專利名稱：枳抗寒轉錄因子PtrICE1及其在植物抗寒改良中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域。具體涉及ー種從積(Poncirust rifoliata)中分離、克隆得到一個編碼MYC類型的bHLH (basic helix-loop-helix,堿性螺旋-環-螺旋)家族轉錄因子的基因PtrlCEl，還涉及一種枳抗寒轉錄因子PtrICEl基因在植物抗寒改良中的應用，將該基因轉化煙草和檸檬，獲得的轉基因植株抗寒能力明顯提高。
背景技術：
自然界中，植物生長在ー個開放的環境中，經常會受到惡劣環境如寒凍、高溫、干旱、水澇和高鹽等逆境的脅迫。低溫是植物區域性和季節性的主要生態限制因子，低溫冷害是農業生產的ー種嚴重的自然災害。因此，弄清植物寒凍損傷及其抗寒性機理具有非常重要的理論意義和實踐價值。事實上，植物在漫長的演變過程中，已經建立了一套應答逆境脅迫的機制，涉及到植物對逆境信號的感受、逆境信號的傳遞，以及相應受體對逆境信號的識別與轉導等三個階段，此過程受ー個錯綜復雜的信號通路調控。近年來，國內外在植物抗凍方面開展了大量工作，研究結果表明冷誘導基因在植物抗低溫和冷馴化過程中起著重要的作用(Th omashow，1999)。這些冷誘導基因編碼的產物可以分為兩類，一類是與植物抗寒性的提高直接相關的功能性蛋白，比如一些涉及脂類代謝、糖代謝以及抗氧化的酶，分子伴侶，抗凍蛋白，其它起滲透調節作用的物質；另一類是調控性蛋白，參與寒冷信號傳導的調控、抗寒基因表達的調控和抗寒蛋白活性的調節(Shinozaki andYamaguchi-Shinozaki 2007 ；Lata and Prasad, 2011 ;Qin 等，2011)。大多數冷和干旱響應的基因在它們的啟動子里都有ー個或多個DRE/CRT順式作用元件，它的核心序列是CCGAC。ー個被稱之為CBF/DREBls的轉錄因子家族能夠結合這個核心元件井能激活或誘導下游干旱或低溫響應基因的表達，但是這類轉類因子它們自身卻是受低溫的誘導然后才就進一步誘導含有DRE/CRT作用元件的下游基因的表達。因此，低溫脅迫下的基因表達網絡是ー個級聯連鎖反應過程。CBFs或DREBls基因的超表達，可在室溫下啟動下游基因的表達，并提高轉化植物的耐寒能力。由于CBF/DREB1的轉錄是在將植物置于低溫15Min后才開始的，Gilmour等(1998)提出了一種假說可能在常溫的情況下那里已經有ー個轉錄因子，可能識別CBF的啟動子并誘導其表達但在常溫的情況下是以非活化的狀態存在的，Gilmour將這個未知的轉錄因子稱之為ICE1，并假設將植株置于低溫的條件下，修飾ICEl或者與其互作的蛋白并允許ICEl結合到CBF的啟動子并誘導CBF的表達。HOSl基因編碼ー種環指泛素E3連接酶，它可以與ICEl蛋白結合并參與調控ICEl的泛素化降解，它是ICEl及其下游目標基因的負調控因子(Dong等，2006).在低溫的過程中，SIZl蛋白起著SUMO E3連接酶的作用，在冷馴化的過程中，SIZl可以促進SUMO蛋白與ICEl蛋白的賴氨酸(K393)位點結合，從而阻止ICEl的泛素化降解，提高ICEl的穩定性并激活ICEl蛋白(Mi ura等，2007)。擬南芥的轉錄組分析結果表明，在ICEl功能缺失型突變體中，939個擬南芥冷響應基因中有369個(39. 3%)表達水平發生了變化。其中133個編碼冷響應轉錄因子的基因中有52個(39. 1%)表達水平發生了變化。另外，ICEl基因是組成型表達，但它的超表達可在低溫下增強CBF3的轉錄表達并提高轉基因植株的耐寒能力。因此，ICEl基因在擬南芥的抗寒中起著關鍵性的調控作用。Lee等(2005)采用基因芯片的方法從整個轉錄組水平上研究了 ICEl在擬南芥耐寒及其在基因表達調控中的作用，icel突變體影響了ー些低溫脅迫早期應答基因以及受ABA或生長素調控基因的表達，進ー步驗證了 ICEl在植物低溫脅迫應答中起著關鍵性的核心作用。迄今，ICEl基因已從擬南芥(Chinnusamy 等，2003)、芥菜(Wang 等，2005)、楊樹(Lin 等，2007)、小麥(Badawi 等，2008)、茶(Wang等，2012)、蘋果(Feng等，2012)中分離得到。枳是柑橘產業中應用較廣泛的ー種砧木，極抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有關抗寒基因克隆問題的通想材料。因此，克隆積抗寒有關基因是抗寒基因工程的關鍵和基礎。

發明內容
本發明目的在于提供了一種從積(Poncirus trifoliata)中分離克隆的抗寒 轉錄因子基因，此基因可編碼MYC (myelocytomatosis oncogene)類型的bHLH (basichelix-loop-helix，堿性螺旋-環-螺旋)家族轉錄因子，申請人將此基因命名為PtrlCEl，其序列為SEQ ID NO. I所示。本發明另ー個目的是提供了一種從積(Poncirus trifoliata)中分離克隆的轉錄因子基因在植物抗寒改良中的應用，通過農桿菌介導遺傳轉化方法將該轉錄因子轉化煙草和檸檬，獲得的轉基因植株經生物學功能驗證，表明本發明克隆的PtrICEl基因具有調控抗寒功能。為了實現以上目的，本發明采用以下技術方案申請人:利用植物基因克隆技術從枳中克隆得到ー個新基因PtrICEl，一種分離的PtrICEl基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :I所示，其中161_1840bp處為該基因的編碼區，包含1680bp的開放閱讀框；編碼559個氨基酸，其編碼的氨基酸序列為序列表SEQ ID NO:2所示，等電點為5. 27，分子量為61kD。申請人:設計了克隆上述基因PtrICEl的cDNA序列的引物對，其核苷酸序列如下所示正向引物5，-TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3，，即SEQ ID NO. 3 ；反向引物5’ -ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3，，即 SEQ ID NO. 4。利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化煙草和檸檬，獲得的轉基因植株，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的PtrICEl基因具有調控抗寒功能。在本發明的實施例部分，我們闡述了枳PtrICEl轉錄因子的分離、功能驗證和應用。與現有技術相比，本發明具有以下優點和效果l、PtrICEl基因的發現，為植物抗非生物逆境分子設計育種提供新的基因資源，為實施綠色農業提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發利用有利于降低農業生產成本和實現環境友好。2、通過農桿菌介導遺傳轉化方法將該轉錄因子轉化煙草和檸檬，獲得的轉基因植株，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的PtrICEl基因具有調控抗寒功能。


圖I為一種本發明的技術流程示意圖。圖2為一種本發明的PtrICEl基因在脫水、低溫和鹽脅迫下的表達示意圖。其中圖2A是本發明的基因在枳田間苗(未轉基因)室溫下脫水不同時間點的表達模式；圖2B是枳的田間苗(未轉基因)在4°C處理下，相應時間點取樣，采用實時定量PCR分析本發明的基因相對表達量；圖2C是枳的田間苗(未轉基因)在200mM氯化鈉處理下，相應時間點取樣，采用實時定量PCR分析本發明基因的相對表達量。
圖3為一種本發明的PtrICEl基因亞細胞定位示意圖。其中圖3A，GFP基因(對照)在明場(圖左)、紫外線(UV)光(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成像；圖3B，PtrICEl基因在明場(左)、UV光(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成像。圖4為一種本發明的PtrICEl基因轉錄激活鑒定示意圖。其中圖4A是空載體(pGBKT7)在不同培養基上的生長情況；圖4B是融合載體PtrICEl基因在不同培養基上的生長情況。圖5A為一種本發明的實施例3的載體構建流程示意圖。圖5B為一種pMV載體示意圖。圖6為一種本發明的PtrICEl基因轉化煙草過程示意圖。其中圖6A，葉片共培養；圖6B轉基因煙草再生愈傷；圖6(，轉基因煙草再生芽；圖6D，抗性芽伸長；圖6E和圖6F，抗性苗及植株生根。圖7為一種本發明中實施例PtrICEl轉化檸檬及植株再生過程示意圖。其中圖7A是轉化后30天的照片；圖78是在篩選培養基上生長60天的材料；圖7(是抗性芽在伸長增殖培養基上；圖7D是再生芽誘導生根。圖8為一種PtrICEl基因轉基因植株的PCR鑒定示意圖。圖8A，利用NPTII基因特異引物(上)和基因特異引物(下)PCR鑒定煙草TO代轉基因植株。圖8B，是采用CaMV35S-PtrICEl特異引物(上)和NPTII基因特異引物(下)對檸檬轉基因植株進行PCR鑒定。M =Marker, P :質粒，WT :野生型植株，1-20 :轉基因株系。圖9為一種PtrICEl基因轉基因植株的基因表達量分析示意圖。圖9A，煙草轉基因植株中外源基因PtrICEl的表達量分析(半定量RT-PCR)。CK為野生型，其作為轉基因系。圖9B，實時定量PCR分析檸檬不同轉基因株系中的PtrICEl基因的表達量。WT :野生型植株，其余編號轉基因株系。圖10為一種本發明中實施例轉PtrICEl基因株系(0E22和0E12)及野生型(WT)非轉基因植株(WT)低溫處理表型和生理指標測定示意圖。其中圖IOA是30天大的煙草植株在室溫生長和4°C處理2天的表型；圖IOB是4°C處理2天的植采用NBT (氯化硝基四氮唑藍)和DAB (二氨基聯苯胺)染色，分別指示02-含量和H202含量(染色越深，含量越高)。圖IOC是4°C處理后的相對電導率分析結果。圖11為一種本發明中實施例PtrICEl轉基因株系(0E22和0E12)及野生型植株(WT) _6°C處理2. 5小時的表型和生理指標測定示意圖。其中圖IlA是生長正常生長的盆栽植株(處理前)。圖IlB是_6°C處理2. 5小時后的表型。
圖IlC是_6°C處 理2. 5小時的成活率。圖12為一種本發明中實施例PtrICEl轉基因檸檬兩個轉基因系(#21和#17)及野生型植株的抗寒性分析。其中圖12A是兩個轉基因系(#21和#17)及野生型植株_6°C處理I. 5小時，然后在25°C恢復4天的表型。圖12B是兩個轉基因系(#21和#17)及野生型植株-6°C處理I. 5小時后的電率率。圖12C是采用臺盼藍和氯化硝基四氮唑(NBT)檢測WT、#17和#21植株葉片細胞死亡程度(左圖)和超氧陰離子含量(右圖)。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明做出詳細的描述。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例1，PtrICEl基因分離克隆及表達分析以ICEl為關鍵詞搜索柑桔EST數據庫(HarvEST:Citrus ver. O. 51)，得到I個相近序列，通過序列分析軟件(ORF Finder)發現基因ICEl缺少5端編碼序列，利用5’ RACE試劑盒(Clontech, Palo Alto, CA, USA)擴增出一個完整的ORF序列，該序列用Primer Premier 5. O 設計引物 GSPl (GSP，5’ -GGCCAGTAACATACCAGTCATCTTCCA-3’ )，用 RT-PCR 方法擴出5’端序列。將擴增的5’端序列及已有的一個ICEl利用軟件DNAstar重疊成一條序列。4°C低溫處理下從枳葉片抽提RNA及反轉錄，所得的第一鏈cDNA用于擴增PtrICEl基因全長。RNA抽提使用Trizol試劑盒(購自TakaRa，Code:D9108A，按照該試劑盒提供的操作說明書操作)，利用抽提的I μ g總RNA樣品經IU的DNaseI (購自Fermentas公司)室溫處理30分鐘后，加入I μ I EDTA(25mM)，于65°C溫育10分鐘。第一鏈cDNA的合成用MBI反轉錄試劑盒(貨號K1621,購自Fermentas公司，按照試劑盒說明書操作)。擴增基因PtrICEl 引物對為正向引物PtrICEl Forward, 5，-TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3，；反向引物PtrICEl Reverse, 5，-ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3’。50 μ I 的反應體系中包括 200ng cDNA, I X 緩沖液(TransSta rt FastPfuBuffer), IOmM dNTP, IU Taq 聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)(前述緩沖液和Taq聚合酶購自TRANS公司)，1.0μΜ上述引物。PCR反應在ΑΒΙ9700 (AppliedBiosystem)擴增儀上按以下程序完成95°C，I分鐘，95°C變性20秒，58°C退火20秒，72°C延伸60秒，40個循環；循環完成后72°C延伸5分鐘。產生一條單一 PCR條帶產物。產物經1% (g/ml)的瓊脂糖凝膠電泳后,用 ,Ζ.ΝΑ*" DNA凝膠回收試劑盒(購自Omega公司，美國)回收特異帶，提取步驟參照使用說明。回收純化的DNA溶液與pMD18_T載體(購自寶生物工程大連有限公司即TaKaRa公司)進行連接反應，按說明書操作。連接反應體系中插入PtrICEl基因與pMD18_T載體的摩爾比為3:1連接反應總體積是IOy 1，其中包括5μ I的2Χ緩沖液(購自寶生物工程大連有限公司)，4. 5μ I純化的PCR產物，0. 5μ1 T載體。16°C過夜連接。取10 μ I連接產物，采用熱擊法(參照《分子克隆實驗手冊》第三版，科學出版社，2002)轉化大腸桿菌DH5a，在含有50mg/L氨芐霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個克隆測序(由上海聯合基因公司完成)，測序結果表明，本發明克隆PtrICEl基因全長為1650bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO :I所示，通過測序、t匕對確定是本發明需要的目的基因，申請人將這個基因命名為PtrlCEl。PtrICEl基因包括1650bp的編碼閱讀框，編碼549個氨基酸，等電點為5. 27，預測的分子量為61kD。BLASTX分析該序列與已知的(所有已發表的文獻和數據庫)的植物序列高度同源。推導的PtrICEl基因的氨基酸序列與報道的蓖麻(RcICEl，XP_002511101，70%)、楊樹(PtICEl，EF405966，74%)、毛果楊(PsICEl，EF405966，72%)、榛(CsICEl)的序列高度同源(69%)。多序列比對結果顯示PtrICEl有C末段保守結構域，bHLH-ZIP結構域，和一個SUMO結構域。ExPASy分析表明編碼的氨基酸PtrICEl有二個核定位信號(NLS)。SMART預測氨基酸PtrICEl有一個轉錄激活區域。為分析PtrICEl基因是否對低溫、脫水和鹽處理響應，采用實時定量PCR分析該基因在上述處理下的表達。結果表明，，脫水處理(見圖2A)和低溫(見圖2B)鹽脅迫處理下該基因表(見圖2C)均能誘導該基因表達，表明它是一個逆境應答候選基因。實施例2，PtrICEl基因亞細胞定位和轉錄激活分析 由于PtrICEl基因有2個核定位信號，本實施例利用洋蔥表皮研究PtrICEl基因的亞細胞定位。利用RT-PCR擴增出PtrICEl基因整個0RF，并在其擴增引物兩端加上BamHI和Xhol兩個酶切位點。首先將擴增產物裝在PMD18-T載體上，從而得到一個PMD18-Tb/x_PtrICEl重組載體。同樣將GFP編碼整個ORF閱讀框裝在pMD18_T載體上，并在其兩端加上BamHI和KpnI兩個酶切位點，從而構建了一個pMD18_TB/K_GFP。同時用BamHI和KpnI去切pMD18-TB/x_PtrICEl和pMD18_TB/K_GFP，回收產物并連接，從而構建了一個重組載體，最后將這個重組載體和PMV載體同時用Xhol和KpnI酶切，回收并連接產物，從而得到pBI121-PtrICEl-GFP重組載體。在確認序列無誤后，將pBI121_PtrICEl_GFP重組載體及對照載體(PBI121-GFP)用熱擊法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗手冊》第三版，科學出版社，2002)分別轉入農桿菌EHA105。農桿菌侵染洋蔥表皮按如下方法進行I.劃平板，挑單克隆(含有重組質粒的農桿菌)于3ml YEB培養基(含卡那霉素(Km) 40 μ g/ml,利福平(Rif) 25mg/L)，28°C震蕩培養 24 小時，至 0D_ 約 O. 6。2.用手術刀將洋蔥內表皮劃成Icm2大小,撕下置于報道的MS基本培養基(含3%蔗糖，O. 75%瓊脂，不含激素)上暗培養24小時。3.按體積比為I :1000比例，接種50 μ I農桿菌菌液于50ml YEB (含Km 40 μ g/ml, Rif 25 μ g/ml)中，28°C振蕩培養 12-24 小時。4. 4000rpm,4°C離心 10 分鐘，棄上清。5.加入50mlYEB培養基(含有IOmM MgCl2)。將洋蔥表皮放入菌液中浸泡30分鐘。6.吸干表面菌液，置于MS基本培養基(含3%蔗糖，O. 75%瓊脂，不含激素)上28°C培養兩天。用Olympus BX61型顯微鏡觀察報告基因(GFP)定位情況。亞細胞定位結果表明含對照載體的農桿菌轉化的洋蔥表皮細胞中GFP熒光充滿整個細胞(圖3A)，而含PtrICEl基因載體的農桿菌浸染的洋蔥表皮中GFP熒光只在細胞核中(圖3B)，證明PtrICEl是核定位基因。利用酵母體系驗證本發明基因PtrICEl是否具有轉錄激活活性。方法如下
首先將PtrICEl基因構建到pGBKT7的GAL4-DB (購自CLONTECH公司)上，得到融合表達載體，(利用RT-PCR擴增出PtrICEl基因整個0RF，并在其擴增引物兩端加上NcoI和BamHI兩個酶切位點。首先將擴增產物裝在pMD18_T載體上，從而得到一個 PMD18-TN/B_PtrICEl 重組載體。同時用 NcoI 和 BamHI 去切 PMD18_TN/B_PtrICEl和pGBKT7，回收產物并連接，從而得到pGBKT7+PtrICEl重組載體)將融合表達載體及空載體(PGBKT7)分別轉化酵母菌株AH109 (購自CLONTECH公司)，然后在不同缺失培養基(SD/-Trp/-HiS/-Ade)上培養，從而確定本發明的基因是否具有激活功能。實驗結果表明，對照載體轉化的酵母細胞在含有3-AT (3-氨基三唑)的培養基上生長完全受到抑制，(圖4A)。而當融合載體(有PtrICEl基因)轉化酵母細胞后，在所在培養基上均能正常生長，表明PtrICEl確實具有轉錄激活功能(圖4B)。實施例3，植物轉化載體構建
根據pMV載體(植物二元轉化載體PBI121切除⑶S基因后得到的載體，由華中農業大學園藝林學學院葉志彪教授惠贈，Wang et al.，2011)中的多克隆位點和PtrICEl基因的編碼區序列，按照一般設計引物的原則用Primer Premier5. O軟件設計出擴增PtrICEl基因整個編碼區的上、下游PCR引物(該引物對就是擴增本發明PtrICEl基因cDNA序列的引物對)。其序列如下所示Forward primer :5’ -TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTGG-3> ；Reverse primer :5’ -ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3’ ；下劃線為酶切位點。以PtrICEl基因的克隆子為模板進行PCR擴增。PCR擴增的退火溫度為60°C。PCR反應體系及擴增程序同實施例I。雙酶切體系反應總體積為40μ 1，其中含有PCR的純化產物 8μ 1，IOXT 緩沖液(購自 TakaRa 自公司)6μ I 及 O. 1% (g/ml)BSA 4μ I,Kpn I 及 Sail 各2μ 1，雙蒸水18 μ I。在37°C酶切過夜后純化回收。pMV載體的雙酶切體系反應總體積為40 μ 1，其中含有經過質粒提取獲得的pMV載體DNA8y 1，10XM緩沖液(購自TakaRa公司)4μ 1，Kpn I及Xho I各2μ1，加雙蒸水24μ L·于37°C酶切過夜后純化回收。連接反應體系中插入PtrICEl基因與載體pMV的摩爾比為3:1，反應總體積為10 μ 1，其中含有IOXBuffer I μ 1，T4DNA連接酶I μ l，PtrICEl基因的雙酶切回收產物6 μ 1，pMV載體的雙酶切回收產物2 μ I。在16°C反應14-16小時，連接產物轉化大腸桿菌菌株DH5 α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，抽提質粒進行酶切及PCR鑒定，測序確定沒有讀碼框突變，獲得含有插入目的片段的重組克隆，將其命名為PMV-PtrICEl重組載體，應用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年)將重組載體pMV-ICEl導入到農桿菌EHA105中。真核表達載體PMV-PtrICEl構建流程見圖5A所示，其中pMV載體圖見5B。實施例4，煙草的遺傳轉化應用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年)將重組載體pMV-PtrlCEl導入到根癌農桿菌EHA105中，根癌農桿菌介導的煙草遺傳轉化步驟如下I.農桿菌EHA105培養取超低溫冰箱中保存的根癌農桿菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上劃線，刮取劃線菌斑，加入液體MS基本培養基中，28°C 180轉/分鐘振蕩培養，待菌液濃度達到OD_=0. 3^0. 8時作浸染。2.浸染取未轉基因的煙草葉片，切成O. 5cmX0. 5cm大小,然后放入制備好的根癌農桿菌菌液中，浸泡8 10分鐘，期間不斷振蕩。3.共培養取浸染后的煙草葉片，無菌濾紙吸干上面的的菌液，然后接種于共培養培養基上(葉背面向下)，25°C暗培養3天。4.篩選培養經共培養3天后的煙草葉片，用500mg/L濃度的頭孢霉素溶液洗一遍，然后無菌水沖洗3飛次，再轉移入添加了 100mg/L卡那霉素和500mg/L頭孢霉素的篩選
培養基中。5.生根培養待篩選培養基上的不定芽長到Icm左右時，切下并轉入添加了IOOmg/ L Km和500mg/L Cef的生根培養基上。 6.煙草苗轉入土培待生根后的轉化苗長滿培養瓶，由生根培養基中取出，用自來水洗凈轉化苗上的培養基，并栽植于滅菌的營養土中。煙草轉化過程見圖6。煙草轉化苗所用培養基見表I。表I煙草轉化苗所用培養基配方
培養Il名Il !1分及介M(i#養基均含會30g/L蔗糖卿0‘7g/L iill, pH調—ti 5.8)
共培養培養基 MS坫木培養坫+2.0 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA締選培養基丨:述凡培養培莽越+100 mg/L Km+500 mg/L Cef
免根培養搞 MS 搞本培養坫+0.3 mg/L NAA+100 mg/L Km +500 mg/L Cef7.陽性轉基因煙草初步確定按照上述方法得到轉PtrICEl煙草抗性芽，提取DNA。方法如下 設計引物NPTII和基因特異引物(引物見表2)進行PCR擴增鑒定陽性苗。鑒定為可能的陽性植株移栽后獨立收獲種子(Tl代種子)，4°C春化處理3天，取O. Ig在1.5ml的離心管中，先用70%(V/V)酒精浸泡種子20秒，接著用滅菌雙蒸水洗一次，再加入lml2. 5%NaC10(V/V)表面消毒7分鐘，充分振蕩，棄去NaClO后用滅菌雙蒸水洗3次，最后用接種針將滅好的種子播于50mg/l具有卡那霉素(Km) MS基本培養基的上，結果表明本發明獲得的抗性苗在抗性平板上能正常生長，為綠色，而非抗性苗則黃化死去。成活的植株移栽再收獲Tl代種子，T2代種子用于播種及抗性分析。實施例5，檸檬的遺傳轉化I、取檸檬種子，用lmol/L的NaOH浸泡15分鐘后洗凈，再在超凈工作臺上用2%(體積比)的次氯酸鈉浸泡滅菌15-20min，無菌水洗滌3次再在無菌條件下剝去種皮，接種于MT固體培養基上，暗培養3-4周再光照培養3-5d用于轉化。2、農桿菌在含有卡那霉素50mg/L的固體LB培養基上劃線，28°C暗培養兩天；挑取單菌落接種在新的加有卡那霉素的LB平板上，28°C暗培養2-3天；用手術刀刮下已長好的農桿菌，接種在不加抗生素的液MT培養基中，同時加20mg/L (IOOuM) AS，28°C 200r/min振蕩培養2h (同時在這段時間準備切上胚軸)；用分光光度計測量菌液的0D_值，用MT液體培養基調整OD6tltl值到O. 6-0. 8進行侵染。3、取實生苗上胚軸，于超凈工作臺斜切成1-1. 5cm長莖段，切好的莖段暫時放于滅菌的空三角瓶中(加少量水保濕)，待農桿菌菌液制備完成后用于轉化。4、將切好的外植體浸泡在已制備好的農桿菌菌液里，侵染20min，中間搖動幾次。侵染完后用無菌吸水紙吸干外植體表面菌液，再接種到共培養基上21-23°C暗處共培養3天。5、共培養3天后，用無菌水洗3-5次，再用無菌吸水紙吸干表面的農桿菌，轉到加有卡那霉素50mg/L及頭孢霉素400mg/L的篩選培養基上，25°C暗培養4周后再轉到光照條件下培養。在篩選培養基上長出抗性芽，當抗性芽>0. 5cm時，再轉到伸長培養基上促其伸 長。待芽有I. 5cm長時，切下并轉入生根培養基誘導生根，檸檬轉化過程見圖7。常用培養基配方LB固體培養基蛋白胨10g/l+酵母提取物5g/l+NaCl 10g/l+瓊脂15g/l檸檬生芽及伸長培養基MT+BAL Omg/1 +瓊脂 . 5g/l+蔗糖35g/l (pH為5. 8)檸檬生根培養基1/2MT+IBA0.lmg/l+NAAO. 5mg/l+ 活性炭 O. 5g/l+ 瓊脂 7. 5g/l +鹿糖 35g/l (pH 為 5. 8)實施例6，轉基因植株的分子鑒定I、煙草和檸檬葉片DNA提取取適量的葉片放入I. 5mL離心管中，加液氮，充分研磨后；加入700 μ 165°C預熱的DNA提取緩沖液十六烷基三乙基溴化銨(簡稱CTAB，配方IOOmM Tris-HCl (pH8. O)，I. 5MNaCl, 50mM EDTA(pH8. O)溶液加1%聚乙烯吡咯烷酮，2% (體積比)CTAB，65°C水浴充分溶解備用，用前在65°C水浴預熱后，加入1-4% (體積比)巰基乙醇，混勻，65°C溫浴60-90分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒混勻；10000g，離心10分鐘；取上清，加600 μ I氯仿，顛倒混勻靜置3分鐘;10000g，離心15分鐘；取上清450μ 1，加入900 μ I預冷無水乙醇，420 μ I 5ΜNaCl，混勻后，冰凍30分鐘，IOOOOg,離心10分鐘；棄上清后，用Iml 75%的乙醇，洗滌3次后，加適量雙蒸水溶解。2、陽性轉基因植株PCR檢測采用引物NPTII和基因特異引物對煙草DNA進行PCR擴增。引物序列、反應程序及體系分別見表2、表3和表4。采用特異引物進行PCR鑒定。煙草轉基因植株鑒定見圖8A，檸檬轉基因植株鑒定見圖SB。表2引物序列信息
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NPTII IHi-I-JIfi S- AGACAATCGGCTGCTCTGAT -3'56 74權利要求
1.一種分離的基因，其特征在干PtrICEl基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。
2.根據權利要求I所述的ー種分離的基因，其特征在于所述基因的正向引物為5’-ITGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3’；反向引物為5’ - ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3，。
3.權利要求I所述基因在植物抗寒改良中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種枳抗寒轉錄因子PtrICE1基因及其在植物抗寒改良中的應用，申請人利用植物基因克隆技術從枳中克隆得到一個新基因PtrICE1，其核苷酸序列為SEQ ID NO1所示，其中161-1840bp處為該基因的編碼區，包含1680bp的開放閱讀框；編碼559個氨基酸，其編碼的氨基酸序列為序列表SEQ ID NO2所示，等電點為5.27，分子量為61kD。利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化煙草和檸檬，獲得的轉基因植株，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的PtrICE1基因具有調控抗寒功能。PtrICE1基因的發現，為植物抗非生物逆境分子設計育種提供新的基因資源，為實施綠色農業提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發利用有利于降低農業生產成本和實現環境友好。
文檔編號A01H5/00GK102776203SQ20121025825
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者付行政, 劉繼紅, 黃小三 申請人:華中農業大學