用于凍存復蘇后的細胞的保存液的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于凍存復蘇后的細胞的保存液，包括以下組分：生理鹽水、KCl以及MgSO4。本發明還公開了保存液的用途，以及包含該保存液和臍帶干細胞的臍帶干細胞混合物。采用本發明的保存液可以長時間保存凍存復蘇后的用于臨床回輸的細胞，細胞活力較傳統的生理鹽水保存要高，更符合臨床回輸要求。
【專利說明】用于凍存復蘇后的細胞的保存液
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地，本發明涉及一種用于凍存復蘇后的用于臨床回輸的細胞的保存液。
【背景技術】
[0002]細胞治療,又稱活細胞治療,包括活細胞修復損傷的組織。用于臨床回輸的細胞為多干細胞或免疫細胞。臍帶含有大量上皮干細胞和間充質細胞。兩種干細胞均具有巨大潛能幫助修復缺損的組織或器官，因此協助治療各種疾病。上皮干細胞形成連接、支撐或覆蓋身體某些結構和器官的軟組織，這些結構和器官包括角膜，皮膚和肝臟；而間質干細胞則是結構性組織(如骨骼、軟骨、肌肉、纖維性組織及脂肪等)的構成要素。
[0003]間充質干細胞是來源于發育早期中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，廣泛存在于全身多種組織中，可在體外培養擴增，并能在特定條件控制下分化為神經細胞、成骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等，在細胞替代治療及組織工程方面有極大的應用價值。目前，間充質干細胞MSC(Mesenchymal stem cells, MSC)主要來源于骨髓，但由于骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能，且隨著年齡增長其細胞數量和擴增、分化能力出現明顯下降趨勢，故尋找一種能替代骨髓并可彌補其缺陷的間充質干細胞來源，已越來越受到各國學者的關注。臍帶間充質干細胞作為一種多潛能干細胞，成功避開了胚胎干細胞來源缺乏、異體排斥、道德倫理等諸多限制，成為干細胞領域的研究熱點。
[0004]臍帶MSC目前已可穩定地在體外分離，且擴增迅速，由于其具有低免疫原性、支持造血及多向分化潛能的特點，它在多項醫學組織工程方面具有廣泛的臨床應用前景。
[0005]人臍帶間充質干細胞是組織工程理想的種子細胞。因為其除具有取材方便，來源廣，數量充足，增殖能力強，長期傳代不改變，分泌具有合適構成的細胞外基質等特點。此外還具有以下優點:1、采集臍帶對產婦和新生兒沒有任何危害及損傷；2、干/祖細胞更原始，有更強的增殖分化能力；3、免疫細胞較為幼稚，功能活性低，免疫功能不夠成熟，處于一種緘默狀態，不會觸發免疫反應及引起移植物抗宿主病；4、不會有腫瘤細胞，病毒和病原微生物的感染及傳播幾率也相對較低；5、不涉及社會、倫理及法律方面的更多爭議。
[0006]人臍帶間充質干細胞不僅具有多向分化潛能，還易于外源基因的轉染和表達，且MSC所攜帶的外源基因表達具有明顯的組織特異性，因此人臍帶MSCs有可能成為一種新型的基因治療的靶細胞。通過轉基因的方法，可以將利于定向分化的生長因子基因轉入間充質干細胞，促進定向分化，加快體內組織修復的進程。
[0007]但是，凍存復蘇后的細胞，細胞膜較為脆弱，此時若選用常規的臨床回輸試劑生理鹽水作為細胞的回輸保存液，細胞在長時間運輸時，細胞容易壞死而使活性降低。因此，尚需提供一種細胞的保存液，以保證凍存復蘇后的細胞在運輸途中保持其生物活性，可以更好的獲得高活性的細胞。

【發明內容】
[0008]本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種新型的凍存復蘇后的細胞保存液及其用途，以及包含該保存液和臍帶干細胞的臍帶干細胞混合物。
[0009]本發明的第一方面，提供一種細胞保存液，包括以下組分:生理鹽水、KCl和MgS04。
[0010]在另一優選例中，所述KCl的濃度為0.3-0.4g/l，MgSO4的濃度為0.02-0.lg/1。
[0011]在另一優選例中，所述KCl的濃度為0.32-0.36g/l，MgSO4的濃度為0.04-0.06g/L.[0012]本發明的第二方面，提供第一方面所述的細胞保存液的用途，所述用途選自下組:
[0013](a)用于保存干細胞；
[0014](b)用于建立干細胞庫；
[0015](C)用于保持干細胞的活力
[0016]在另一優選例中，所述干細胞為凍存復蘇后的細胞。
[0017]在另一優選例中，所述干細胞為臍帶干細胞。
[0018]在另一優選例中，所述干細胞為凍存復蘇后的臍帶干細胞。
[0019]在另一優選例中，所述保存是指在2~6°C進行保存。
[0020]在另一優選例中，所述保存是指在3.5-4.5°C進行保存。
[0021]本發明的第三方面，提供一種臍帶干細胞混合物，所述混合物包括以下組分:
[0022]臍帶干細胞，和
[0023]第一方面所述的細胞保存液。
[0024]本發明的第四方面，提供一種臍帶干細胞庫，其特征在于，所述細胞庫含有第三方面所述的臍帶干細胞混合物。
[0025]采用本發明的保存液可以長時間保存凍存復蘇后的細胞，細胞活力較傳統的生理鹽水保存要高，更符合臨床回輸要求。
[0026]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為實驗a組和對照a組在不同培養時間的細胞形態圖。
【具體實施方式】
[0028]本申請的發明人經過廣泛而深入地研究，首次發現，采用包含生理鹽水、KCl和MgSO4的保存液保存細胞，如臍帶干細胞，經過長時間保存后，臍帶干細胞不易壞死，仍具有良好的活性和生殖能力。在此基礎上，完成了本發明。
[0029]細胞保存液。
[0030]本發明的細胞保存液，包括以下組分:生理鹽水、KCl和MgS04。
[0031]在另一優選例中，所述KCl的濃度為0.3-0.4g/l，MgSO4的濃度為0.02-0.lg/1。
[0032]在另一優選例中，所述KCl的濃度為0.32-0.36g/l，MgSO4的濃度為0.04-0.06g/L.[0033]鉀離子和鈉離子一起作用，可以維持體內水分的平衡和心律的正常(其中，鉀在細胞內起作用，鈉只在細胞外起作用)；鉀和鈉平衡失調時會損害神經和肌肉的機能。鉀參與多種物質代謝，影響細胞內酶的活性，調節細胞內、外液的滲透壓和酸堿平衡。鎂是生物機體內重要的陽離子，是調節細胞外鈣，鉀，鈉平衡的重要離子，是多種酶的激活劑。在鈣、維生素C、磷、鈉、鉀等的代謝上，鎂是必要的物質，在神經肌肉的機能正常運作、血糖轉化等過程中扮演著重要的角色。
[0034]發明人意外發現，在生理鹽水中添加了鉀離子、鎂離子制成細胞保存液，可以長時間保存細胞，如凍存復蘇后的臍帶干細胞，可以維持和/或提高臍帶干細胞的活性，適用于細胞的保存運輸。
[0035]本發明的干細胞保存液，可以用于:
[0036](a)保存干細胞；
[0037](b)建立細胞庫；或
[0038](C)保持干細胞的活力。
[0039]在另一優選例中，所述干細胞為凍存復蘇后的細胞。
[0040]在另一優選例中，所述干細胞為臍帶干細胞。
[0041]在另一優選例中，所述干細胞為凍存復蘇后的臍帶干細胞。
[0042]在另一優選例中，所述保存是指在2~6°C進行保存，較佳地，所述保存是指在
3.5-4.5 °C進行保存。
[0043]在本發明中，術語“生理鹽水”，是指生理學實驗或臨床上常用的滲透壓與動物或人體血漿的滲透壓相等的氯化鈉溶液，濃度為0.85、.9w/v%0
[0044]本發明的臍帶干細胞的分離、培養、凍存均可以采用本領域常規的方法。
[0045]臍帶干細胞混合物
[0046]本發明的臍帶干細胞混合物，包含以下組分:
[0047](a)臍帶干細胞；以及
[0048](b)細胞保存液，包括以下組分:生理鹽水、KCl和MgS04。
[0049]在另一優選例中，所述KCl的濃度為0.3-0.4g/l，MgSO4的濃度為0.02-0.lg/1。
[0050]在另一優選例中，所述KCl的濃度為0.32-0.36g/l，MgSO4的濃度為0.04-0.06g/L.[0051]本發明的細胞保存液主要優點包括:
[0052](1)保存液成分清晰，不含對細胞有害的成分；
[0053](2)可以長時間保存臍帶干細胞，保持干細胞的活性；
[0054](3)臍帶干細胞成活率高，增殖能力強。
[0055]本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0056]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。[0057]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0058]實施例1
[0059]細胞保存液的配制
[0060]將KC1、MgSO4溶于生理鹽水中，使KCl的終濃度為0.37g/l，MgSO4的終濃度為
0.05g/l
[0061]實施例2
[0062]人臍帶間充質干細胞的保存
[0063]材料試劑:
[0064]1、移液管、離心管、凍存管、轉移袋、人臍帶間充質干細胞(HUC-MSC)、疫苗箱
[0065]2、DMEM培養基、生理鹽水、干細胞保存液(實施例1配制)
[0066]實驗分組:
[0067]對照a組:30ml生理鹽水+1.2 X IO7個人臍帶間充質干細胞
[0068]對照b組:Iml生理鹽水+0.5 X IO7個人臍帶間充質干細胞
[0069]實驗a組:30ml保存液+1.2 X IO7個人臍帶間充質干細胞
[0070]實驗b組:1ml保存液+0.5 X IO7個人臍帶間充質干細胞
[0071]實驗方法:
[0072]取出同一批次凍存的人臍帶間充質干細胞(HUCMSC)，加入已提前預熱的DMEM培養基中，充分混勻，并平均分成兩份。
[0073]每份細胞分別用生理鹽水、保存液洗滌兩次，洗滌后，按照實驗分組條件，制備對照a組、對照b組、實驗a組以及實驗b組。其中，對照a組和實驗a組的細胞和保存液放入50ml轉移袋中，各裝三袋，用熱合機密封，對照b組和實驗b組的細胞和保存液放入1.5ml
凍存管中，各裝三管。
[0074]將轉移袋和凍存管放入已裝有冰袋的疫苗箱中保存，并保持疫苗箱中溫度在2~
6。。。
[0075]分別在6h、8h、10h、24h后取出計數并計算活率、相對提高率，計算公式如下:
[0076]細胞活率=保存后細胞數/初始細胞數X 100%
[0077]相對提高率=(實驗組細胞活率-對照組細胞活率)/對照組細胞活率X 100%
[0078]表1人臍帶間充質干細胞在兩種保存液保存下的細胞活率
[0079]
【權利要求】
1.一種細胞保存液，其特征在于，包括以下組分:生理鹽水、KCl和MgS04。
2.如權利要求1所述的細胞保存液，其特征在于，所述KCl的濃度為0.3-0.4g/l，MgSO4的濃度為0.02-0.lg/1。
3.如權利要求2所述的細胞保存液，其特征在于，所述KCl的濃度為0.32-0.36g/l，MgSO4 的濃度為 0.04-0.06g/l。
4.權利要求1所述的細胞保存液的用途，其特征在于，所述用途選自下組: (a)用于保存細胞； (b)用于建立干細胞庫； (C)用于保持細胞的活率。
5.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述細胞為凍存復蘇后的細胞。
6.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述干細胞為臍帶干細胞。
7.如權利要求4所 述的用途，其特征在于，所述保存是指在2~6°C進行保存。
8.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述保存是指在3.5-4.5°C進行保存。
9.一種臍帶干細胞混合物，其特征在于，所述混合物包括以下組分: 臍帶干細胞，和 權利要求1所述的細胞保存液。
10.一種臍帶干細胞庫，其特征在于，所述細胞庫含有權利要求8所述的臍帶干細胞混合物。
【文檔編號】A01N1/02GK103461322SQ201210187672
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月7日 優先權日:2012年6月7日
【發明者】張炳強, 趙敬敬, 徐棟, 王飛, 張麗, 曹衛 申請人:臻景生物技術（上海）有限公司, 臻景生物技術（無錫）有限公司