專利名稱：大鼠初級聽皮層微電極陣列植入固定手術方法
技術領域：
本發明屬于神經電生理學研究領域，具體涉及一種大鼠初級聽覺皮層微電極陣列植入固定手術方法，以滿足在大鼠自由活動狀態下采集其聽皮層神經元活動的需要。
背景技術：
多通道在體記錄技術能夠在動物清醒、自由活動狀態下，記錄大腦局部區域群體神經元活動，是分析群體神經元在網絡水平編碼機制的有力工具，并且廣泛應用于多種動物實驗的多個腦區。而聽覺皮層的多通道在體記錄研究大多在狨猴等大型實驗動物上開展，對于常用實驗動物——大鼠等小型嚙齒類動物，目前只開展了在麻醉狀態下和被動聽狀態下(unanesthetized passively listening)群體神經元活動的研究,其中“被動聽狀態”指的是動物處于清醒狀態，但被訓練坐在固定裝置中被動接收聽刺激，而不是自由活動的behaving狀態。而在研究高級中樞對聽感覺信息的認知編碼時，常需要考察中樞相關腦·區對聲刺激反應的動態變化，在這個意義上，動物behaving狀態下感覺相關皮層群體神經元活動的研究對詳細了解中樞感覺認知機制非常重要，而目前尚未見behaving狀態下大鼠聽皮層群體神經元活動的報道。原因在于大鼠等小型實驗動物初級聽皮層位于大腦顳偵L如果將植入微電極陣列直接固定在聽皮層外的顳側顱骨上，固定后的電極裝置將會造成動物頭部正常平衡狀態的變化，這將影響動物的自由活動。因此，behaving狀態下大鼠聽皮層植入、穩固攜帶微電極陣列是開展多通道在體記錄研究的技術難題。在體記錄群體神經元活動的微電極陣列一般分為電極絲部分和電極連接器(connector，用來實現與記錄儀器系統的對接)兩部分。目前，新型微電極陣列上出現了電極絲著陸裝置(landing),它與電極絲緊密封接,在動物頭部固定電極時可先在landing周圍封裝牙科水泥，待第一次封裝的牙科水泥完全凝固后，再在電極connector封裝牙科水泥進行固定，這種方法可緩沖并減少connector插拔記錄儀器系統前放(headstage)時對電極絲的震動，穩固電極絲。針對behaving狀態下大鼠聽皮層植入、穩固攜帶微電極陣列的技術難題，本發明對大鼠聽皮層適用的微電極陣列進行了設計改造，再采用把微電極陣列的電極絲與電極connector雙重異位固定的方法進行聽皮層微電極陣列的植入固定，即將電極絲經電極landing固定在聽皮層顳骨處,彎折電極絲陣列后把電極connector固定在頂骨上。該植入方法涉及小型實驗動物聽皮層適用的微電極陣列的設計、聽皮層微電極陣列的固定方法等技術環節。

發明內容
本發明的目的是針對常用實驗動物——大鼠等小型嚙齒類動物，在自由活動狀態下記錄其聽皮層群體神經元活動存在的微電極陣列植入固定技術難題，提出一種大鼠初級聽皮層微電極陣列植入固定的手術方法。本發明提出的大鼠初級聽皮層微電極陣列植入固定的手術方法，是通過把微電極陣列的電極絲部分與電極連接器部分雙重異位固定，即將電極絲經電極著陸裝置固定在聽皮層顳骨處，然后彎折電極絲把電極連接器固定在頂骨上，完成聽皮層微電極陣列的植入固定。該植入方法涉及小型實驗動物聽皮層適用的微電極陣列的設計、聽皮層微電極陣列的植入固定方法等技術環節。本發明方法具體是
通過把電極絲陣列與電極connector進行雙重異位固定，即第一次固定將電極絲陣列經電極landing固定在聽皮層顳骨處,第二次固定將電極絲陣列彎折后把電極connector固定在頂骨上。具體步驟如下
I)大鼠腦外科手術選取適當的大鼠，麻醉后使用立體定位儀固定，通過腦外科手術在大鼠頭頂部前后縱向切開頭頂部頭皮，切口 lcm，在切口后角垂直向左顳側剪開頭皮lcm，沿頂骨隆起和顳骨后緣鈍性分離顳肌，結扎顳側頭皮、顳肌，暴露頂骨和左側顳骨；使用1%雙氧水清除頂部顱骨和顳骨外結締組織，為后續使用牙科水泥固定電極準備骨表面。2)旋入固定螺絲共旋入六顆固定螺絲，其中在顳骨待開腦區的前后兩側各鉆入·一顆固定螺絲，頂骨鉆入四顆固定螺絲，結合后續牙科水泥包埋電極陣列增加植入的穩固度。3)在初級聽皮層植入微電極陣列根據大鼠腦圖譜，使用微型牙科鉆開顱暴露聽皮層，除去硬腦膜，在微推進器推動下把微電極陣列插入聽皮層。4)微電極陣列植入后的第一次固定微電極陣列植入后先滴加瓊脂溶液覆蓋聽皮層表面，再分別使用醫用膠(主要成分是α-氰基丙烯酸正丁酯)和較稀的牙科水泥(見圖2, dental acrylic layer I )把電極landing和周圍顳骨緊密固定在一起,完成微電極陣列植入后的第一次固定。5)微電極陣列植入后的第二次固定待第一次固定的牙科水泥完全凝固后，滴加生理鹽水溶去電極絲陣列外包的水溶性蠟,彎折電極陣列，使電極connector置于動物顱頂，然后使用較粘稠的牙科水泥，把聽皮層電極connector固定在動物頡頂,完成微電極陣列植入后的第二次固定。6)術中術后護理術中注意保持動物體溫和麻醉穩定，術后對傷口進行消毒并縫合，給予肌注青霉素注射液。其中的小型實驗動物聽皮層適用的微電極陣列的設計如下
I)不設電極驅動裝置，通過微推進器可測量到電極植入深度，并可減輕電極裝置的重量，便于動物頭部的活動。2)在電極陣列前端增加電極絲著陸裝置landing, landing距離電極connector約10 mm左右。3)選擇剛性較小的、柔軟的鎳鉻絲作為電極材料，外包以可溶性蠟增加電極陣列硬度。根據上述實驗步驟，對成年大鼠初級聽皮層進行微電極陣列植入并固定，實際試驗結果證明，電極絲-電極connector雙重異位固定的方法能夠使微電極陣列長期穩固地在大鼠聽皮層記錄信號，滿足在動物自由活動狀態下采集其聽皮層群體神經元信號的要求，從而說明本發明設計的聽皮層微電極陣列和使用的手術方法是可行的。本發明設計實現了在自由活動的大鼠上進行聽皮層群體神經元的信號采集，拓展了多通道在體記錄技術在聽覺認知研究中的應用，具有方便易行、采集信號可靠及降低相關研究實驗動物成本的優點。


圖I是小型實驗動物聽皮層適用微電極陣列設計示意 圖2是微電極陣列植入固定方法示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進一步描述。如圖I所示，動物手術前先制作大鼠聽皮層適用的微電極陣列，按照常規制作微電極陣列的方法進行，其中的特殊設計如下
I)不設電極驅動裝置這種設計可減輕電極裝置的重量，便于動物頭部的活動；此外，·通過電極微推進器植入電極，可測量到植入深度，同時在植入過程中檢測聽皮層神經元的反應以提示電極是否接觸到聽反應神經元。2)在電極陣列前端增加電極絲著陸裝置landing :以往常見的微電極陣列上的landing著陸裝置位于電極絲中部,僅起到緩沖并減少電極connector插拔headstage時對電極絲的震動，穩固電極絲的作用。本發明中使用的聽皮層微電極陣列landing裝置，位于電極尖端約3 mm處，landing距離電極connector約10 mm左右,滿足電極絲陣列從聽皮層彎折至頂骨的長度要求。根據大鼠聽皮層的特殊在體位置，這種landing的位置設計除了起到穩固電極絲的目的，也是本發明手術方法中通過進行電極絲-connector異位雙重固定實現微電極陣列在聽皮層植入固定的必備結構。3)選擇剛性較小的、柔軟的鎳鉻絲作為電極材料，易于后續手術操作從聽皮層處彎折電極絲陣列至頂骨；外包以可溶性蠟增加電極陣列硬度，以方便電極陣列穿過軟腦膜。圖I中該微電極陣列分為電極接口 I (microelectrode array connector)和電極絲陣列2 (microelectrode array)兩部分,其中在距電極絲尖端3 mm (L2)處設置電極著陸裝置3 (microelectrode array landing),電極絲landing距離電極接口下邊10 mm(LI),電極絲陣列總長度(L1+L2) 13 mm。大鼠聽皮層微電極陣列的植入固定
選擇成年SD大鼠，雌雄不限，購自浙江省醫學科學院動物中心。動物購回后，隨機分籠飼養。飼養期間保持安靜舒適的環境，讓其自由飲水和進食。手術前進行聽覺檢測，聽反應正常者進行聽皮層微電極陣列植入手術。使用大鼠聽皮層適用的微電極陣列，按下述依次的步驟進行麻醉、腦外科手術暴露初級聽皮層、植入微電極陣列后進行電極絲-電極connector雙重異位固定,其具體步驟過程為
I)大鼠腦外科手術大鼠稱重后，經腹腔注射戍巴比妥鈉(sodium pentobarbital, 40mg/kg體重)麻醉,之后給予皮下注射阿托品(atropine sulfate, 0. 07mg/kg體重)防止氣管、支氣管產生分泌物。使用45°耳桿立體定位儀固定大鼠，剪去大鼠頭頂部被毛和左顳側被毛，前后縱向切開頭頂部頭皮，切口 lcm,暴露頂部盧頁骨；在頂部切口后角垂直向左顳側剪開頭皮lcm，沿頂骨隆起和顳骨后緣鈍性分離顳肌，結扎顳側頭皮、顳肌，牽拉結扎線擴張顳側手術野，暴露聽皮層外側顳骨；使用1%雙氧水清除頂部顱骨和顳骨外結締組織，為后續使用牙科水泥固定電極準備骨表面。
2)旋入固定螺絲首先根據大鼠腦圖譜，立體定位初級聽皮層，并用鉛筆標記出聽皮層的位置。使用微型牙科鉆和直徑O. 5 mm圓柱形鉆頭分別在待開腦區的前后兩側分別鉆一個小孔，用于旋入固定螺絲；再在暴露的頂骨四周均勻分布鉆五個小孔，其中周圍四個小孔用于上固定螺絲，共計旋入六顆固定螺絲，結合后續牙科水泥包埋固定螺絲，可以增加電極植入的穩固度。此外，頂骨上靠近聽皮層待開腦區的一個小孔用于插入參考電極。3)在初級聽皮層植入微電極陣列根據立體定位標記點，在聽皮層外側顳骨用微型牙科鉆輕輕鉆開一個小孔(直徑約2. 5 mm),除去硬腦膜，用生理鹽水清理干凈腦表面后，在微推進器推動下把準備好的8道電極陣列的8根電極小心插入聽皮層并在體記錄神經元反應，根據微推進器的植入深度和聽皮層神經元的放電特點判斷電極尖端是否到達聽皮層，至聽皮層第IV層時停止推進。4)微電極陣列植入后的第一次固定用20 μ I移液槍取瓊脂溶液(濃度2%)覆蓋在聽皮層表面，待瓊脂凝固后形成一層凝膠膜，以保護皮層的生理狀態，然后用醫用膠(主要成分是α-氰基丙烯酸正丁酯)涂在電極landing和顳骨上，待醫用膠干燥后再調制濃度較稀的牙科水泥(dental acrylic layer I ),用20 μ I移液槍取牙科水泥液滴在電極絲·landing及周圍頡骨,把電極絲landing與周圍頡骨緊密固定在一起,完成微電極陣列植入后的第一次固定。5)微電極陣列植入后的第二次固定待第一次固定的牙科水泥完全凝固后，滴加生理鹽水溶去可溶性蠟。彎折電極陣列，使電極connector置于動物顱頂，然后調制較粘稠的牙科水泥(dental acrylic layer II ),把聽皮層電極connector固定在動物頡頂,完成微電極陣列植入后的第二次固定。6)術中術后護理最后對傷口進行消毒并縫合，給予肌注青霉素注射液。術中注意保持動物體溫和麻醉穩定。7)記錄電極負載時間，并在不同時間點(植入手術時在線采集、術后3天、術后I周、術后兩2周、術后I月、術后2月)使用Plexon多通道神經信號分析處理系統(Multichannel Acquisition Processor System, MAP System)進行在體信號米集。檢查本發明手術方法的穩定性和信號采集的可靠性。8)術后兩月處死動物并進行福爾馬林灌流，腦冰凍切片顯示微電極陣列的在體位
置是否正常。圖2中，微電極陣列11在大鼠初級聽皮層植入后經電極著陸裝置9在聽皮層顳骨處使用牙科水泥7進行第一次固定后，彎折電極絲陣列至頂骨，使用牙科水泥6經電極接口5進行第二次固定。其中，10為封閉聽皮層表面的瓊脂凝膠膜，12為大鼠顱骨。電極植入固定后通過信號線4可接入多通道神經信號分析處理系統8 (Multichannel AcquisitionProcessor System, MAP System)進行在體信號米集。
權利要求
1.大鼠初級聽皮層微電極陣列植入固定手術方法，其特征在于該方法包括以下步驟 通過把電極絲陣列與電極connector進行雙重異位固定，即第一次固定將電極絲陣列經電極landing固定在聽皮層顳骨處,第二次固定將電極絲陣列彎折后把電極connector固定在頂骨上，具體步驟如下 步驟(I)大鼠腦外科手術選取適當的大鼠，麻醉后使用立體定位儀固定，通過腦外科手術在大鼠頭頂部前后縱向切開頭頂部頭皮，切口 1cm，在切口后角垂直向左顳側剪開頭皮lcm，沿頂骨隆起和顳骨后緣鈍性分離顳肌，結扎顳側頭皮、顳肌，暴露頂骨和左側顳骨；使用1%雙氧水清除頂部顱骨和顳骨外結締組織，為后續使用牙科水泥固定電極準備骨表面；步驟(2)旋入固定螺絲共旋入六顆固定螺絲，其中在顳骨待開腦區的前后兩側各鉆入一顆固定螺絲，頂骨鉆入四顆固定螺絲，結合后續牙科水泥包埋電極陣列增加植入的穩固度； 步驟(3)在初級聽皮層植入微電極陣列根據大鼠腦圖譜，使用微型牙科鉆開顱暴露聽皮層，除去硬腦膜，在微推進器推動下把微電極陣列插入聽皮層； 步驟(4)微電極陣列植入后的第一次固定微電極陣列植入后先滴加瓊脂溶液覆蓋聽皮層表面，再分別使用醫用膠和較稀的牙科水泥把電極landing和周圍顳骨緊密固定在一起，完成微電極陣列植入后的第一次固定； 步驟(5)微電極陣列植入后的第二次固定待第一次固定的牙科水泥完全凝固后，滴加生理鹽水溶去電極絲陣列外包的水溶性蠟,彎折電極陣列，使電極connector置于動物盧頁頂，然后使用較粘稠的牙科水泥，把聽皮層電極connector固定在動物頡頂,完成微電極陣列植入后的第二次固定； 步驟(6)術中術后護理術中注意保持動物體溫和麻醉穩定，術后對傷口進行消毒并縫合，給予肌注青霉素注射液。
2.根據權利要求I所述的大鼠初級聽皮層微電極陣列植入固定手術方法，其特征在于 微電極陣列的具體設計方案如下 步驟A.不設電極驅動裝置，通過微推進器可測量到電極植入深度，并可減輕電極裝置的重量，便于動物頭部的活動； 步驟B.在電極陣列前端增加電極絲著陸裝置landing, landing距離電極connector約10 mm左右； 步驟C.選擇剛性較小的、柔軟的鎳鉻絲作為電極材料，外包以可溶性蠟增加電極陣列硬度。
全文摘要
本發明屬于神經電生理學研究領域，具體涉及一種用于聽覺認知研究的大鼠初級聽皮層微電極陣列植入固定的手術方法。本發明通過把微電極陣列的電極絲部分與電極連接器部分雙重異位固定，即將電極絲經電極著陸裝置固定在聽皮層顳骨處，然后彎折電極絲把電極連接器固定在頂骨上，完成聽皮層微電極陣列的植入固定。本發明操作簡單、電極攜帶穩固、信號采集可靠性高，滿足了在大鼠自由活動狀態下進行聽覺認知研究的需要，降低了相關研究的實驗動物成本。
文檔編號A61D1/00GK102784010SQ20121029172
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者孫心德, 徐瑩, 楊勇, 楊文偉, 范影樂 申請人:杭州電子科技大學