專利名稱：一種改良bt型粳稻恢復系條紋葉枯病抗性的育種方法
技術領域：
本發明涉及ー種改良BT型粳稻恢復系條紋葉枯病抗性的育種方法，屬于水稻遺傳改良與農業生物技術應用領域。ニ背景技術：
水稻是我國第一大糧食作物，常年種植面積在3000萬公頃以上。其中雜交秈稻的種植面積達1，733萬公頃，約占秈稻面積的80%，水稻總面積的50%以上；而粳稻種植面積約為828萬公頃，主要以常規粳稻為主，雜交粳稻比例不足4%。與雜交秈稻相比，雜交粳稻的發展非常滯后(鄧華風等，雜交水稻，2006，21 (1):1-6;湯述翥等，雜交水稻，2008，23 (I)1-5 ;王才林，西南農業學報，2009，22 (4) :1165-1169)。近年來，隨著人民生活水平的提高以及粳米消費需求的不斷增長，為具有增產潛力雜交粳稻的發展開拓了廣闊的空間。據資料顯示，如果雜交粳稻的年種植面積從占粳稻面積的3%擴大到50%，就有希望毎年增產35億公斤優質稻谷(鄧華風，雜交粳稻理論與實踐，2006，北京中國農業出版社)。因此，加強雜交粳稻(特別是三系雜交粳稻)的品種選育，對保障我國糧食安全，促進農業增效、農民增收具有重要意義。雄性不育系和恢復系是選配三系雜交粳稻優勢組合的基礎。在不育系選育方面，大多以BT型(來自印度春秈品種，Chinsurah Boro II)雄性不育細胞質材料為受體，優良常規粳稻品種(品系)為供體，通過連續的回交轉育而成，其產量、品質和抗性等綜合形狀較好，其重點在于對開花、異交習性的選擇(袁隆平等，雜交水稻育種栽培學，1988,83-84 ；)；相比之，粳稻恢復系的選育周期長、難度大、過程相對繁瑣，其主要原因在于恢復系必須具有恢復基因，否則不能使后代雜交種具有自交結實的能力，而一般粳稻中沒有相應的恢復源，很難從已有的粳稻品種直接獲得恢復系，必須通過人工雜交、基因重組的方法將恢復基因從秈稻導入到粳稻中再進行單株測交鑒定。后來為簡化育種程序，就借助于不育細胞質來選育同質恢，但由于細胞質遺傳背景相同必定導致組合雜種優勢的降低(李建紅等，作物學報,2005, 31 (7) :851_857)。因此,雜交粳稻品種培育的重點在于恢復系的選育,而提高優良恢復系的選擇效率必須首先實現對恢復基因快速、準確的鑒定。已有研究表明，粳稻BT型細胞質雄性不育系的育性恢復是由第10染色體長臂的Rf-I基因控制，它由兩個相關的育性恢復基因Rfla和/ /76組成，編碼定向線粒體的PPR蛋白，其中Rfla編碼的蛋白RFlA以內切方式切斷ガ-ai/76/or/7タmRNA來阻止0RF79蛋白的產生使育性恢復，而ガ/ 編碼的蛋白RFlB則通過降解ガmRNA使育性恢復，在RFlA和RFlB同時存在吋，RFlA具有優先作用。與可以恢復胞質雄性不育的近等基因系(Mf-IRf-I)相比，不能恢復胞質雄性不育的近等基因系irf-lrf-1)在Rfla位點上存在
Ibp 和 574 bp 兩處缺失(Komori et al. , Euphytica, 2003, 129(2): 241-247 ；ffang etal. , The Plant cell, 2006, 18(3) : 676-687)。這些研究為進ー步開發分子標記輔助選育粳稻恢復系奠定了重要基礎。然而，粳稻恢復系的選育不僅在于恢復性的保留、農藝性狀的提高，同時在育種目 標中還必須兼顧ー些地區性重大病害的抗性。條紋葉枯病(Rice stripe disease)是由灰飛風傳播條紋葉枯病毒(Rice stripe virus, RSV)引起的一種水稻病害。1998年以來,該病在江蘇省的發生呈猛烈上升的趨勢，2000年首次在蘇北地區暴發，至2009年已連續10年在江蘇省內流行，井向周邊上海、浙江、安徽等省(市)蔓延，成為影響長江中下游地區粳稻生產的重要病害。據初步統計，蘇、浙、滬、皖等地條紋葉枯病的年受害面積都在3000萬畝以上，其中輕度感病(病株率〈5%)的面積約占6(Γ70%，偏重發病(病株率為10-30%)的面積占15-20%，重發成災(病株率>30%)的面積為3飛％，嚴重田塊甚至顆粒無收，給農戶造成慘重的經濟損失(王才林等，江蘇農業科學，2006，3 :1-5 )。條紋葉枯病對水稻生產的嚴重危害，促使抗病育種工作迅速開展，通過近十年的努力，取得了部分階段性成果。在抗性資源篩選的基礎上，通過雜交選育獲得了ー批不同熟期類型的抗病、優質常規粳稻品種如徐稻3號、揚輻粳8號、南粳44、南粳46等，并在生產上迅速推廣，有效控制了條紋葉枯病對水稻生產的嚴重危害(劉超等，江蘇農業科學，2003,6 42-43 ;何震天等，江蘇農業科學，2006，3 :61 ;王才林等，江蘇農業科學，2007，2 :43-44 ;王才林等，江蘇農業科學，2008，2 :91-92)。與常規粳稻抗病育種水平相比，雜交粳稻面臨著非常逾尬的局面。一方面，ー些綜合性狀優異、配合力較好的優良粳稻恢復系如湘睛、R161、申恢254等受條紋葉枯病的影響，其配組利用受到限制；另一方面，曾經推廣的一些優質、高產雜交粳稻組合如常優I號、常優2號、86優8號等由于高感條紋葉枯病，正逐漸退出生產，而ー些新育成的雜交組合其抗性水平還不過硬，很難達到高抗水平(端木銀熙等，浙江農業科學，2002，2 73-75 ;端木銀熙等，江蘇農業科學，4 25 ;谷福林等，雜交水稻，2001，16 (2)59-60 ；)。因此，在雜交粳稻尤其是恢復系選育過程中，要充分借鑒常規粳稻抗條育種的成功經驗，利用已知抗性基因的品種與現有感病恢復系進行雜交，并通過性狀選擇來改良其條紋葉枯病抗性，然后再進行廣泛測配，加快抗病雜交粳稻新品種的選育。水稻條紋葉枯病的抗性遺傳研究表明，其品種抗性主要受兩對顯性互補基因5 κ-<3、5 κ-ゐ或一對顯性基因5 K-が控制(Washio et al. , Jpn. J. Breeding, 1968, 18(2): 96-101 ；ffashio et al. , Jpn. J.ダ，1968，18 (3) : 167-172 ;孫黛珍等，中國農學通報，2006，22 (12) :318-322)。在這些基因中，來自巴基斯坦陸稻品種Modan的不完全顯性基因^か-が是目前對條紋葉枯病最為有效、遺傳方式最為簡單的抗性基因。它不僅能直接提供對病害的抗性，而且在生產上應用了 40多年未有抗性喪失的報道(潘學彪等，江蘇農業科學，2005，5: 22-23)。Hayano-Saito等將泣廣が'抗性基因定位在水稻第11染色體，標記XNpb220和XNpb257/XNpb254之間兩個BAC重疊的約286Kb的區域，并與其中ー個RFLP標記STlO完全連鎖。這些標記能有效用于水稻條紋葉枯病的分子標記輔助育種研究(Hayano-Saito et al. , Theor. Appl. Genet. , 1998, 96(8): 1044-1049)。綜上所述，培育抗條紋葉枯病粳稻恢復系，不僅為抗病雜交粳稻組合的選育奠定了重要的材料基礎，同時也對解決條紋葉枯病對該地區水稻生產的嚴重威脅以及滿足城鄉居民對優質粳米日益增長的消費需求具有重要意義。粳稻恢復系的抗性改良，傳統育種的做法是利用農藝性狀優異、配合力好的感病恢復系與含條紋葉枯病基因的抗性粳稻品種進行一系列雜交，井根據抗性和其它農藝性狀的田間表現進行單株選擇，同時在下一代對這些中選單株進行測交并根據后代結實情況，判斷恢復基因是否存在，最終獲得具有條紋葉枯病抗性、恢復基因純合的材料。然而，這種方法不僅會受到植株生長發育階段、環境條件等因素的影響，而且在多個優良性狀的基因聚合方面也存在諸多問題，既費時費力，又特別容易造成目的基因的丟失。因此，在粳稻恢復系條紋葉枯病抗性的改良過程中發明一種高效鑒定、選擇和聚合條紋葉枯病恢復基因、抗性基因的育種方法，對提高抗病優良粳稻恢復系的選擇效率，加速雜交粳稻的跨越式發展具有至關重要的作用。
發明內容
技術問題本發明針對BT型抗條紋葉枯病粳稻恢復系選育過程中恢復基因、抗性基因難以有效鑒定、選擇和聚合的技術難題，采用高效轉育和分子標記輔助選擇來提高育種效率，在恢復系中實現抗病、恢復基因的有效聚合，是本發明的宗旨。技術方案
本發明的內容是一種改良BT型粳稻恢復系條紋葉枯病抗性的育種方法，其特征在于
1)選用恢復基因位點基因型為/P/Va/P/Va，條紋葉枯病基因型為stv-b1stv-b1的江蘇感病優良恢復系寧恢8號為母本早與恢復基因位點基因型為r/Var/Va，條紋葉枯病基因型為Stv-b1 Stv-b1的日本抗病優質常規粳稻品種關東194為父本6雜交獲得F1 ；
2)以寧恢8號為母本，F1代植株為父本進行第I次回交，獲得BC1F1雜種。對BC1F1單株進行恢復基因和條紋葉枯病抗性基因的分子標記檢測，苗期各單株DNA的提取采用SDS法;
BT型粳稻恢復基因沿Va的分子檢測，利用InDel標記引物InDel-TP/Va
正向引物(InDel-WfVa-F)序列為 5’ -CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’
反向引物(InDel-WfVa-R)序列為 5’- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3'
擴增水稻品種的基因組DNA并經溴化乙錠染色后觀察，選擇具有1，145 bp特征條帶的純合基因型單株；PCR反應程序包括95 °C預變性5 min ;然后95°C變性30 s、55°C復性30 s、72°C延伸I min，循環35次；然后72°C延伸7 min, 10°C冷卻10 min。條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測，利用SCAR標記引物ST-10
正向引物(ST-10-F)序列 5'-CGAAAGATGGITTCTCCACC-3'，
反向引物(ST-10-R)序列 5' -GACCAAGCAACTAATGACGC-3'，
擴增水稻品種的基因組DNA并經溴化乙錠染色后觀察，選擇具有727 bp特征條帶的含泣K-//純合或雜合基因型單株；PCR反應程序包括95 °C預變性5 min ;然后95°C變性30s、63°C復性 30 s、72°C延伸 I min，循環 35 次；然后 72°C延伸 7 min，10°C冷卻 10 min ；
3)選擇BC1F1代中同時含有沿7a基因純合基因型(1，145bp特征條帶)和泣廣//雜合基因型(727 bp特征條帶)的單株作父本與寧恢8號進行第2次回交獲得BC2F1雜種，對BC2F1植株進行條紋葉枯病抗性基因的分子標記檢測，選擇含泣K-//雜合基因型(727 bp特征條帶)的單株作父本與寧恢8號進行第3次回交獲得BC3F1雜種，對BC3F1植株繼續進行條紋葉枯病抗性基因的分子標記檢測，選擇收獲含泣雜合基因型(727 bp特征條帶)的單株；
4)將BC3F1單株自交加代種植成BC3F2株系，并對其進行條紋葉枯病抗性基因的分子標記檢測，選擇泣基因純合或基因型(727 bp特征條帶)的單株繼續自交，獲得BC3F3株 系。利用恢復基因和條紋葉枯病抗性基因分子標記對條紋葉枯病免疫的小區繼續進行檢測，選擇所有單株均具有恢復基因(1，145 bp特征條帶)和條紋葉枯病抗性基因(727 bp特征條帶)的穩定小區即為同時含有和泣K-//基因純合體的小區，即為本發明所獲得的具有條紋葉枯病抗性的改良BT型粳稻恢復系材料。
5)對上述雙基因純合的小區進行農藝性狀考査的同時與不育系進行測配，選擇農藝性狀和組合優勢水平與原始受體恢復系寧恢8號基本一致的品系，即為寧恢8號條紋葉枯病的抗性改良品系，其恢復基因型為ガ/Va/P/Va，條紋葉枯病基因型為Stv-I/Stv-I/。有益效果
本發明提供的ー種改良BT型粳稻恢復系條紋葉枯病抗性的育種方法，具有以下優點
(1)本發明方法中涉及輔助選擇的分子標記均為PCR標記，由于不涉及DNA測序、限制性內切酶等的使用，因此不存在操作煩瑣，費用昂貴等弊端，更為高效、快捷，同時在各育種世代苗期可以快速、準確實現對恢復基因/ /Va和條紋葉枯病抗性基因Sか-が不同基因型 的篩選，極大的提高了育種工作的預見性；
(2)本發明方法，不僅在抗病粳稻恢復系選育過程中避免了對恢復基因的測交鑒定，同時也大幅度減少了條紋葉枯病田間抗性篩選的工作量，提高了育種效率，簡化了育種程序，降低了勞動強度，縮短了育種年限；
(3)本發明方法針對性強,新育成的寧恢8號抗病改良系與原始粳稻恢復系寧恢8號相比，在農藝性狀、配合力等方面基本一致，僅在條紋葉枯病抗性方面得到顯著改善。利用其不僅可以與已審定組合不育系(863A)直接配組應用，也可以與新的不育系進行測交、篩選強優勢抗病組合，同時作為優良親本還能進一歩雜交選育新的抗病恢復系。四

圖I寧恢8號//寧恢8號/關東194 BC1F1植株恢復基因Rfla和條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測(A :恢復基因Rfla檢測；B :條紋葉枯病抗性基因Stv-b1檢測)
(M :DNA 分子量標準，100-2，000 bp ；1 :寧恢 8 號；2 :關東 194 ；3 =F1 ；4~24 :寧恢 8 號//寧恢8號/關東194 BC1F1部分單株)
圖2寧恢8號//寧恢8號/關東194 BC2F1植株條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測(M :DNA分子量標準，100-2，000 bp ；1 :寧恢8號；2 :關東194 ；3 =F1 ；4~24 :寧恢8號//寧恢8號/關東194 BC2F1部分單株)
圖3寧恢8號//寧恢8號/關東194 BC3F1植株條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測(M :DNA分子量標準，100-2，000 bp ；1 :寧恢8號；2 :關東194 ；3 =F1 ；4~24 :寧恢8號//寧恢8號/關東194 BC3F1部分單株)
圖4寧恢8號//寧恢8號/關東194 BC3F2植株條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測(M :DNA分子量標準，100-2，000 bp ；1 :寧恢8號；2 :關東194 ；3 =F1 ；4~24 :寧恢8號//寧恢8號/關東194 BC3F2部分單株)
圖5 寧恢8號//寧恢8號/關東194 BC3F3雙基因純合小區恢復基因Rfla和條紋葉枯病抗性基因Sか-が的分子檢測(A :恢復基因/ f/a檢測；B :條紋葉枯病抗性基因Sか-が檢測)(M =DNA分子量標準，100-2，000 bp ；1 :寧恢8號；2 :關東194 ；3 =F1 ；4~24 :寧恢8號
Il寧恢8號/關東194 BC3F3雙基因純合小區部分單株)
圖6寧恢8號條紋葉枯病抗性改良系選育系譜圖
圖7恢復系寧恢8號、抗性改良系以及與BT型不育系90167A組合后代的植株形態(A :寧恢8號；B :寧恢8號抗性改良系；C 90167A/寧恢8號；D 90167A/寧恢8號抗性改良系)
生物保藏粳稻恢復系寧恢8號條紋葉枯病抗性改良系，該品種于2012年2月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號=CGMCC NO. 5792，分類命名水稻sativa).五具體實施例方式 為充分公開本發明一種改良BT型粳稻恢復系條 紋葉枯病抗性的育種方法，以下結合方法驗證和實施實例加以說明。其具體實施步驟如下
(1)親本選擇
寧恢8號，晚粳稻恢復系,江蘇省農業科學院糧食作物所育成,該恢復系穗大粒多，恢復力強，花粉量足，稻米品質優，配組優勢明顯。利用寧恢8號與三系BT型不育系863A配組而成的早熟晚粳類型雜交組合86優8號于2000年4月通過江蘇省農作物品種審定委員會審定，同時寧恢8號與其它不育系配組也具有明顯的雜種優勢，但由于高感水稻條紋葉枯病，限制了其在生產上的進一步利用。恢復基因位點基因型為沿Va/P/Va，條紋葉枯病基因型 S ( v-b1 s t v-b1。關東194，抗條紋葉枯病優質常規粳稻品種(日本引進)，日本茨城縣育成，2003年農林水產省登錄，登錄名為農林387號。恢復基因位點基因型為/P/Va/P/Va，條紋葉枯病基因型 Stv-b1 Stv-b1。以上兩個品種(系)均為公知公用材料，江蘇省農業科學院可免費提供。具體參考文獻為(谷福林等，優質雜交粳稻新組合86優8號，雜交水稻，2001，16(2):59-60 ；http://ineweb. narcc. affrc. go. jp/。)
(2)分子標記的開發
I)粳稻BT型細胞質雄性不育恢復基因Rfla InDel標記的開發 根據Wangce77，2006, 18(3) : 676-687)等的研究結果，利用水稻
恢復基因位點Rfla的基因組信息，設計引物對該位點序列進行PCR擴增并直接測序，獲得TPZVa位點的基因組序列。通過序列分析證實，已測序的多個粳稻BT型細胞質雄性不育恢復系和不育系(同核異質保持系)在沿7a位點都存在的574 bp的堿基差異。利用TPfVa基因的核苷酸序列在水稻基因組網站(Gene Bank, www.ncbi.nlm.nih. gov/)下載其位于水稻第10染色體長臂所在PAC克隆(Pl-derived artificial chromosome,PAC)的核酸序列(OSJNBaOO17E08, AC068923),并對相關序列進行分析；然后，利用Primer Premier 5. 0 (http://www. premierbiosoft. com)在 574bp 喊基插入缺失區域的附近，設計、合成相應的插入/缺失標記，并命名為InDel-TP/Va。其正向引物序列為5’ -CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’，反向引物序列為 5’ - TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3'，退火溫度為55°C。2)粳稻條紋葉枯病抗性基因Stv-b1 SCAR標記的開發
根據 Hayano-Saito (Theor. Appl. Genet. , 1998, 96(8): 1044-1049)等的研究結果，利用與Stv-b1完全連鎖的RFLP標記STlO的序列信息，通過測序，利用PrimerPremier 5. 0 (http://www. premierbiosoft. com)設計、合成獲得相應的 SCAR 標記，并命名為ST-10。其正向引物序列為5' -CGAAAGATGGTTTCTCCACC-3'，反向引物序列為5' -GACCAAGCAACTAATGACGC-3'，退火溫度 63°C。3)水稻植株基因組DNA的提取水稻植株基因組DNA的提取參照SDS法(Dellaporta S L, et al. , Plant Mol B iolRep, 1983，I (I): 19221.)。具體步驟為取水稻苗期葉片，在-20°C預冷的研缽中用液氮研磨并裝入I. 5 mL離心管；加入600 uL提取液(20%SDS，1M Tris-HCl, O. 5M EDTA, 5MNaCl，65°C預熱)，搖勻，65°C溫浴30 min，中間振蕩3 4次；加入1/4體積5M KAC,搖勻后置冰上30 min ;加入氯仿-異戊醇(24:1) 300 400 uL，在搖床上充分振蕩，120 rpm, 30 min ；8，000^10, OOOrpm離心15分鐘，液面分層，下層顏色較深，上層微帶黃緑色，取上清(400 uL左右)至另ー離心管；加入等體積氯仿-異戍醇(24:1),搖床上充分振蕩，8(T90 rpm, 30min ;8，000 rpm離心15分鐘，轉移上清(400 uL左右)至新的離心管；加入2倍體積_20°C預冷的無水こ醇,輕輕搖勻直到有絮狀物產生,12，000 rpm離心6min ;棄無水こ醇,加入4°C70%こ醇，放置10 min，棄上清，超凈工作臺上風干Ih ;加入100 200 uL TE，_20°C保存。4 ) PCR擴增和電泳檢測
20 μ L PCR 反應體系包括10 ng/yL 的 DNA 2. O μ L,4 pmol/ μ L 的引物 2· O μ L，其中基因正、反向引物各 I. O μ L, 10XPCR 含有25 mmol/L MgCl2 的Buffer 2. O μ L, 2. 5mmol/L 的 dNTP O. 4 μ L，5 U/ μ L 的 7 O. 5 μ L 和 ddH20 13. I μ L ；
PCR反應程序包括PCR反應程序包括95で預變性5 min ;然后95 °C變性30 S、(55°C, ΤΡ/ia基因；63°C，Sか-が'基因)復性30 s、72°C延伸I min，循環35次；然后72°C延伸7 min，10°C冷卻10 min后，將擴增產物加上樣緩沖液終止反應。反應產物在質量比濃度為I. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化こ錠染色并于凝膠成像系統下觀察，記載。(3)水稻條紋葉枯病田間抗性發病調查
水稻育秧選擇在重發地區灰飛虱蟲源豐富的小麥田旁，秧田期和移栽后均不對灰飛虱進行防治。條紋葉枯病發病調查參照Washio等(及/J7 ふ/Exp. Sta. Series.,1968，16 :39-197)制定的抗性分級別標準進行(O級，無癥狀；1級，有輕微黃緑色斑駁癥狀，病葉不卷曲，植株生長正常；2級，病葉上褪綠擴展相連成不規則黃白色或黃緑色條斑，病葉不卷曲或略有卷曲，生長基本正常；3級，病葉嚴重褪綠，病葉卷曲呈捻轉狀，少數病葉出現黃化枯萎癥狀；4級，大部分病葉卷曲呈捻轉狀，葉片黃化枯死，植株呈假枯心狀或整株枯死)。其中，O、I級記為不發病，2 4級直接記為發病，I級在7天后再次調查確認，并按周彤(植物保護學報，2007，34(5): 475-479)等制定的方法進行抗性評價，計算平均發病率，并根據平均發病率進行抗性評價(免疫，發病率為O ;高抗，發病率低于5% ;抗病，發病率介于5. 1% 15% ;中感,發病率介于15. 1% 30% ;感病,發病率介于30. 1% 50% ;高感，發病率高于50. 1%)。(4)粳稻恢復系寧恢8號條紋葉枯病抗性改良系的選育
1)2008年夏，選用恢復基因位點基因型為RflaRfla,條紋葉枯病基因型為stv-b^tv-b1的江蘇感病優良恢復系寧恢8號為母本早與恢復基因位點基因型為r/Var/Va，條紋葉枯病基因型為泣か-が的日本抗病優質常規粳稻品種關東194為父本古雜交獲得F1 ；
2)2008年冬，以寧恢8號為母本，F1代植株為父本進行第I次回交，獲得BC1F1雜種；
3)2009年夏，對31個BC1F1單株進行恢復基因Rfla和條紋葉枯病抗性基因Stv-I/的分子標記檢測(圖1)，在同時含有/ /Va基因純合基因型(1，145 bp特征條帶)和Sか-が雜合基因型(727 bp特征條帶)的8個BC1F1單株中選擇4個單株作父本分別與寧恢8號進行第2次回交，獲得4個株系的BC2F1雜種；
4)2009年冬，對4個BC2F1株系(每個株系40株)共160個單株進行條紋葉枯病抗性基因泣的分子檢測(圖2)，在其中I個株系中選擇3個含Stv-b1雜合基因型的單株(727bp特征條帶)作父本分別與寧恢8號進行第3次回交，獲得3個株系的BC3F1雜種；
5)2010年夏，對3個BC3F1株系(每個株系40株)的120個單株進行條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測(圖3)，在3個BC3F1小區中選擇含Stv-b1雜合基因型(727 bp特征條帶)的11個單株帶海南加代；
6)2010年冬，對11個BC3F2株系(每個株系40株)的440個單株進行條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測(圖4)，在9個類似寧恢8號的小區內選擇含泣K-//基因純合或雜合基因型(727 bp特征條帶)的單株112個；
7)2011年夏，對112個BC3F3株系(每個株系44株)進行條紋葉枯病抗性的田間鑒定，對其中抗性免疫，農藝性狀優良、穩定的株系進行恢復基因WZVa和條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測，這些小區每個單株均具有恢復基因(1，145 bp特征條帶)和條紋葉枯病抗性基因(727 bp特征條帶)(圖5)，這說明這些株系均為TPfVa和泣r-//基因的純合體，即為本發明所獲得的具有條紋葉枯病抗性的改良BT型粳稻恢復系材料。8)對上述雙基因純合的小區進行農藝性狀考查的同時與不育系進行測配(表1，表2)，其中農藝性狀和組合優勢水平與原始受體恢復系寧恢8號基本一致的株系，即為具有條紋葉枯病抗性的寧恢8號改良品系，其恢復基因型為/P/Va/P/Va，條紋葉枯病基因型為Stv-b1 Stv-b10 (如保藏編號為CGMCC NO. 5792的寧恢8號改良系)(圖6，圖7)。
表I BT型粳稻恢復系寧恢8號和條紋葉枯病抗性改良系主要農藝性狀和發病率的比
較
材料名稱I抽穗I株高j穗數j穗長j穗頸長j一次枝梗j二次枝梗j實粒數j總粒數j結實率(％) j千粒重(g) j條紋葉枯病
_m_____s_s_____發病率( )
子恢 8 號106. Qa 7. 3a 24. 5a~ 7. 5a ~6. 5a ~ 9a 229~qT 250. Ia 91. 8a ■ 22. 16a ~ 24. 6a 一
抗性改良 8/18 106.8a 7.6a 24.6a 9.8a~16. 7a 68. 7a 229.8a 249. Ia 92. 3a22. 12a Ob
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注Duncan新復極差檢測，表中數據后的字母相同表示差異不顯著，小寫字母表示在0. 05水平時差異顯著性。
表2 BT型粳稻恢復系寧恢8號和條紋葉枯病抗性改良系與不育系測交后代F1 主要農藝性狀和發病率的比較
材料名稱j抽穗j株高~j穗數j穗長丨穗頸|一次枝梗j二次枝梗j實粒數丨總粒數丨結實率j千粒重(g) j條紋葉枯
期長數數(％)病發病率
____________(%)_
冗I67A/寧恢 8^~8/24 ~Q3. Ia 7~8^ 20.9b15.3a 61. 9a 211.1a 235.9a ~5a 26.18a 17.290167A/抗性改良 8/24 102.1a 8.2a 21.7a 4.9a 15.2a 65. 4a 217. 2a 242. 7a 89. 6a~ 26. 67a Ob
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注Duncan新復極差檢測，表中數據后的字母相同表示差異不顯著，小寫字母表示在0. 05水平時差異顯著性。
權利要求
1.一種改良BT型粳稻恢復系條紋葉枯病抗性的育種方法，其特征在于 1)選用恢復基因位點基因型為/P/Va/P/Va，條紋葉枯病基因型為stv-b1stv-b1的江蘇感病優良粳稻恢復系寧恢8號為母本早與恢復基因位點基因型為r/Var/Va，條紋葉枯病基因型為Stv-b^tv-bi的日本抗病優質常規粳稻品種關東194為父本6雜交獲得F1 ； 2)以寧恢8號為母本，F1代植株為父本進行第I次回交，獲得BC1F1雜種，對BC1F1植株進行恢復基因和條紋葉枯病抗性基因的分子標記檢測，選擇BC1F1代中同時含有/PfYa純合基因型特征條帶和泣雜合基因型特征條帶的單株作父本與寧恢8號進行第2次回交獲得BC2F1雜種，對BC2F1植株進行條紋葉枯病抗性基因的分子標記檢測，選擇含Stv-b1雜合基因型特征條帶的單株作父本與寧恢8號進行第3次回交獲得BC3F1雜種，對BC3F1植株 繼續進行條紋葉枯病抗性基因的分子標記檢測，選擇收獲含泣雜合基因型特征條帶的單株； 3 MfBC3F1單株自交加代種植成BC3F2株系，并對其條紋葉枯病抗性基因進行分子檢測，選擇Stv-b1純合或雜合基因型的單株繼續自交，獲得BC3F3株系； 4)種植BC3F3株系，利用恢復基因和條紋葉枯病抗性基因分子標記對條紋葉枯病免疫的小區繼續進行檢測，選擇所有單株均具有恢復基因特征條帶和條紋葉枯病抗性基因特征條帶的穩定小區為同時含有和Stv-b1基因純合體的小區，即為所獲得的具有條紋葉枯病抗性的改良BT型粳稻恢復系材料。
2.根據權利要求I所述的育種方法，其特征在于 對所述含有WZVa和泣K-//基因純合體的小區進行農藝性狀考查的同時與不育系進行測配，選擇農藝性狀和組合優勢水平與原始受體恢復系寧恢8號基本一致的品系，即為具有條紋葉枯病抗性的寧恢8號改良品系，其恢復基因型為/P/Va/P/Va，條紋葉枯病基因型為Stv-b1 Stv-b1。
3.根據權利要求I或2所述的育種方法，其特征在于 1)BT型粳稻恢復基因沿Va的分子檢測，利用InDel標記引物InDel-TPfVa 正向引物 InDel-TPfVa-F 序列為 5’-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’ 反向引物 InDel-TPfVa-R 序列為 5’- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’ 擴增水稻植株的基因組DNA并經溴化乙錠染色后觀察，選擇具有1，145 bp特征條帶的即為含WZVa純合基因型的單株； 2)條紋葉枯病抗性基因Stv-b1的分子檢測，利用SCAR標記引物ST-IO 正向引物 ST-10-F 序列 5’ -CGAAAGATGGITTCTCCACC-3’， 反向引物 ST-10-R 序列 5’ -GACCAAGCAACTAATGACGC-3’， 擴增水稻品種的基因組DNA并經溴化乙錠染色后觀察，選擇具有727 bp特征條帶的含Stv-b1純合或雜合基因型單株。
4.根據權利要求3所述的育種方法，其特征在于，PCR反應程序包括95°C預變性5min;然后95°C變性30 S、TPfVa基因在55°C或汾廣//基因在63°C復性30 s、72°C延伸Imin，循環35次；然后72°C延伸7 min, 10°C冷卻10 min。
5.根據權利要求I或2所述的育種方法，其特征在于所述條紋葉枯病免疫的小區指的是條紋葉枯病發病率為0%的小區。
全文摘要
本發明涉及一種改良BT型粳稻恢復系條紋葉枯病抗性的育種方法，屬于水稻遺傳改良與農業生物技術應用領域。選用條紋葉枯病感病粳稻恢復系寧恢8號為受體親本，含Stv-bi基因的條紋葉枯病抗病品種關東194為供體親本，通過連續回交、自交，同時利用分子標記進行輔助選擇，將條紋葉枯病的抗性基因轉育到優良恢復系寧恢8號中。這種選育抗病粳稻恢復系的方法，既避免了實際育種中對大量單株恢復力的測交鑒定，又減少了條紋葉枯病田間抗性篩選的工作量，提高了育種效率，降低了勞動強度，縮短了育種年限。同時，利用該方法育成的寧恢8號抗病改良系在生產中也具有重要的應用價值。
文檔編號A01H1/02GK102613069SQ20121007854
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者于新, 周麗慧, 姚姝, 張亞東, 朱鎮, 王才林, 趙凌, 趙慶勇, 趙春芳, 陳濤 申請人:江蘇省農業科學院