離體葉片[0081]選取超表達兩個家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的蓮座葉在含有IOmM的雙氧水(H2O2)溶液中避光處理4天，平行對照為在水溶液中避光處理4天，發現與平行對照相比，雙氧水加速了葉片衰老，但是在雙氧水的處理下，超表達系的葉片衰老程度明顯低于野生型，說明該基因可以延緩雙氧水誘導的衰老，具有耐氧化脅迫的能力，結果見圖5E0[0082]E.GhTZFl超量表達和野生型擬南芥干旱處理[0083]將超表達轉基因擬南芥0X3和0X4及野生型種子點播于擬南芥專用營養土(培蕾牌，江蘇鎮江生產的產品，公開銷售)，并放入人工培養室(16小時光照，22±2°C)等擬南芥生長5周，停止澆水I個星期，觀察植株的萎焉程度，發現與對照野生型相比，超表達植株并未出現明顯萎焉，而野生型出現了明顯萎焉，結果見圖6A-a和圖6A-b，并測定了植株體內的相對含水量，發現正常生長條件下，轉基因系擬南芥與野生型擬南芥的相對含水量并無差別，而在干旱情況下，野生型擬南芥的相對含水量顯著降低，轉基因系擬南芥的相對含水量顯著高于野生型擬南芥，統計結果見圖6B，這些說明該基因能夠提高擬南芥植株的抗旱性。待正常生長5周的擬南芥停止澆水15天后，發現植株均出現嚴重萎焉，并且干旱嚴重誘導了野生型葉片衰老加速，而與野生型相比，超表達系植株干旱誘導的衰老被明顯抑制，結果見圖6A-c至圖6A_h。[0084]F.GhTZFl超量表達植株和野生型擬南芥干旱處理后生理指標的測定和相關基因的表達[0085]I)過氧化氫定量測定。[0086]在酸性環境中，過氧化氫可將Fe2+離子氧化成Fe3+離子，Fe2+離子再與染料分子結合形成Fe3+_染料復合物，該復合物在560nm(或595nm)處有最大吸收波長，且吸光值與過氧化氫的濃度成正比。[0087]將擬南芥樣品用液氮研磨，取0.1g左右的樣品至2ml離心管中，立即加入1.8ml預冷的80%丙酮，振蕩20分鐘，4°C，13000rpm/min離心15分鐘，吸取上清液轉入新的離心管用于后續實驗。按照試劑盒H202quantificationkit(SangonBiotech,Shanghai,China)提供的方法對過氧化氫進行定量測定。對干旱7天后植株體內的雙氧水含量測定發現，干旱能夠提高植株體內的雙氧水含量，即打破了細胞的氧化還原穩態，但是與野生型擬南芥相比，超表達系擬南芥的雙氧水升高明顯低于野生型擬南芥，說明該基因可以調控雙氧水的積累，維持胞內氧化還原平衡狀態，統計結果見圖6C。[0088]2)GhTZFl超量表達和野生型擬南芥干旱處理下衰老相關基因的表達[0089]在干旱處理7天時分別采集超表達系0X3和0X4及野生型擬南芥的地上部分，提取RNA,RNA的抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)。反轉錄后用RT-PCR檢測衰老相關基因(0RE9，SAG21，SAG14，ERD1)的表達。擬南芥Atactin2(同上)基因作為內對照基因。結果表明:干旱處理的情況下，與野生型相比，轉基因中SAG相關基因的表達量下調，表明干旱誘導的衰老在轉基因植株中得到延緩(見圖6D)。[0090]所用引物分別為:[0091]0RE9-F:5，-GACACAATCGGTTTCGCACTG-3，[0092]0RE9-R:5’-CTCCTCTGGTTAACATCTCTATCCTG-3’[0093]SAG21-F:5’-ATCGTATCTGCTTTCGTCTCTCG-3，[0094]SAG21-R:5，-TTCCACTCCCTTCTTCTTCATCAC-3，[0095]SAG14-F:5’-GGAGGACTACGATGTTGGTGATGA-3，[0096]SAG14-R:5’-TGTGGCTAATGGGTTTCTCTTTCT-3’[0097]ERDl-F:5，-ATGTCACCTCCATCGCCGCT-3’[0098]ERDl-R:5，-GAACCGTTCGAAAACCGCTG-3，[0099]3)丙二醛(MDA)含量的測定。[0100]植物器官衰老或在非生物逆境條件下，膜脂發生過氧化作用，丙二醛是產物之一，通常利用它作為膜脂過氧化指標。在干旱處理15天后取樣進行MDA含量測定。天平稱取0.1g左右的擬南芥蓮座葉葉片，剪刀剪碎后加10%TCA2mL，用預冷的研缽置于冰上研磨至勻衆狀，倒入2mL離心管中。在12000rpm下冷凍(4°C)離心IOmin,取上清液0.8mL至新的2mL離心管中，向其中加入0.6%TBA0.8mL，混合后在100°C沸水中煮15min后冰上立即冷卻后離心取上清。用分光光度計分別測定上清液在450nm、532nm和600nm處的吸光度值。并按公式算出MDA濃度，再算出單位鮮重組織中的MDA含量(μmol/g)。結果計算，按公式C/ymol/L=6.45(A532-A600)*(V1*V)/(V2*W)。其中Vl為反應液總量，V2為反應中提取液量，V為提取液總量，W為樣品質量。最終結果發現干旱導致膜脂過氧化，但是與野生型相t匕，超表達系的膜脂過氧化程度降低，繪圖如圖6E。[0101]以上過程中用到的擬南芥正常生長培養基:5mMKNO3,2mMMgSO4,2mMCa(NO3)2,ImMKH2PO4,1.5mMKCI，70μMH3BO3,14μMMnCl2,1μΜZnSO4,0.5μMCuSO4,10μMNaCI，0.2μMNa2MoO4,40μMFe-EDTA,10g/L蔗糖，ρΗ5.7，8g/LAgar0[0102]特別說明:本發明專利申請得到“中央高校基本科研業務費專項資金資助(2010QC034)”的資助。【權利要求】1.一種從棉花中分離的GhTZFl基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一種從棉花中分離的GhTZFl基因，其蛋白質的序列如SEQIDNO:2所示。3.一種超表達載體p35s-GhTZFl，其特征在于，該載體含有如權利要求1所述的基因。4.權利要求1所述的基因在提高擬南芥耐旱性及延緩干旱誘導衰老中的應用。【文檔編號】C07K14/415GK103468712SQ201310365814【公開日】2013年12月25日申請日期:2013年8月20日優先權日:2013年8月20日【發明者】張獻龍,楊細燕,周婷,王麗晨申請人:華中農業大學