專利名稱：一種調控植物葉片衰老的轉錄因子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種調控植物葉片衰老的轉錄因子及其應用。
背景技術：
葉片衰老是作物生長發育的一個關鍵環節，是一個受到嚴格調控的生理生化和分子生物學過程，不僅受到植株和葉片的發育進程影響，也受到外界環境因子的影響[Chandlee JM, et al, Physiologia Plantarum, 113: 1-8, 2001; Gepstein S， etal, Genome Biology, 5(3): 212, 2004; Nam HG, Trends Plant Sci, 8(6): 272-277， 2003]。葉片衰老的啟動以后，光合功能迅速衰退，取而代之的是積累在葉片中的大分子營養物質被快速降解并高效地轉運到新生或忙藏器官中[Nam HG, Curr Opin Biotech,8: 200-207， 1997; Nam HG, Annu Rev Plant Biol, 58: 115-136， 2007; Smart CM,New Phytolj 126: 419-448， 1994; Yoshida S. Current Opinion in Plant Biology,6: 79-84，2003]。因而，葉片衰老啟動的時間節點關乎到作物的光合總量和營養物質的再利用效率，即啟動過早會減少光合產物(干物質)的積累，而啟動過晚則減少營養物質的再動員(remobilization)。研究表明，一些情況下,適當地延緩葉片衰老不僅可以增加作物的產量潛力，而且還能夠提高作物的抗逆性[Rivero RM，et al, PNAS, 104(49):19631-19636，2007];另一些情況下，適當地加速葉片衰老不僅可以提高作物在逆境中的收獲產量和質量，也可以提高植株水平上的抗逆(旱)性(Munne B, et al, FunctionalPlant Biology, 31: 203-216，2004)。因此，發掘葉片衰老啟動及其進程的關鍵調控因子，建立它們在遺傳改良上的應用模式，在作物的遺傳改良上具有重要的應用前景。NAC是高等植物中所特有的一類轉錄因子，其命名來源于上世紀90年代發現的3個基因矮牽?；?、擬南芥47 / / 和基因[Aida M, et al, Plant Cell, 9(6):841 - 857，1997]。NAC轉錄因子最主要的結構特點是各成員的N端含有高度保守的NAC結構域，整個N端區域可劃分為5個亞結構域(A、B、C、D、E)，其中亞結構域A、C、D高度保守，亞結構域C、D序列中含有核定位信號(nuclear localization signals, NLS),可能與轉錄因子核定位及啟動子上特定順式元件的識別有關[Kikuchi K, et al, Mol Gen Genet, 262(6):1047-1051, 2000 ；0oka H, et al, DNA Res, 10(6) : 239-247，2003]。E 亞結構域在 NAP、AtNAC3、ATAF 和 0sNAC3 亞家族中高度保守[Ooka H, et al, DNA Res, 10(6) : 239-247，2003] ο C 端是轉錄激活功能區(transcrip tional activation regions, TARs),具有高度的多樣性，該端的共同特點是一些氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸重復出現的頻率高。2003年，Ooka等通過全基因組分析，在擬南芥中發現105個NAC轉錄因子，在水稻中則發現75個NAC成員。通過比較NAC結構域的氨基酸序列，將它們分成2個大族，3個亞族(08應034了八 ，應10。根據近幾年報道，NAC家族又被劃分為為5個亞族(0sNAC3，ATAF,NAM, AtNAC3, NAP)。
NAC轉錄因子在植物頂端分生組織及花器官分化[Sablowski RWM, et al, Cell,92 (I): 93-103，1998]、側根形成[Mitsuda N, et al, Plant Cell, 17(11) : 2993-3006，2005]、次生壁增厚[Xie Q, et al, Genes Dev, 14 (23): 3024-3036, 2000]等植物特定發育過程以及抵抗生物(Hegedus D, et al, Plant Mol. Biol, 53: 383-397，2003)與非生物脅迫過程(Nogueira FT, et al, Plant Science, 169: 93-106，2005)中均起著重要作用，NAC轉錄因子在植物衰老進程也起著重要的調控作用[Guo YF, Gan S，Plant Journal, 46 (4) :601-612, 2006]。研究表明，NAC轉錄因子在植物的生長發育、器宮建成、激素調節和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發揮著重要作用。相較于MYB類、bZIP類及WRKY類的轉錄因子，NAC轉錄因子的相關研究較少。AtNAP是擬南芥NAC家族中的一種轉錄因子。Guo等[Guo YF, Gan S，PlantJournal, 46(4) : 601-612, 2006]研究發現，AtNAP在調控擬南芥衰老過程中起著重要的\\作用；AtNAP僅在衰老葉片中表達，且AtNAP的表達量與葉片的衰老程度成正相關，變化趨勢與衰老標志基因說似J相一致；擬南芥突變體部無論是在自然生長狀態下還是在黑暗誘導狀態下均出現葉片衰老滯后表型；誘導AtNAP過表達時，轉基因植株出現明顯的提前衰老現象；進一步研究發現水稻、四季豆的NAP皆能異源互補擬南芥突變體atoa/ 的滯綠表型，說明NAP轉錄因子在調控植物衰老中起著重要的作用。此后NAC家族其它成員在衰老過程中的作用不斷被發現。Kim等發現突變體ore7衰老延緩的表型是由基因^⑶似突變造成的，OREl的表達隨衰老進程上調，而在轉錄后水平調控OREl的miR164在衰老過程中受到抑制[Kim JH，et al, Science,322(5917) : 1053-1057, 2009] 'OREl的同源基因ORSl也在衰老過程中發揮著積極作用，ORSl過表達株系衰老提前，而ORSl的表達被抑制后衰老進程也相應的延遲，此外ORSl的表達受 H202 高度誘導[Balazadeh S，et al, Molecular Plant, 4(2): 346-360，2011]；VNI2不但調控木質部導管的形成，而且能夠整合ABA介導的非生物脅迫響應，在衰老過程中發揮著重要作用，VNI2在衰老中發揮負調控作用，突變體衰老加速，而過表達VNI2可以延緩衰老[Yang SD, et al, Plant Cell, 23(6) : 2155-2168，2011];新近發現的另一個H202響應的NAC類轉錄因子JUBl同樣是一個衰老的負調控因子，JUBl可能通過調節胞內H202的水平而調控系統的衰老進程[Wu AH, et al, Plant Cell, 24(8) : 482-506，2012]。

發明內容
本發明的目的是提供一種能夠調控植物葉片衰老的轉錄因子及其應用。本發明提供的能夠調控植物葉片衰老的植物轉錄因子，具體為ANAC072蛋白，來源于擬南芥、油菜等物種，見圖2所示，但不局限于這些物種，包括與擬南芥UrahWoASi1S
)中ANAC072 (NCBI基因登錄號為At4g27410，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)的同源性高于30%的類似蛋白。本發明所提供的擬南芥衰老相關轉錄因子，是具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加具有與SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO: 2衍生的蛋白質。
本發明的擬南芥ANAC072轉錄因子的編碼基因，是下列核苷酸之一 I) SEQ ID NO: I所示的DNA序列。2)編碼SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多核苷酸。序列表中SEQ ID NO :1由973個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第I位至945位堿基；序列表中SEQ ID NO 2由314個氨基酸殘基組成。本發明還涉及所述植物葉片衰老相關轉錄因子ANAC072蛋白的編碼基因的表達載體。本發明還涉及所述擬南芥葉片衰老相關轉錄因子ANAC072的編碼基因的細胞系。含有本發明基因的表達載體和細胞系均屬于本發明的保護范圍。本發明的基因在 調控植物葉片衰老性狀、提高作物產量中可有重要應用。


圖I為擬南芥ANAC072與其它擬南芥NAC家族轉錄因子系統發生樹。圖2為擬南芥ANAC072與其它植物該衰老相關轉錄因子的進化樹分析。圖3為黑暗處理6天后野生型擬南芥和突變體的離體葉片衰老表型。圖4為正常生長34天后Co I-O、anac072~l和anac072-2的第3、4片真葉中ANAC072的表達情況。圖5為正常生長34天的狀態下Col-Q、anac072_l的離體葉片表型。圖6為正常生長40天的狀態下Co\_Q、anac072_l和anac072_2的自然生長狀態的衰老表型。圖7為正常生長40天后CoH、anac072_l和mac072-2的離體葉片衰老表型。
具體實施例方式實施例I :擬南芥轉錄因子ANAC072插入突變體材料的獲得
I.I擬南芥材料準備
取在16h L/8h D光照，23°C條件下培養20天的擬南芥葉片。1.2 RNA 提取
取擬南芥材料約O. lg。液氮充分研磨后，轉移到1.5ml離心管，加Iml TRIzoKinvitrogen公司),混勻后,室溫放置15分鐘,加O. 2ml氯仿:異戍醇(24:1),劇烈搖動15秒后室溫放置5分鐘，13000rpm, 4°C離心15分鐘。取上清液并加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥15分鐘。溶解于適量的經O. 1% DEPC處理過的ddH20水中，貯存于_80°C備用。I. 3 cDNA第一鏈合成和反轉錄PCR
采用上海申能博彩生物技術公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指南將總RNA反轉錄成cDNA。反應體系和反應條件分別為2Pg制備的總RNA，0. 5μ1 Rnaseinhibitor,加 DEPC 處理過的去離子水至 8· 5μ1, 2μ1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C, 5min,室溫放置 IOmin, 13000rpm 簡短離心 5s。再依次加入 4μ1 5 X First-Strand buffer, 0. 5M-1RNase Inhibitor, 2μ1 IOOmM DTT, 2M-1 dNTP, IM-I MMLV Reverse Transcriptase。小心混勻；37°C反轉錄I小時，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離心5秒鐘，存放于_20°C待用。I. 4 anac072~l插入突變體材料的鑒定
根據 TAIR (http://www. arabidopsis. org/)上提供的 ANAC072 全長 CDS 序列及插入位點，設計了三條引物 ANAC072-LB (5，GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3’)、ANAC072-LP (5，AGTGATCGAGTGCTTCAGGAC 3’)和 ANAC072-RP (5，ACTCGTGCATAATCCAGTTGG 3’)作為 PCR 反應的引物。PCR反應體系為50μ1，反應條件為94°C預變性5min，94°C變性40s，55°C復性40s，72°C延伸70s，循環35次，72°C充分延伸5min。將所得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，得到純合突變體材料。1.5插入突變體材料的鑒定
根據 TAIR (http://www. arabidopsis. org/)上提供的 ANAC072 全長 CDS 序列及插入位點，設計了三條引物 ANAC072-LB (5，GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3’)、ANAC072-LP (5，CTGGGCTAACGGATCTTTCTC 3’ )和 ANAC072-RP (5， GCTACATTTGTGAGATAATCTTAATGG 3’ )作為PCR反應的引物。PCR反應體系為50μ1，反應條件為94°C預變性5min，94°C變性40s， 55°C復性40s，72°C延伸70s，循環35次，72°C充分延伸5min。將所得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，得到純合突變體材料。實施例2 :擬南芥轉錄因子ANAC072功能分析
2.I序列比較分析
用Genedoc軟件分析了 ANAC072與其他擬南芥NAC家族蛋白的同源性，結果表明ANAC072具有典型保守的NAC domain,如圖I所示。我們利用軟件建立了 ANAC072同其他擬南芥NAC家族蛋白的系統發生樹，其中ANAC072與ANACO19、ATNAC3的親緣關系最近。而后，我們發現在油菜、大豆、楊樹等植物中存在與ANAC072同源性較高的蛋白，如油菜BnNAC485與擬南芥ANAC072有很高的同源性。圖2展示了植物中ANAC072蛋白的系統進化關系。2. 2.突變體葉片衰老指標分析
2.2. I擬南芥基質培養
基質組分蛭石黑土 珍珠巖9 : 3 : 0. 5 營養液組分
權利要求
1.一種植物葉片衰老相關轉錄因子，其特征在于為ANAC072蛋白，來源于擬南芥或油菜物種，包括與擬南芥中ANAC072蛋白的同源性高于30%的類似蛋白，ANAC072蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.一種擬南芥葉片衰老相關轉錄因子ANAC072的編碼基因，其特征在于是下列核苷酸之一 1)SEQ ID NO: I所示的DNA序列； 2)編碼SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.含有權利要求I所述植物葉片衰老相關轉錄因子ANAC072蛋白的編碼基因的表達載體。
4.含有權利要求2所述擬南芥葉片衰老相關轉錄因子ANAC072的編碼基因的細胞系。
5.如權利要求I所述植物葉片衰老相關轉錄因子ANAC072蛋白在延緩葉片衰老從而提高作物產量的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種調控植物葉片衰老的轉錄因子及其應用。本發明所提供的植物ANAC072蛋白，來源于擬南芥、油菜等物種，但不局限于這些物種，包括與擬南芥中ANAC072蛋白(氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)的同源性高于30%的類似蛋白。擬南芥ANAC072轉錄因子的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQIDNO:1；2)編碼序列表中SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸。本發明涉及的蛋白將在植物延緩葉片衰老從而提高作物產量方面提供基因資源和方法。
文檔編號C07K14/415GK102850446SQ20121036631
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者蒯本科, 高炯, 李收, 梁寧菁 申請人:復旦大學