專利名稱：編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發明提供用于植物的新編碼序列。該編碼序列編碼針對廣泛鱗翅目物種作物害蟲毒性的嵌合殺蟲蛋白。
背景技術：
天然存在的蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)分離物的商業制劑已長久用于對農業昆蟲害蟲的生物控制。根據常規農業實踐將從蘇云金芽孢桿菌物種發酵獲得的Bt孢子和晶體濃縮并配制用于葉施用。

已知Cryl晶體蛋白家族成員表現出對抗鱗翅目昆蟲幼蟲的生物活性，并可用作控制鱗翅目昆蟲害蟲的試劑。Cryl δ-內毒素的前體形式由兩個約相同大小的部分組成。前體蛋白的羧基末端部分或毒素原部分穩定晶體形成，且不表現殺蟲活性。前體蛋白氨基末端這一半含有Cryl蛋白的毒素部分，且基于Cryl家族成員中保守或基本保守序列的比對，其可進一步再分為三個結構域。這三個亞結構域以CrylA δ -內毒素的三維晶體學結構模型為基礎，其中如從蛋白毒素部分氨基末端所測量的，三個亞結構域分別稱作結構域
I、結構域II和結構域III。結構域I含有活性毒素部分的大約第一個三分之一，且已顯示對于通道形成是關鍵的(Thompson等人，1995)。結構域II和III各含活性毒素部分的大約中部和羧基末端部分。依賴于所檢查的昆蟲和S-內毒素，結構域II和III均與受體結合和昆蟲物種特異性牽連(Thompson等人，1995)。從本領域中已知的眾多天然殺蟲晶體蛋白結構域結構重配而任意產生性質增強的嵌合蛋白的可能性是渺茫的。這是蛋白質結構、折疊、寡聚化和活化的復雜本質的結果，所述活化包括對嵌合前體(如果以這種形式表達的話)的正確蛋白酶解加工以釋放殺蟲毒素部分。只有通過各親本蛋白內針對包括入嵌合結構的具體靶區作出仔細的選擇才能構建出與嵌合體所來源的親本蛋白相比表現有改進的殺蟲活性的功能性殺蟲毒素。經驗已顯示，毒素結構域的重裝配，即由任意兩個或更多個彼此不同的毒素的結構域I、II和III組成的嵌合毒素的裝配，導致構建出晶體形成有缺陷和/或完全缺乏針對優選靶昆蟲害蟲物種的任何可檢測的殺蟲活性的蛋白。在某些情況下，嵌合毒素將表現出良好的晶體形成特性，但仍不表現可檢測的殺蟲活性。只有通過嘗試與錯誤才能配制有效的殺蟲嵌合體，且盡管那樣，本領域技術人員仍不必定最后得到表現與該嵌合體組分所來源的任何單個親本毒素蛋白相比相同或改進的殺蟲活性的嵌合體。文獻報道了從兩個或更多個Bt殺蟲晶體蛋白前體構建或裝配嵌合蛋白的例子，但是并非全部都表現與嵌合體所來源的前體蛋白相比等同或改進的殺蟲或晶體形成特性(Bosch 等人(W095/06730) ;Thompson 等人(W095/30753) ;Thompson 等人(W095/30752)；Malvar 等人(W098/22595) ;Gilroy 等人(美國專利號 5，128，130) ;Gilroy (美國專利號5，055，294) ；Lee 等人(1992)Gene 267 :3115-3121 ；Honee 等人(1991)Mol. Microbiol. 5 2799-2806 ;Schn印f 等人(1990) J. Biol. Chem. 265 :20923-20930 ;Perlak 等人(1990) Bio/Technol. 8 :939-9943 ；Perlak 等人(1993)Plant Mol. Biol. 22 :313-321)。已經證明蘇云金芽孢桿菌δ內毒素在轉基因玉米植物中的表達是控制農業重要昆蟲害蟲的有效方法(Perlak等人1990 ; 1993)。表達蘇云金芽孢桿菌δ內毒素的轉基因作物能夠使種植者顯著減少與施用局部應用的化學殺蟲劑有關的時間和成本。尤其有利的是編碼蘇云金芽孢桿菌S內毒素的轉基因的使用。在嚴重昆蟲壓力的地區中表達蘇云金芽孢桿菌S內毒素的作物植物表現出比其它方面類似的非轉基因商業植物品種更好的改進產量。然而，據預測，昆蟲將進化出針對轉基因植物中表達的蘇云金芽孢桿菌S內毒素的抗性。這樣的抗性，若廣泛流傳的話，無疑將限制含有編碼這樣的蘇云金芽孢桿菌δ內毒素基因的種質的商業價值。提聞轉基因殺蟲劑對抗祀害蟲的有效性并同時減弱殺蟲劑抗性害蟲的發展的一種可能途徑可以是確保轉基因作物表達高水平的蘇云金芽孢桿菌 δ內毒素(McGaughey和Whalon 1993 ;Roushl994)。此外，具有有效對抗多組昆蟲害蟲且通過不同作用模式顯示其作用的殺蟲基因庫可以抵御任何抗性的發展。兩種或更多種對相同昆蟲物種具有毒性的殺蟲組合物在植物中的表達，各殺蟲劑以足夠高以有效延遲抗性開始的水平表達，可是實現控制抗性發展的另一途徑。這樣的可用于這樣的組合中的殺蟲劑的例子包括但不限于Bt毒素、致病桿菌屬物種(Xenorhabdus sp.)或光桿狀菌屬物種(Photorhabdus sp.)殺蟲蛋白、脫變態反應和去糖基化patatin蛋白和/或permuteins、植物凝集素等。實現在相同植物中共表達多種殺蟲活性蛋白，和/或那些殺蟲蛋白的高表達水平而不產生所不期望的植物形態學效果，是難以捉摸的。從蘇云金芽孢桿菌物種中已鑒定的超過二百五十種個別的殺蟲蛋白中只有少數已被測試在植物中的表達。幾種Cryl’ s、Cry3’ S、Cry2Aa和Cry2Ab、二兀毒素Cry33/34和Cry23/37、以及Cry9已在植物中成功表達。Cryl蛋白代表已在植物中表達但未以高水平表達的最大類蛋白。為避免不期望的植物毒性作用，必須將Cry2Ab靶向葉綠體。大部分種植重組植物的土地表達CrylA蛋白。所靶向的昆蟲害蟲物種對CrylA蛋白的抗性開始的可能性大大高于若抗性管理等位基因也與cryl等位基因一起表達，或者若cryl等位基因以高水平表達的可能性。因此，需要開發出在植物中表達的替代毒素基因作為那些目前在第一和第二代轉基因昆蟲抗性植物中使用的毒素基因的補充或替代。

發明內容
本發明提供在植物中表達的分離的核苷酸序列，其編碼表現鱗翅目昆蟲抑制特性的殺蟲蛋白。SEQ ID NO 1是這樣的核苷酸序列的例子，其由crylA. 105基因組成且編碼昆蟲抑制性CrylA. 105蛋白。SEQ ID NO :1與SEQ ID NO 3類似，二者均編碼CrylA. 105蛋白。SEQ ID NO :I優選用于雙子葉細胞中，而SEQ ID NO :3優選用于單子葉細胞中。SEQID NO 4由SEQ ID NO 3編碼，且與SEQ ID NO 2的氨基酸序列相同。該分離的核苷酸序列意欲包括表現與SEQ ID NO :1所示序列至少約88%至約90%或更大的核苷酸序列同一性，或在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: I雜交的序列。該分離的核苷酸序列還意欲包括表現與SEQ ID NO :3所示序列至少約90%核苷酸序列同一性，或在嚴格雜交條件下與SEQ IDNO 3雜交的序列。
本發明還提供表現針對鱗翅目昆蟲物種的抑制活性的分離和純化的殺蟲蛋白。該殺蟲蛋白在本文中至少被稱為CrylA. 105毒素部分，且表現SEQ ID NO :2所示氨基酸序列。由SEQ ID NO 2中所示的約1177個氨基酸組成的全長前體蛋白也稱作殺蟲CrylA. 105蛋白，然而任何表現殺蟲生物活性的前體蛋白片段也稱作殺蟲CrylA. 105蛋白，且至少包括對應于SEQ ID NO 2中所示約氨基酸I至約氨基酸612的氨基酸序列部分的CrylA. 105殺蟲蛋白，以及還可能包括自約氨基酸2至約氨基酸610的部分。由殺蟲有效量的殺蟲蛋白組成的任何組合物也意欲包括在本發明范圍內。本發明還提供用于在宿主細胞中表達如SEQ ID NO :2所示的殺蟲蛋白的表達盒。該表達盒優選包含在目的宿主細胞中具有功能的啟動子，其與編碼CrylA. 105蛋白的殺蟲部分的核苷酸序列相連并調節其表達。本文中提供如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 7所示的示例性表達盒，其意欲分別用于雙子葉植物細胞或單子葉植物細胞。啟動子與編碼序列可操作性相連并在宿主細胞中共同發揮功能。該表達盒可預定用于任何宿主細胞，但優選用于細菌細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞或植物細胞。細菌細胞優選選自芽孢桿菌屬(Bacillu)物種細胞、腸桿菌科(Enterobacteriacae)物種細胞、假單胞菌屬(Pseudomona)物種細胞、梭菌屬(Clostridium)物種細胞、和根瘤菌屬(Rhizobium)物種細胞、和土壤桿 菌屬(Agrobacterium)物種細胞。如果宿主細胞是植物細胞，則優選其是選自作物物種植物細胞的細胞，優選為雙子葉植物或單子葉植物細胞。雙子葉植物細胞的例子是苜蓿、蘋果、杏、蘆筍、豆、漿果、黑莓、藍莓(blueberry)、低芥酸菜子、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、櫻桃、鷹嘴豆、柑橘(citrus tree)、棉花、豇豆、蔓越橘、黃瓜、葫蘆、茄子、果樹、葡萄、檸檬、萵苣、亞麻子、瓜、芥子、產干果的樹、秋葵、橘(orange)、豌豆、桃、花生、梨、李、馬鈴薯、大豆、南瓜、草莓、甜菜、向日葵、甘薯、煙草、西紅柿、蕪菁和蔬菜。單子葉植物細胞的例子是玉米、小麥、燕麥、稻、高粱、買羅高粱、蕎麥、黑麥、草(羊茅、梯牧草、雀麥草、鴨茅、圣奧古斯丁草(St.Augustine)、狗芽根、剪股穎)和大麥。意欲在植物細胞中使用的表達盒通常包含可操作地連接的序列，所述序列調節比如CrylA. 105殺蟲蛋白這樣的目的物質的表達水平和效率。這樣的序列可能是表達增強子序列、非翻譯前導序列、內含子序列、葉綠體靶向肽編碼序列和轉錄終止和多腺苷酸化序列。該表達盒優選整合進用于穩定CrylA. 105編碼序列在宿主細胞中的維持的載體。載體可以是許多本領域已知的結構，但通常是在整合進宿主細胞之前即已在其中構建或插入了表達盒的質粒或復制子。載體意欲包括但不限于質粒、粘粒、桿狀病毒穿梭載體、噬粒、YAC、BAC、自殺載體、插入序列、轉座子、或甚至與表達盒相連的或其中插入表達盒的線性核苷酸序列。對鱗翅目昆蟲侵襲有抗性的轉基因植物是本發明的實施方案。這樣的植物包含編碼SEQ ID NO :2所示至少約氨基酸2至約氨基酸612的CrylA. 105殺蟲蛋白的核苷酸序列。該轉基因植物對于控制由比如卷葉蛾(leaf roller)、地老虎(cutworm)、黏蟲(armyworm)、鉆姓蟲(borer)、避債蟲(bagworm)和任何草料進食者(forage feeder)這樣的昆蟲引起的鱗翅目昆蟲侵襲中有效。優選的害蟲是草地夜蛾、玉米螟、棉鈴葉蛾(cornearworms)(棉鈴蟲(cotton bollworms))、西南玉米桿草螟和小地老虎。本發明意欲包括由本發明的轉基因植物產生的子代和種子或果實或產物，只要編碼CrylA. 105殺蟲部分的本發明核苷酸序列維持在植物、其子代、種子等的細胞的可遺傳和/或質體基因組中。
本發明還提供一種或多種通過在昆蟲害蟲食物中提供包含殺蟲有效量殺蟲CrylA. 105蛋白的組合物來控制鱗翅目昆蟲侵襲植物的方法。一種這樣的組合物可是已源于或源于用編碼SEQ ID NO :2所示CrylA. 105氨基酸序列殺蟲部分的核酸序列轉化的植物細胞的植物細胞。從已被轉化以包含表達盒的植物細胞產生的轉基因植物將是提供昆蟲食物中的殺蟲組合物的一種方法，所述表達盒的示例為SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:7所示，其包含編碼CrylA. 105殺蟲氨基酸序列的序列。另一種方法將是在細菌或真菌細胞中產生殺蟲有效量的CrylA. 105蛋白并在一種或多種對CrylA. 105蛋白易感的靶昆蟲害蟲的食物中提供細菌或真菌細胞或純化量的CrylA. 105蛋白。提供了鑒定生物樣品中編碼CrylA. 105氨基酸序列的核苷酸序列的方法。該方法由下述組成，將待測試其中存在CrylA. 105編碼序列的樣品與特異性與CrylA. 105編碼序列結合的多核苷酸探針接觸。具體地，該探針序列在嚴格雜交條件下與CrylA. 105編碼序列結合或雜交。對反應混合物中的結合的檢測對于CrylA. 105編碼序列的存在有診斷價 值。還提供了鑒定樣品中CrylA. 105蛋白殺蟲片段的方法。該方法由下述組成，將待測試其中存在CrylA. 105殺蟲片段的樣品與特異性結合殺蟲片段的抗體接觸。對反應混合物中的結合的檢測對于樣品中CrylA. 105蛋白的存在有診斷價值。還提供了嵌合或雜合殺蟲蛋白。這樣的雜合體由兩個或更多個不同的殺蟲蛋白組成，各殺蟲蛋白表現出針對相同昆蟲物種至少一個成員的殺蟲活性。雜合殺蟲蛋白由各不同殺蟲蛋白的部分組成。構建雜合體中所使用的殺蟲蛋白部分由至少約50至至少約200個鄰接氨基酸組成，所述鄰接氨基酸選自組成不同殺蟲蛋白之中的任一的鄰接氨基酸。SEQID NO 2中約第2位氨基酸至約第612位氨基酸所示的CrylA. 105殺蟲蛋白意欲包括在，從其中可以選擇出用于構建雜合殺蟲蛋白的部分的不同殺蟲蛋白組內。本發明的各種優點和特點是顯而易見的，通過參考下述詳細說明、實施例以及所附的權利要求書，可以更加清楚地理解本發明的本質。序列簡述SEQ ID NO : I是優選在雙子葉植物細胞中表達CrylA. 105殺蟲蛋白的合成序列。SEQ ID NO 2是從SEQ ID NO 1所示核苷酸序列編碼得到的CrylA. 105蛋白。SEQ ID NO 3是優選在單子葉植物細胞中表達CrylA. 105殺蟲蛋白的合成序列。SEQ ID NO 4是從SEQ ID NO 3所示核苷酸序列編碼得到的CrylA. 105蛋白。SEQ ID NO :5代表由在植物細胞中，且優選在雙子葉植物細胞中，發揮表達CrylA. 105殺蟲蛋白功能的表達盒組成的核苷酸序列。SEQ ID NO 6代表由SEQ ID NO 5所示的表達盒內的部分編碼的CrylA. 105殺蟲蛋白。SEQ ID NO :7代表由在植物細胞中，且優選在單子葉植物細胞中，發揮表達CrylA. 105殺蟲蛋白功能的表達盒組成的核苷酸序列。SEQ ID NO 8代表由SEQ ID NO 7所示的表達盒內的部分編碼的CrylA. 105殺蟲蛋白。
具體實施方式
根據本發明，本發明人已經構建了編碼本文中鑒定為CrylA. 105蛋白的新殺蟲蛋白的核苷酸序列。已鑒定，SEQ ID NO :2中所示CrylA. 105氨基酸序列表現以下特性其提供高于對鱗翅目昆蟲物種有毒性的天然存在Bt殺蟲蛋白的益處。具體地，CrylA. 105蛋白在單子葉和雙子葉植物中均能以高水平表達，而不出現由于與天然存在的Cryl蛋白在植物中表達時所觀察到的作用相比表達水平的提高而表現植物毒性作用的大多數轉基因事件。此外，CrylA. 105蛋白在蘇云金芽孢桿菌中表達時形成穩定的晶體，這可能是由于與嵌合CrylA. 105蛋白的毒素部分相連的CrylAc毒素原部分的穩定作用。此外,CrylA. 105殺蟲蛋白表現出用迄今為止已鑒定的其它天然存在的Cryl蛋白未觀察到的針對鱗翅目物種的一定范圍的殺蟲生物活性。因此，CrylA. 105蛋白在轉基因植物中的表達導致形態學正常的表達更高水平Cryl毒素類似物的轉基因事件數目提高，對于被選擇用于商業開發的任何事件，所述類似物表現對鱗翅目昆蟲害蟲物種的廣范圍控制。這樣的事件應當導致產生延遲對CrylA毒素類似物抗性開始的優勢，且當其與第二種毒素組合時，預計發展出對任一毒素的抗性的任何可能性都是非常渺茫的，所述第二種毒素對一種或多種昆蟲害蟲物種(CrylA類似物對其也具有毒性)有毒性且以不同于CrylA類似物的作用模式發揮作用。本發明已構建了至少兩種不同的用于植物的核苷酸序列，各核苷酸序列編碼相同 的CrylA. 105殺蟲蛋白。CrylA. 105蛋白的殺蟲部分的第一個(或氨基末端)約三分之二由源自CrylAb氨基酸序列的氨基酸序列組成。該序列與毒素部分的羧基末端以及毒素原結構域的部分相連，所述毒素原結構域具有源自從Ecogen Bt aizawai菌株EG6346獲得的殺蟲 Cryl 蛋白的氨基酸序列(Chambers 等人，1991, J. Bacteriol. 173 :3966-3976) CrylA. 105毒素部分然后與基本上為CrylAc毒素原肽序列的部分相連。本發明人證實，該結構提供了獨特的氨基酸序列，其與該嵌合體所來源的蛋白所表現的特性相比表現出驚人的改進的殺蟲特性。此外，CrylA. 105前體蛋白表現出優越的晶體形成特性，而且在具體靶向的鱗翅目昆蟲害蟲的腸中有效溶解和加工成活性毒素形式。已經使用美國專利號5，500, 365和5，689，052中所述方法構建了本文中所包含的核苷酸序列，具體是通過避免在編碼序列中的已經被觀察到對于在植物細胞中表達異源基因序列有問題的特定不利序列。編碼CrylA. 105蛋白毒素部分的部分或多或少由SEQ IDNO :1和SEQ ID NO 3約第I位至約第1830位所示的核苷酸組成。構建了用于雙子葉植物物種，且具體是用于棉花植物的SEQ ID NO :1所示序列。構建了用于在單子葉植物中，且具體是在玉黍蜀或玉米植物物種中表達的示于SEQ ID NO 3的序列。本發明的核苷酸序列彼此表現約94. 3%的總體同一性，且從約第1330位核苷酸至約第3534位核苷酸彼此相同。編碼CrylA. 105蛋白毒素部分的這些核苷酸序列的每一個的部分在約第I位核苷酸至約第1830位核苷酸彼此表現約88. 9%同一性。編碼CrylA. 105蛋白前兩個結構域結構的這些核苷酸序列的部分更加多樣，且彼此表現僅約84. 7%同一性。本發明人已經用這些序列構建了轉基因植物事件。將SEQ ID NO :1導入含有表達盒的質粒載體，所述表達盒由與碧冬茄(Petuniahybrida) Hsp70 非翻譯前導序列(Ph. Hsp70,又名 DnaK)、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)核酮糖二磷酸羧化酶小亞基葉綠體IE向肽編碼序列、和豌豆(Pisum sativum)E9核酮糖二磷酸羧化酶小亞基基因轉錄終止和多腺苷酸化序列可操作地連接的增強的玄參花葉病毒(Figwort Mosaic Virus)啟動子(eFMV)序列組成。將 SEQ ID NOdKTj^CrylA. 105 編碼序列以與靶向肽編碼序列3’末端編碼序列符合讀框地插入該表達盒中，并使其與靶向肽編碼序列3’末端編碼序列直接接近且位于E9終止序列上游。所得表達盒的核苷酸序列示于SEQ ID NO :5。切除含有與包含植物可表達⑶S標記的第二個表達盒連接的CrylA. 105表達盒的載體部分，并用生物射彈方法將其用于產生轉基因棉花事件。在生物測定中測試轉基因事件對抗幾種不同鱗翅目害蟲物種的殺蟲活性，且確定轉基因事件比以前存在的僅包含CrylAc或CrylAc和Cry2Ab蛋白的組合的昆蟲抗性棉花植物表現顯著更好的昆蟲控制特性。此外，一些CrylA. 105轉基因棉花事件在整個種植季，甚至在棉鈴中，表現的CrylA. 105蛋白累積水平超過10 20ppm，且對植物或生殖組織不表現任何植物毒性作用。這與從前已經測試過的其它Cryl蛋白形成對照，無論是否靶向葉綠體，所述其它Cryl蛋白通常僅能 達到低于約IOppm的累積水平。在棉花中測試其它Cryl類型蛋白時也觀察了植物毒性作用，尤其是在Cryl累積水平達到或超過約IOppm的時候。將SEQ ID NO :3導入含有表達盒的質粒載體,所述表達盒由與普通小麥(Triticumaestivum)主要葉綠素a/b結合蛋白基因非翻譯前導序列和稻(Oryza sativa)肌動蛋白內含子序列，和普通小麥hsp 17基因轉錄終止和多腺苷酸化序列可操作地連接的增強的花椰菜花葉病毒啟動子(eCaMV)序列組成。將示于SEQ ID NO 3的CrylA. 105編碼序列插入該表達盒中，使其與內含子序列3’直接接近且位于終止序列上游。所得表達盒的核苷酸序列示于SEQ ID N0:7。該載體還包含用于選擇用CrylA. 105表達盒轉化的事件的草甘膦除草劑選擇標記。在生物測定中針對幾種鱗翅目害蟲物種測試用CrylA. 105表達盒轉化后選擇的玉黍蜀事件，并確定它們表現用比如CrylAb這樣的其它Bt殺蟲蛋白轉化的事件中不普遍的廣范圍殺蟲活性。表達殺蟲水平的CrylA. 105的事件所表現的草地夜蛾和小地老虎的活性，與表達CrylAb的事件針對棉鈴葉蛾和玉米螟的殺蟲活性相比與之相當或更強的CrylA. 105殺蟲活性偶聯，為CrylA. 105事件提供了更廣譜的殺蟲活性。本發明的核苷酸序列是示例性的。其它的核苷酸序列能夠在植物細胞中表達CrylA. 105殺蟲蛋白片段，而且其它在其它類型的宿主細胞中很好表達的核苷酸序列也能夠被設計。不限制本發明公開內容的范圍，用于表達CrylA. 105殺蟲片段的核苷酸序列意欲與本文所例舉的核苷酸序列表現至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%或更大的核苷酸序列同一性。意欲用于在除植物細胞之外的宿主細胞中表達CrylA. 105殺蟲片段的其它核苷酸序列可以與例舉的核苷酸序列具有任何百分比的同一性或相似性。由于遺傳密碼的冗余，核苷酸序列可以發生變化，且由此有可能合成任何數目的編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列任意部分的核酸序列，且所有這些序列都意欲在本發明范圍內。任何至少編碼Cryl. 105蛋白殺蟲片段的分離和純化的核酸序列，以及可以通過抗體、核酸探針或一對或多對被設計用于產生由這樣的序列組成的擴增子的引物來檢測其中的核酸的任何組合物，都意欲包括在本公開內容范圍內。本文例舉的且在玉黍蜀中表達的核酸序列僅由CrylA. 105前體蛋白編碼序列組成，而在棉花中表達的序列由葉綠體祀向的CrylA. 105前體蛋白編碼序列組成。已經證明Cryl蛋白在植物中的表達是有問題的。不知任何特定的Cryl蛋白是否將在任何特定的植物中良好表達，因此需要嘗試與錯誤試驗。一些在玉米中表達的Cryl蛋白將導致產生植物毒性作用，且因此將該蛋白靶向葉綠體有時減輕這樣的作用。在表達Cryl蛋白的棉花植物中也觀察到類似的情況。本文的例子無意于教導如果定位于胞質空間，則CrylA. 105表達只可能在玉米中，以及類似地,無意于教導如果定位于質體，CrylA. 105表達只可能在棉花中。這些實施例意欲教導，任一蛋白質定位方法都與該蛋白一起發揮功能以實現形態學正常的植物，所述植物表現高水平CrylA. 105蛋白表達和累積，以及對選自葉蛾屬(Anticarsia)、尺葉蛾屬(Pseudoplusia)、Rachiplusia、Helicoverpa、實葉蛾屬(Heliothis)、灰翅葉蛾屬(Spodoptera)、葉小卷娥屬(Epinotia)和Armigera這些屬的廣范圍鱗翅目昆蟲植物害蟲表現商業水平的抗性。據信，任意質體靶向肽編碼序列將有效地發揮將前體CrylA. 105蛋白導向質體/葉綠體的作用。非翻譯前導序列、內含子和3’轉錄終止以及多腺苷酸化序列是本領域已知的，且本領域技術人員能理解，在特定的情況下，通過將這些序列整合進表達盒中可增強或者穩定表達。許多這樣的序列是本領域已知的，且意欲將它們包括在本發明的公開內容范圍內。類似地，對所連接的序列發揮功能以實現調節的表達的啟動子是本領域已知的，且也意欲包括在本發明的公開內容范圍內。可選擇啟動子用于在許多參數組合中驅動所連接序列的表達，包括但不限于表達的時間控制、表達的空間或組織特異性控制、以及控制需要在特定植物細胞或組織中累積的特定基因產物的量。 含有CrylA. 105氨基酸序列殺蟲片段的分離和純化的蛋白也意欲包括在本發明范圍內。變體也意欲包括在本發明范圍內，只要影響該變異的一種或多種氨基酸取代對于被取代的氨基酸總體上是保守的，且該(這些)取代不導致殺蟲生物活性或物種特異性范圍的降低。CrylA. 105蛋白殺蟲片段欲指，SEQ ID NO 2約第I位氨基酸至約第650位氨基酸、或約第2位氨基酸至約第612位氨基酸、或約第5位氨基酸至約第610位氨基酸、或約第10位氨基酸至約第600位氨基酸所示氨基酸序列的部分。作為選擇，CrylA. 105蛋白的殺蟲片段欲由約550至約650個鄰接氨基酸組成，所述鄰接氨基酸選自SEQ ID NO 2所示第I位至約第650位氨基酸殘基。由第I位至約第3534位殘基組成的全長前體蛋白，表現優良的晶體形成特性，并由雙子葉和單子葉植物物種良好耐受。該前體蛋白在結晶形式下還表現出良好的穩定性，以及在堿性PH下還表現良好的溶解度，具體是在約8. 0至約12. O、或約8. 5至約11. 5、或約pH 9. 0至約pH 11. 0的堿性pH下。本發明的蛋白可純化并以殺蟲有效量單獨用于許多意欲用作鱗翅目害蟲控制試劑的組合物中，或可以以殺蟲有效量與許多不同于CrylA. 105蛋白的其它殺蟲劑組合使用。這樣的其它的殺蟲劑意欲包括但不限于其它Bt Cry或其它無論對于鱗翅目物種是否具有毒性的殺蟲組合物，包括化學殺蟲劑、殺真菌劑或抑真菌劑、抗生素、抗細菌劑、制菌劑、和殺線蟲劑或制線蟲劑(nematostatic agent)。這樣的包括CrylA. 105以及許多其它殺蟲劑的殺蟲劑組合可通過轉基因細胞生產，或用純化或基本純化的殺蟲劑配制成如下形式的殺蟲劑組合物，所述形式由灰塵、顆粒材料、油懸浮液、水懸浮液、油和水乳狀液的混合物、或可濕性粉末組成，然后再于用于葉施用的農業可接受載體中提供。也可以將這些組合物配制成種子處理，抑或與欲包含在種子處理中的組合物中的CrylA. 105 一起，抑或作為應用于來自已被轉化以表達殺蟲有效量CrylA. 105的轉基因植物的種子的組合物，從而將包含殺蟲劑的種子處理組合物連同從所述種子生長的植物的細胞一起提供給靶鱗翅目害蟲，所述細胞產生殺蟲有效量的CrylA. 105蛋白。各自對相同的昆蟲物種有毒性但通過不同的作用模式表現其毒性作用的殺蟲蛋白組合對于控制鱗翅目物種或者延遲對任一單種殺蟲劑的抗性開始是尤其有用的殺蟲劑組合，在未開始抗性前所述任一單種殺蟲劑有效對抗特定的鱗翅目物種。這樣的蛋白的示例性組合是，本發明的CrylA. 105蛋白，即第一殺蟲蛋白，與至少第二種不同于第一蛋白的殺蟲蛋白偶聯。這樣的不同殺蟲蛋白包括但不限于其它鱗翅目Bt.結晶蛋白(其它071’8、072’8、075’8、079’8)、￥1 蛋白、稱作1'1(蛋白的鱗翅目殺蟲蛋白以及由細菌的致病桿菌屬和光桿狀菌屬物種產生的殺蟲蛋白。向昆蟲害蟲的食物中提供一種或多種殺蟲蛋白以及設計用于實現dsDNA介導的對昆蟲存活所必需的一種或多種基因的基因抑制的試劑的組合，對于控制鱗翅目物種或者延遲對任一單種殺蟲劑的抗性的開始是尤其有用的殺蟲劑組合，在未開始抗性前所述任一單種殺蟲劑有效對抗特定的鱗翅目物種。用本發明的核苷酸序列轉化的植物也是本發明提供的另一實施方案。將DNA穩定導入植物細胞的方法是本領域已知的，且包括但不限于真空過濾、土壤桿菌或根瘤菌介導的轉化、電穿孔和各種沖擊法。導入植物中的DNA通常靶向插入核染色體中，盡管也可以實 現插入葉綠體或質體DNA中。導入植物中的DNA通常與為鑒定或選擇已被目的DNA穩定轉化的一種或多種細胞提供工具的序列連接或結合，所述序列包括但不限于可計分標記，比如熒光或光發射基因和編碼在適當底物存在下賦予被轉化的一種或多種細胞以比色特征的色素或酶的基因，或者通過包括允許對被轉化細胞和組織進行陽性選擇的選擇標記，從而為被轉化細胞提供生長優勢并基本上使未轉化細胞或組織變為靜止或死亡。這樣的選擇標記包括但不限于編碼草銨膦、bar、氨甲蝶呤抗性、新霉素磷酸轉移酶、草甘膦不敏感的EPSPS酶、草甘膦氧化還原酶(GOX)酶、大腸桿菌(E. coli)phnO或其等價物等的基因。本發明范圍內還包括載體和其它類型的序列，它們被設計用于在實驗室中操縱時維持、操縱和/或引導示例核苷酸序列，或者設計用于導入宿主細胞中，這些載體和其它類型的序列意欲包括但不限于噬菌體、質粒、桿狀病毒穿梭載體、yacmids、粘粒等。轉化的植物也在本發明范圍內。本發明公開內容尤其使被轉化以含有編碼至少CrylA. 105蛋白殺蟲片段的核苷酸序列的植物成為可能。單子葉和雙子葉植物都預計在本發明的范圍內。單子葉植物意欲包括但不限于玉米、小麥、燕麥、稻、高粱、買羅高粱、蕎麥、黑麥、草(羊茅、梯牧草、雀麥草、鴨茅、圣奧古斯丁草、狗芽根、剪股穎)和大麥，且雙子葉植物意欲包括至少苜蓿、蘋果、杏、蘆筍、豆、漿果、黑莓、藍莓、低芥酸菜子、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、櫻桃、鷹嘴豆、柑橘、棉花、豇豆、蔓越橘、黃瓜、葫蘆、茄子、果樹、葡萄、檸檬、萵苣、亞麻子、瓜、芥子、產干果的樹、秋葵、橘、豌豆、桃、花生、梨、李、馬鈴薯、大豆、南瓜、草莓、甜菜、向日葵、甘薯、煙草、西紅柿、蕪菁和蔬菜。這些植物的產物以及由這些植物產生的種子和組織明確包括在本發明內，只要該種子、組織或產物包含編碼CrylA. 105蛋白殺蟲片段的轉基因。本發明提供了在生物樣品中檢測CrylA. 105蛋白或編碼CrylA. 105蛋白殺蟲片段的核苷酸序列的方法。CrylA. 105可用于免疫動物以產生特異于CrylA. 105表位的抗體。CrylA. 105特異性抗體可用于檢測生物樣品中CrylA. 105的存在。檢測抗體與抗原結合的方法是本領域已知的。檢測生物樣品中抗體與CrylA. 105表位的結合對樣品中蛋白的存在有診斷價值。也可以檢測編碼CrylA. 105殺蟲片段的核苷酸序列。可以使用合成的核苷酸探針與靶序列，即編碼CrylA. 105殺蟲片段的核苷酸序列結合。檢測探針與靶序列結合的方法是本領域已知的。檢測探針與靶CrylA. 105編碼序列的結合對樣品中編碼序列的存在有診斷價值。合成的核苷酸引物可用于熱擴增反應以從被懷疑包含編碼CrylA. 105蛋白殺蟲片段的核苷酸序列的生物樣品中產生擴增子。在這樣的熱擴增反應中產生的擴增子的存在對樣品中該核苷酸序列的存在有診斷價值。作為對檢測生物樣品中本發明CrylA. 105編碼序列的存在有診斷價值的探針特別有用的序列是對應于或完全互補于(I)SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :3 所示第 1401-1420 位的核苷酸，或(2) SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :3 所示第1821-1840位核苷酸的序列。這些序列對應于(I)跨越編碼介于不同殺蟲蛋白部分的結構域II和結構域III之間的接頭的序列的20個核苷酸，所述結構域用于構建本發明蛋白的殺蟲部分，和(2)跨越編碼介于不同蛋白編碼部分的結構域III和毒素原編碼部分之間的接頭的序列的20個核苷酸，所述結構域和部分用于構建前毒素原CrylAb. 105蛋白的編碼序列。作為這些DNA部分(1401-1420或1821-1840)任一個的核苷酸序列，或與之互補的核苷酸序列可用作檢測生物樣品中這些編碼序列的存在的探針。對這樣的結合的檢測對生 物樣品中這樣的編碼序列的存在有診斷價值。如本領域技術人員所將認識到的這些DNA部分每一側側接的其它序列可用作從這樣的生物樣品中擴增各種大小的擴增子部分的引物，而且這樣的擴增子對樣品中這樣的編碼序列的存在有診斷價值。例如，對應于SEQ ID NOI中第1201-1220位所示核苷酸序列的第一引物序列可用作其中第二引物序列對應于SEQID NO :1中第1581-1600位所示核苷酸序列的反向互補體的熱擴增反應中的正向引物。當這樣的引物共同用于對包含SEQ ID NO :1的生物樣品的熱擴增反應中時，其將導致合成對應于SEQ ID NO :1第1201至第1600位核苷酸的擴增子，即400個核苷酸的擴增子，所述擴增子會包含SEQ ID NO :1所示第1401-1420位的20個核苷酸的部分，且由此將對這樣的樣品中CrylA. 105編碼序列的存在有診斷價值。提供了在樣品中檢測CrylA. 105存在或檢測編碼CrylA. 105的核苷酸序列的存在的試劑盒。連同該試劑盒還提供與實施檢測目的試劑的方法所需的所有試劑和對照樣品，以及使用說明書。以下實施例描述本發明的優選實施方案。對于本領域技術人員來說，考慮本文所公開的本發明說明書或實踐后，權利要求范圍內的其它實施方案也是顯而易見的。說明書以及實施例，僅欲被認為是示例性的，且實施例之后所附權利要求書指明了本發明的范圍和精神。實施例實施例I.該實施例闡述編碼殺蟲CrylA. 105蛋白的合成的核苷酸序列。構建用于雙子葉植物中的如SEQ ID NO 1所示的編碼CrylA. 105殺蟲蛋白的核苷酸序列。氨基酸序列翻譯示于SEQ ID N0:2。毒素編碼部分或多或少由約第I位至約第1830位核苷酸組成。構建用于在單子葉植物中表達的如SEQ ID NO :3所示的編碼CrylA. 105氨基酸序列的核苷酸序列。氨基酸序列翻譯示于SEQ ID N0:4。毒素編碼部分或多或少由約第I位至約第1830位核苷酸組成。SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示核苷酸序列彼此基本等同。SEQ ID NO 1和SEQID NO 3表現約94. 3%的總體同一性。這兩條編碼序列從約第1330位核苷酸至第3534位核苷酸等同。各序列的毒素編碼部分由約第I位的核苷酸至第1830位的核苷酸組成，且這些部分彼此表現約88. 9%的同一性。兩條序列間的基本差別在于約第I位核苷酸至約第1329位核苷酸，或編碼CrylA. 105蛋白毒素部分的約第一個三分之二的部分。這兩條序列貫穿該部分表現約84. 7%的同一性。根據《國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約》，于2005年8月31日將用名稱為PM0N70522的質粒轉化的大腸桿菌菌株(T0P10, Invitrogen, Inc.)保藏于位于 1815North University Street, in Peoria, Illinois 61604 U.S.A.的國際保藏單位農業研究機構保藏中心(Agriculture Research Culture Collection) (NRRL),并命名為NRRLB-30873，所述名稱為pM0N70522的質粒包含P -內酰胺酶選擇標記和SEQ ID NO 3所示編碼CrylA. 105的序列。實施例2該實施例闡述表達CrylA. 105蛋白的轉基因棉花植物。

將Delta和Pineland DP50棉花種子表面滅菌，并過夜萌發。分離分生組織外植體，且通過顯微解剖除去初生葉。將解剖的外植體放入祀向培養基(targeting medium)中，從而使分生組織定向為與粒子遞送(particle deliyery)方向垂直。轉化載體，pM0N47740,含有帶有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的表達盒。從該質粒中切除KpnI片段，用HPLC分離，并用于槍(gun)轉化棉花分生組織外植體，所述KpnI片段包含在e35S啟動子控制下的⑶S標記基因和在eFMV啟動子控制下的葉綠體靶向的CrylA. 105編碼序列。將包含CrylA. 105表達盒和⑶S標記兩者的純化的DNA沉淀在顯微金珠上，并在Mylar片(sheet)上包被成薄層。在部分真空下，通過放電式粒子遞送(electric discharge particle delivery)將DNA加速進分生組織。轟擊后，將外植體去靶向(de-target)到不含選擇劑的無激素培養基中。對來自再生小植物的葉組織取樣，并測定⑶S標記的表達。將表現高水平GUS表達的轉基因植物送到溫室中作進一步篩選。再次測試這些植物中GUS的表達，并剪除植物中陰性的部分。重復進行取樣和剪除GUS-陰性組織的循環，直到取自各植物的所有部分都是GUS標記陽性的。之后在標準溫室條件下維持這些植物直到收獲種子。用生物測定測試從FlOTS陽性轉基因棉花植物獲得的組織針對棉鈴蟲(CBW)和草地夜蛾(FAW)的殺蟲活性。將以前產生的表達殺蟲水平的CrylAc或CrylAc與Cry2Ab的組合的同基因棉花植物用作陽性對照，且將非轉基因同系(isoline)用作陰性對照。將CBW棉蕾測定(square assays)用作確定轉基因棉花植物殺蟲活性的一種方法(Adamczyck 等人，(2001) J. Econ. Entomol. 94 :284-290 ；Kranthi 等人(2005) CurrentScience 89:291-298)。收集葉組織棉蕾(火柴頭大小或更大)并單獨置于測定孔中。各棉蕾用一個三齡CBW幼蟲侵襲。侵襲后五天記錄存活昆蟲的數目。還采用CBW棉鈴測定(boll assays)確定了從轉基因植物收集的棉鈴組織的殺蟲活性。從各事件收集了 8個硬綠色棉鈴(開花后)并置于單獨的杯中，并用三齡CBW幼蟲侵襲。侵襲后五天記錄存活昆蟲的數目。進行葉測定來確定轉基因葉組織對FAW的殺蟲活性。從棉花植物末端取新葉。收集兩個直徑各為約3/4"的葉孔(punch)并將其置于16個單獨的測定孔的各孔中。各孔用單個二齡或三齡FAW幼蟲侵襲。侵襲后五天記錄存活昆蟲的數目。
生物測定結果示于表I。結果顯示，表達CrylA. 105的轉基因棉花事件比表達CrylAc或CrylAc與Cry2Ab的組合的轉基因事件對FAW和CBW均表現更強的殺蟲活性。表I.用轉基因棉花植物組織對FAW和CBW的生物測定結果。
植物FAW ( %存活) CBW ( %存活) CBW ( %存活)
__(葉組織)__(棉蕾組織)__(棉鈴組織)
CrylAc/Cry2Ab__74^5__32_0__35^8_
CrylAc__92/7__35^__35^_
_[5]_|__9^6__9^8__54_
_17238__109__9A__25_
_17567__0__IZ5__1^5_
_17774__L6__L2__0_
_17875__3_1__4^2__0_
_18026__L6__IO__12^_
181227.822.90還在類似的生物測定中測試了煙夜蛾和棉鈴葉蛾。在各情況中，CrylA. 105植物也表現針對這些害蟲的殺蟲活性。實施例3本實施例闡述表達CrylA. 105蛋白的轉基因玉米植物。從用載體pM0N40232轉化的細胞再生轉基因玉米植物。pM0N40232包含具有SEQID NO :7所示核苷酸序列的表達盒，所述表達盒包含可操作地連接的增強的CAMV 35S啟動子、小麥CAB前導序列、稻肌動蛋白I內含子、CrylA. 105編碼序列和小麥hspl7基因3’轉錄終止和多腺苷酸化序列。編碼鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS葉綠體祀向序列(At. EPSES-CTP2)的核苷酸序列位于CrylA. 105編碼序列上游且與其符合讀框。pM0N40232包含編碼對除草劑草甘膦不敏感的EPSPS的重組基因，以用于選擇轉基因事件。將從用PM0N40232轉化的組織得到的轉基因事件命名為LAJ105。篩選轉基因事件中任何載體主鏈的不存在、單個簡單插入序列的存在、以及包含編碼CrylA. 105蛋白的核苷酸序列的表達盒的完整性。對滿足事件篩選限制的事件作生物測定。在該生物測定中，將LAJ 105轉基因玉米植物與同基因LH198陰性對照和表達CrylAb蛋白殺蟲部分的陽性對照M0N810品種作比較。從10個單獨的CrylA. 105轉基因事件以及對照的每一個獲取五個各直徑約I厘米的葉盤。將葉盤置于填充有瓊脂的孔中以保持植物材料腫脹。之后將葉盤飼喂給FAW、小地老虎(BCW)、玉米螟(ECB)、棉鈴葉蛾(CEW)和西南玉米桿草螟(SWCB)新生幼蟲。各孔應用一只新生FAW幼蟲、一只CEW幼蟲、兩只新生BCW、兩只新生SWCB幼蟲或四只新生ECB幼蟲。四天后用葉損害率(LDR)等級0-11來評估飼喂損害，0表示沒有可見的飼喂損害，11表示至少50%的葉盤被吃掉，且該等級上0至11的各點表示在觀察中所觀察到的葉盤飼喂損害的5%增長。生物測定結果表示，表達CrylA. 105蛋白的事件對FAW、ECB和CEW表現的殺蟲活性比CrylAb對照對相同害蟲幼蟲所表現的LDR更強。這三種害蟲在CrylA. 105事件上的LDR小于1，而CrylAb對照表現的LDR范圍在約8至約10。對于CrylA. 105事件和CrylAb對照，測試針對SWCB的活性時，其LDR始終為I至2，這表示CrylA. 105蛋白對于SWCB不比CrylAb具備更高的毒性。該生物測定的結果支持了表明CrylAb對于控制BCW無效 這一從前的結果。CrylA. 105事件對抗BCW并不比CrylAb對照更有效。因此，以CrylA. 105蛋白在植物中(in planta)的表達水平，這些植物在控制包括但不限于葉蛾屬、尺葉蛾屬、Rachiplusia、實葉蛾屬、Helicoverpa、灰翅葉蛾屬、葉小卷娥屬和Armigera屬中的其它鱗翅目屬植物害蟲中是有效的。
權利要求
1.控制轉基因植物中灰翅葉蛾屬昆蟲侵襲并提供昆蟲抗性控制的方法，其包括在植物中表達至少兩種不同的對灰翅葉蛾屬物種/昆蟲有毒性的殺蟲蛋白。
2.權利要求I的方法，其中所述至少兩種不同的殺蟲蛋白包括殺灰翅葉蛾屬昆蟲的VIP蛋白和殺灰翅葉蛾屬昆蟲的Cryl蛋白。
3.權利要求2的方法，其中作為所述表達的結果，通過延遲攝食所述植物的灰翅葉蛾屬昆蟲群體中對所述VIP和Cryl蛋白的昆蟲抗性的開始而提供所述昆蟲抗性控制。
4.權利要求I的方法，其中所述轉基因植物是選自玉米、小麥、燕麥、稻、高粱、買羅高粱、蕎麥、黑麥、羊茅、梯牧草、雀麥草、鴨茅、圣奧古斯丁草、狗芽根、剪股穎和大麥的單子葉植物。
5.權利要求I的方法，其中所述轉基因植物是選自苜蓿、蘋果、杏、蘆筍、豆、漿果、黑莓、藍莓、低芥酸菜子、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、櫻桃、鷹嘴豆、柑橘、棉花、豇豆、蔓越橘、黃瓜、葫蘆、茄子、果樹、葡萄、檸檬、萵苣、亞麻子、瓜、芥子、產干果的樹、秋葵、橘、豌豆、桃、花生、梨、李、馬鈴薯、大豆、南瓜、草莓、甜菜、向日葵、甘薯、煙草、西紅柿、蕪菁和蔬菜的雙子葉植物。
6.權利要求2的方法，其中所述Cryl蛋白是CrylA蛋白。
7.權利要求6的方法，其中所述CrylA蛋白是CrylA.105蛋白。
8.控制轉基因植物中灰翅葉蛾屬侵襲同時抵御對所述植物的灰翅葉蛾屬昆蟲抗性的發展的方法，其包括在所述植物中表達a)殺灰翅葉蛾屬的VIP蛋白和b)殺灰翅葉蛾屬的Cryl蛋白的組合。
9.充分延遲灰翅葉蛾屬群體中對表達殺蟲蛋白的轉基因植物的昆蟲抗性的開始以控制所述昆蟲的方法，其包括在所述植物中表達殺所述昆蟲的VIP蛋白以及殺所述昆蟲的Cryl蛋白。
10.降低對表達殺蟲蛋白的轉基因植物的灰翅葉蛾屬昆蟲抗性的出現的可能性以控制所述昆蟲物種的方法，其包括在所述植物中表達殺所述昆蟲物種的VIP蛋白以及殺所述昆蟲物種的Cryl蛋白。
11.播種、種植或生長受到抗草地夜蛾保護的植物的方法，其包括如下步驟播種、種植或生長包含編碼殺灰翅葉蛾屬昆蟲的VIP蛋白的基因和編碼殺灰翅葉蛾屬昆蟲的Cryl蛋白的基因的植物。
12.權利要求8-11中任一項的方法，其中所述Cryl蛋白是CrylA蛋白。
13.權利要求12的方法，其中所述CrylA蛋白是CrylA.105蛋白。
14.用于轉基因植物的有效的灰翅葉蛾屬昆蟲抗性控制的方法，其包括在所述植物中以高水平共表達兩種或更多種對灰翅葉蛾屬昆蟲有毒性但各自表現出不同的實現其殺滅活性的模式的殺蟲蛋白，其中所述兩種或更多種殺蟲蛋白包括VIP蛋白和Cryl蛋白。
15.權利要求14的方法,其中所述Cryl蛋白是CrylA蛋白。
16.權利要求15的方法，其中所述CrylA蛋白是CrylA.105蛋白。
全文摘要
本發明涉及編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列。具體地，本發明提供編碼表現鱗翅目抑制活性的殺蟲蛋白的核苷酸序列，以及在本文中稱作Cry1A.105殺蟲劑的新殺蟲蛋白，表達該殺蟲劑的轉基因植物，和檢測生物樣品中該核苷酸序列或殺蟲劑的存在的方法。
文檔編號A01H5/00GK102766652SQ20121025757
公開日2012年11月7日 申請日期2006年8月30日 優先權日2005年8月31日
發明者C·P·羅馬諾, D·R·科爾賓, F·J·佩爾拉克, J·K·羅伯茨, N·N·博達諾瓦, T·M·馬爾瓦 申請人:孟山都技術有限公司