專利名稱：小麥未減數配子基因的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于小麥分子標記輔助育種領域，具體涉及一種小麥未減數配子基因的分子標記，以及該小麥未減數配子基因的分子標記在培育小麥品種中的應用。
背景技術：
許多重要的栽培作物是異源多倍體，例如普通小麥、油菜、棉花、咖啡、煙草等。異源多倍體的形成需經歷兩個關鍵步驟遠緣雜交(形成單倍體)和加倍(形成雙二倍體)。加倍過程主要受未減數配子(unreduced gametes,簡稱UG)基因控制。遠緣雜種產生的未減數配子在染色體組自然加倍過程中起了重要作用，因此，未減數配子在多倍體物種起源過程中發揮了重要作用。同時，未減數配子在創制加倍單倍體(Doubled Haploid,DH)和新雙二倍體(amphi (di)ploid)的遺傳育種方面有重要應用價值。未減數配子能夠讓單倍體自動加倍，從而克服了用秋水仙堿溶液等藥品進行人工加倍存在的處理程序繁瑣、成功率 低、污染環境且導致加倍植株不正常等一些不利于大規模批量生產加倍單倍體的缺點。因而，通過未減數配子實現染色體自動加倍可克服“染色體人工加倍存在的技術瓶頸”，從而大大加快單倍體在小麥遺傳育種中的應用步伐。普通小麥(Triticum aestivum L.，染色體組為AABBDD，2n = 42)是典型的異源六倍體物種，它由四倍體小麥(T. turgidum, AABB,2n = 28)與節節麥(有的稱粗山羊草，Aegilops tauschii Cosson 或 T. tauschii (Cosson) Schmalh,DD, 2n = 14)天然雜交，然后通過染色體自動加倍形成的。一些四倍體小麥與節節麥雜交，其單倍體雜種F1 (染色體組為ABD，與普通小麥產生的單倍體染色體組一樣)不經秋水仙素等人工加倍處理仍然有很好的育性，能夠自交結實，這些結實的種子具有與正常普通小麥一樣的AABK)D染色體組，表明單倍體雜種F1的染色體發生了自動加倍(Zhang LQ等,J Genet Genomics. 2008. 35,617-623。Zhang LQ等，Euphytica. 2010. 172，285-294)。染色體自然加倍的細胞學機理是花粉母細胞發生了“類似有絲分裂的減數分裂”(類有絲分裂)，實質上只發生了單次分裂，產生了未減數的配子(unreduced gametes),這樣的雌雄配子結合實現了染色體自動加倍。類有絲分裂包括第一次分裂核再組(first-division restitution,簡稱為FDR)和單次減數分裂(single-division meiosis,簡稱 SDM)兩種途徑(Bretagnolle 等.NewPhytologist. 1995. 129. 1-22)。未減數配子不僅在小麥起源過程中起了重要作用，而且在通過雙二倍體為“橋梁”的外源基因轉移和加倍單倍體遺傳育種等方面有非常大的應用價值。小麥未減數配子的產生受四倍體小麥(T. turgidum)的主效基因控制，而且不同四倍體小麥存在遺傳變異(Zhang LQ 等· Euphytica. 2010. 172,285-294)。用四倍體小麥 Langdon 的 14 個 D 染色體組代換系為材料定位該主效基因，但由于Langdon的2A，4A，5A，3B，5B，6B等染色體上分別有控制育性、染色體聯會及染色體配對等基因，相應的D染色體代換并不能完全補償相應基因的缺失作用，因此利用細胞學方法不能最終確定該主效基因到底在哪條染色體上(Xu等.Plant Breeding. 2000. 119, 233-241aZhang等·J Genet Genomics. 2008. 35,617-623)。在小麥育種中，從雜交到獲得穩定的品系一般需要多個世代。如果能利用單倍體育種，可大大縮短育種年限，加快育種進程，提高育種效率。目前，已經有產生小麥單倍體的比較成熟和可靠的方法，如小麥-玉米雜交法。二是對獲得的單倍體進行染色體加倍。目前常見的方法是用秋水仙堿等藥品進行人工加倍。但是，這種人工染色體加倍方法存在處理程序繁瑣，工作量大；處理條件不易控制，成功率低；藥品對植株有毒害作用，造成植株弱小、發育不良、誘導遺傳變異、甚至死亡；秋水仙堿等藥品對人畜有毒，容易造成環境污染等問題。因此，人工染色體加倍方法不適于大規模的批量生產加倍單倍體，從而限制了單倍體在育種中的實際應用效果。如果普通小麥單倍體本身具有高效的染色體自動加倍功能，就可以大規模利用小麥單倍體育種了。四倍體小麥品系Langdon具有一個強效的未減數配子基因(Xu 等.Plant Breeding, 2000,119 :233_241 ； Zhang et al. , Euphytica, 2010,172 285-294)。如果將這樣的強效未減數配子基因轉入普通小麥，就可實現普通小麥單倍體的染色體自動高效加倍，從而大大縮短育種年限，提高單倍體育種效率。但是，由于該基因無 法直接通過植株的形態學特征進行選擇，因此轉移工作十分困難。發明專利《一種產生未減數配子的小麥基因型的簡便篩選方法》(專利號為ZL200710048217.x)公開了一種利用遠緣雜種F1自交結實率來選擇未減數配子基因的方法。但是，該方法涉及遠緣雜交，存在程序繁瑣，工作量大，效率低等問題。分子標記輔助選擇，不依賴于表現型選擇，即不受環境條件、基因間互作、基因型與環境互作等多種因素的影響，而是直接對基因型進行選擇，因而能大大提高育種效率。簡單重復序列(simple sequence repeats,簡稱SSR)是一類廣泛存在于基因組上的由I到6個核苷酸組成的串聯重復序列。由于其在基因組上大量的分布，多態性高，且操作技術簡單、費用低廉，在分子標記輔助育種中已被廣泛應用。如果能夠篩選出與未減數配子基因相連鎖的分子標記，利用分子標記對小麥未減數配子基因進行選擇，就能大大提高小麥未減數配子基因的選擇效率，從而提高小麥加倍單倍體的育種效率。經檢索，未發現有關小麥未減數配子基因的分子標記的報道。

發明內容
本發明目的在于提供一種小麥未減數配子基因UGl的分子標記。本發明另一目的在于提供上述小麥未減數配子基因UGl的分子標記在小麥育種中的應用。本發明第三目的在于提供用于獲得上述小麥未減數配子基因UGl的分子標記的引物對。本發明第四目的在于提供上述小麥未減數配子基因UGl的檢測試劑盒。本發明第五目的在于提供利用上述小麥未減數配子基因UGl的分子標記培育含有未減數配子基因UGl的小麥品種的方法。本發明一種小麥未減數配子基因UGl的分子標記，該分子標記的名稱為Xgpw1146，用于擴增該分子標記的引物為正向引物5’ -CCACCTCCGTCTTCGAGTAG-3 ’，反向引物5’ -GGGAAGGAGAGATGGGAAAC-3 ’。
上述分子標記，是以四倍體小麥(T. turgidum) Langdon的基因組DNA為底物進行PCR擴增所得的擴增片段。本發明所述的小麥未減數配子基因UGl是指小麥未減數配子基因的一個主效基因，命名為 UGl (unreduced gametes), UGl 來源于四倍體小麥(Τ. turgidum) Langdon 的 3B染色體。上述小麥未減數配子基因UGl的分子標記在小麥育種中的應用。用于獲得上述小麥未減數配子基因UGl的分子標記的引物對，由下述核苷酸序列組成正向引物5’ -CCACCTCCGTCTTCGAGTAG-3 ’，反向引物5 ’ -GGGAAGGAGAGATGGGAAAC-3，。 一種小麥未減數配子基因UGl的檢測試劑盒，含有上述用于獲得小麥未減數配子基因UGl的分子標記的引物對；所述的引物對由下述核苷酸序列組成正向引物5’ -CCACCTCCGTCTTCGAGTAG-3 ’，反向引物5’ -GGGAAGGAGAGATGGGAAAC-3，。利用上述小麥未減數配子基因UGl的分子標記培育小麥品種的方法，包括將含有未減數配子基因UGl的四倍體小麥或人工合成的六倍體小麥和普通小麥雜交，通過不斷回交或/和自交，獲得分離世代；種植分離世代，在苗期檢測分子標記Xgp 1146的基因型，選擇具有該分子標記的植株，直至獲得遺傳穩定的小麥品系。利用上述小麥未減數配子基因UGl的分子標記培育小麥品種的方法，具體步驟如下(I)以含有未減數配子基因UGl的四倍體小麥或人工合成六倍體小麥和普通小麥品種雜交，通過不斷回交或/和自交，獲得分離世代。(2)種植分離世代，在苗期，以分離世代植株的基因組DNA為底物，以下述核苷酸序列為引物進行PCR擴增；所述的引物為正向引物5’ -CCACCTCCGTCTTCGAGTAG-3 ’，反向引物5’-GGGAAGGAGAGATGGGAAAC-3’ ；同時，以四倍體小麥(T. turgidum) Langdon的基因組DNA為底物進行PCR擴增所得產物作為對比，選擇與以四倍體小麥(T. turgidum)Langdon的DNA為底物擴增而得的該分子標記相同片段的植株，收獲所選植株上結實的種子，直至獲得染色體自動加倍的純合穩定的小麥品系。上述方法步驟(I)中所述的普通小麥是指任何農藝性狀優良的品系或品種。上述方法步驟(I)中所述的含有未減數配子基因UGl的四倍體小麥是指Langdon或其衍生系。上述方法步驟⑴中所述的人工合成六倍體小麥是指以四倍體小麥Langdon(AABB)為母本和二倍體節節麥(DD)雜交，其雜種F1 (ABD)在未減數配子基因UGl的幫助下自交，染色體自動加倍形成的人工合成的帶有未減數配子基因UGl的六倍體小麥(AABBDD)。本發明小麥未減數配子基因UGl的分子標記，其篩選過程如下(I)、以具有強效未減數配子基因的四倍體小麥(T. turgidum. AABB) Langdon為母本，以具有弱效未減數配子基因的四倍體小麥(τ· turgidum. AABB)AS313為父本雜交，得雜種(AABB)F1 ；以所得雜種F1為母本，以二倍體節節麥(Triticum tauschii. DD)AS60為父本進行遠緣雜交，獲得113個單倍體F1雜種(ABD) (AS313/Langdon//AS60);這些單倍體F1雜種植株通過未減數配子基因的作用進行染色體自動加倍，產生了 113個加倍單倍體(DH)(AABBDD)株系構成的遺傳群體。由于這113個DH系是由113個單倍體植株加倍獲得的，因此,每個DH系與對應的單倍體植株的SSR分子標記是相同的。因此,這113個單倍體植株的分子標記分別由相應的DH系代表。(2)、單倍體植株染色體自動加倍能力的鑒定通常情況下，具有ABD染色體組成的單倍體植株由于減數分裂導致配子的染色體組成不完整，配子缺乏活力，通常不結實。但是，四倍體小麥Langdon具有強效未減數配子基因，而四倍體小麥AS313具有弱效未減數配子基因。因此，具有ABD染色體組成的單倍體F1雜種(雜交組合AS313/Langdon//AS60)通過‘類有絲分裂’產生未減數雌雄配子，這樣 的配子有活力，未減數的雌雄配子結合，形成了染色體自動加倍的具有AABBDD基因組的種子。由于Langdon和AS313產生未減數雌雄配子的能力不同，這113個單倍體F1雜種(雜交組合AS313/Langdon//AS60)的結實率不同。調查這113個單倍體F1雜種的染色體自動加倍種子的結實率。自交結實率是未減數雌雄配子的能力或染色體自動加倍能力的可靠指標(Dewitte et al. ,2012. Use of 2nGametes in Plant Breeding. Plant Breeding,ISBN 978-953-307-932-5 ；D0I 10. 5772/29827 ;page59_86)。調查這 113 個單倍體 F1 雜種經染色體自動加倍形成種子的自交結實率。自交結實率高于28 %歸為Langdon類(高)，低于28%的歸為AS313(低)。(3)、SSR 分析(a) DNA 提取用 CTAB 法提取親本 Langdon、AS313、AS60 和 DH 群體植株 DNA。(b)親本之間多態性分子標記的篩選選取GrainGenes (http://wheat, pw. usda.gov/cgi-bin/graingenes)上公布的覆蓋四倍體小麥A和B基因組的539對SSR引物為引物，以親本Langdon、AS313、AS60的DNA為模板，進行PCR擴增，共獲得78個多態性SSR分子標記；(c) DH群體的SSR分析以步驟(2)獲得的78個標記為引物，以Langdon、AS313和AS60三個親本為對照，按照步驟(2)的方法對113個DH株系進行基因型鑒定，獲得分子標記數據。AS313親本帶型記為A, Langdon親本帶型記為B。DH群體株系帶型來源于AS313的記為A,來源于Langdon的記為B。(d)連鎖圖譜的構建根據78個引物的分子標記數據,利用QTLIciMapping v3. I軟件處理構建遺傳圖譜。以LOD > 5, CM = 25分組，使用RECORD程序計算各個連鎖群中標記之間的遺傳距離，然后用SARF程序微調各個標記之間的遺傳距離。將得到的連鎖群在EXCEL中可視化檢測,把單位點雙交換位點設為缺失后重復計算至沒有單位點雙交換位點為止。以LOD > 4. 5，CM = 35把之前沒有連鎖到連鎖群的中標記(數據沒有進行修正)錨定到之前形成的連鎖群中，重復之前所有的計算。連鎖群之間遺傳距離小于50cM的連鎖群被整合為一個連鎖群。利用QTL IciMapping v3. I的完備區間作圖方法(Inclusivecomposite interval mapping)模型，以單倍體雜種F1自交結實率為染色體自動加倍能力表型性狀數據進行分析，計算未減數配子基因的位置和分子標記之間的遺傳距離，確定了與Langdon染色體未減數配子基因緊密連鎖的分子標記(標記為Xgpwl 146)。通過分析，檢測到一個貢獻率達25 %的未減數配子基因位點(圖I)，將該未減數配子基因位點命名為UGl，該分子標記與未減數配子基因位點UGl的遺傳距離為O. 88cM。與現有技術相比，本發明的優點和有益效果本發明提供了與Langdon未減數配子基因UGl連鎖緊密的分子標記，其遺傳距離僅為O. 88cM，該分子標記可用于對未減數配子基因UGl進行分子標記輔助選擇，大大提高了未減數配子基因的選擇效率，促進加倍單倍體育種效率；本發明克服了傳統方法進行未減數配子基因選擇時存在的程序繁瑣，工作量大，效率低下等問題。


圖I.未減數配子基因UGl與本發明分子標記之間的連鎖圖譜。
圖2. AS2255/Langdon//AS60單倍體(ABD)植株分子標記Xgwml 146檢測的電泳圖譜；其中I 13為AS2255/Langdon//AS60部分單倍體(ABD)植株；14為四倍體小麥AS2255 ；15為四倍體小麥Langdon ；16為節節麥AS60。
具體實施例方式下面以具體實施例對本發明做進一步的說明，但是不對本發明保護范圍構成任何限制。下面實施例中所用的方法，如無特殊說明，均為本領域技術人員熟悉的常規方法。實施例I :本發明分子標記在選擇未減數配子基因UGl上的應用試驗(I)以具有強效未減數配子基因的四倍體小麥(T. turgidum)Langdon和具有弱效未減數配子基因的四倍體小麥(T. turgidum)AS2255為親本雜交，獲得雜種F1，再將雜種F1與二倍體節節麥(Triticum tauschii) AS60進行遠緣雜交，獲得的13個染色體組為ABD的單倍體 F1 雜種(組合為 AS2255/Langdon//AS60. ABD)。(2)對所獲得的13個染色體組為ABD的單倍體F1雜種進行Xgpwl 146標記檢測，具體方法為在苗期提取13個染色體組為ABD的單倍體F1雜種的基因組DNA ；以基因組DNA為底物，以引物標記為Xgpwll46的引物對為引物進行PCR擴增，所述引物為正向引物5 ’ -CCACCTCCGTCTTCGAGTAG-3 ’，反向引物5’ -GGGAAGGAGAGATGGGAAAC-3，。PCR 的反應體系為按照 50ng/ul 小麥基因組 DNAO. 8ul，IOx buffer2. Oul，
I.5mMol/l MgCl2L 2ul,0. 2mMol/L dNTPO. 8ul，200nMol/L 引物各 I. 6ul，1U/L Taq DNA 聚合酶0. 16ul，加水至總體系為20ul ；PCR的反應條件為95°C 5min ；94°C 30s, 55-60°C 30s，72 °C lmin，35個循環；72°C 7min。將所得的PCR擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr Bis = 19 I)電泳檢測，電極緩沖液為ΙχΤΒΕ，恒定功率80W，電壓2000伏。凝膠染色采用硝酸銀染色。電泳結果(見圖2)發現其中8個品系具有Langdon的Xgpwll46等位位點，預測這8個品系的單倍體F1植株經染色體自動加倍導致的種子自交結實率高；而5個品系具有AS2255的Xgpwl 146等位位點，預測這5個品系的單倍體F1植株經染色體自動加倍導致的種子結實率低。(3)所得的13個染色體組為ABD的單倍體F1雜種套袋自交，經染色體自動加倍得到的遺傳穩定的13個具有染色體組為AABBDD的小麥品系(品系名稱見表I)。對經染色體自動加倍得到的遺傳穩定的13個具有AABBDD的小麥品系的結實率進行統計，自交結實率(%)=自交結實種子數/總的小穗數X 100。結果(見表I)具有Langdon的Xgpwl 146等位位點的植株的單倍體F1雜種植株的自交結實率(50. O 56. 7% )顯著高于具有AS2255的Xgpwl 146等位位點的植株的單倍體F1雜種植株的自交結實率(3. I 10.0% );實際結果與預期結果一致，說明可用本發明分子標記(引物標記為Xgpwl 146)可以用于選擇未減數配子基因UG1。表I用四倍體小麥Langdon未減數配子基因UGl的分子標記預測衍生后代的染色
體自動加倍能力對比結果表

權利要求
1.一種小麥未減數配子基因UGl的分子標記，其特征在于用于擴增該分子標記的引物為正向引物5 ’ -CCACCTCCGTCTTCGAGTAG-3 ’， 反向引物5 ’ -GGGAAGGAGAGATGGGAAAC-3，。
2.按照權利要求I所述的分子標記，其特征在于該分子標記與以四倍體小麥(T. turgidum) Langdon的基因組DNA為底物進行PCR擴增所得的擴增片段相同。
3.權利要求I所述的小麥未減數配子基因UGl的分子標記在小麥育種中的應用。
4.用于獲得權利要求I所述的小麥未減數配子基因UGl的分子標記的引物對，其特征在于所述的引物對由下述核苷酸序列組成正向引物5’ -CCACCTCCGTCTTCGAGTAG-3’， 反向引物5’ -GGGAAGGAGAGATGGGAAAC-3’。
5.一種小麥未減數配子基因UGl的檢測試劑盒，其特征在于含有權利要求4所述的用于獲得小麥未減數配子基因UGl的分子標記的引物對。
6.利用權利要求I所述的小麥未減數配子基因UGl的分子標記培育小麥品種的方法，其特征在于包括將含有未減數配子基因UGl的四倍體小麥或人工合成的六倍體小麥和普通小麥雜交，通過不斷回交或/和自交，獲得分離世代；種植分離世代，在苗期檢測分子標記Xgpwll46的基因型，選擇具有該分子標記的植株，直至獲得遺傳穩定的小麥品系。
7.按照權利要求6所述的培育小麥品種的方法，其特征在于其具體步驟如下 (1)以含有未減數配子基因UGl的四倍體小麥或人工合成六倍體小麥和普通小麥品種雜交，通過不斷回交或/和自交，獲得分離世代； (2)種植分離世代，在苗期，以分離世代植株的基因組DNA為底物，以下述核苷酸序列為引物進行PCR擴增；所述的引物為 正向引物5’ -CCACCTCCGTCTTCGAGTAG-3’， 反向引物5’ -GGGAAGGAGAGATGGGAAAC-3’ ； 同時，以四倍體小麥(T. turgidum) Langdon的基因組DNA為底物進行PCR擴增所得產物作為對比，選擇與以四倍體小麥(T. turgidum)Langdon的DNA為底物擴增而得的該分子標記相同片段的植株，收獲所選植株上結實的種子，獲得染色體自動加倍的純合穩定的小麥品系。
8.按照權利要求7所述的培育小麥品種的方法，其特征在于其步驟(I)中所述的普通小麥是指任何農藝性狀優良的品系或品種。
9.按照權利要求7所述的培育小麥品種的方法，其特征在于其步驟(I)中所述的含有未減數配子基因UGl的四倍體小麥是指Langdon或其衍生系。
10.按照權利要求7所述的培育小麥品種的方法，其特征在于其步驟(I)中所述的人工合成六倍體小麥是指以四倍體小麥Langdon為母本和二倍體節節麥雜交，其雜種Fl在未減數配子基因UGl的幫助下自交，染色體自動加倍形成的人工合成的帶有未減數配子基因UGl的六倍體小麥。
全文摘要
本發明公開了屬于小麥分子育種領域的一種小麥未減數配子基因UG1的分子標記，該分子標記為Xgpw1146，該分子標記與小麥未減數配子基因UG1的遺傳距離為0.88cM。本發明還公開了該分子標記在小麥育種中的應用和用于培育小麥品種的方法。本發明提供的分子標記與未減數配子基因UG1連鎖緊密，可用于對未減數配子基因UG1進行分子標記輔助選擇，大大提高未減數配子基因UG1的選擇效率，促進加倍單倍體育種效率；本發明克服了傳統方法進行未減數配子基因選擇時存在的程序繁瑣，工作量大，效率低下等問題。
文檔編號A01H1/02GK102925433SQ20121029361
公開日2013年2月13日 申請日期2012年8月17日 優先權日2012年8月17日
發明者劉登才, 張連全, 郝明, 羅江陶, 鄭有良, 袁中偉, 顏澤洪, 代壽芬 申請人:四川農業大學