專利名稱：一種克服劍麻不定芽玻璃化的方法
技術領域：
本發明涉及一種克服劍麻不定芽玻璃化的方法，特別涉及一種克服H. 11648麻再生體系建立過程中不定芽玻璃化的方法。
背景技術：
劍麻為我國熱區的特色纖維作物，主要分布在廣東、廣西、福建、海南和云南等地，近幾十年，劍麻育種工作者不斷從國外引進一些新的種質資源，也先后開展了劍麻雜交育種工作，并且獲得了一些優良種質，但劍麻種質資源嚴重缺乏的現象仍然存在。目前我國唯一當家品種H. 11648，種植面積達98%以上。由于該品種抗真菌能力較差，病蟲害不斷滋生，嚴重影響了劍麻的高產穩產。并且劍麻生命周期長，一生僅開一次花，雜交育種時間長、效率低，因此利用生物技術開展劍麻遺傳改良和種質創新尤為重要。
國內外對劍麻的組織培養做了一定的探索，已成功的建立了亞洲馬蓋麻(Acan tala Robx)、灰葉劍麻(A fourcroydes Lem)、普通劍麻(A si sal ana Perrine)、藍劍麻(A tequilana Weber cultivar azul)> A. parrasana Berger、A. tequilana、A.eras si spina > A. duranguensi sA. vera-cruz Mill·、A. atrovirens、A.和Agave si sal ana Perrine ex 等體外再生體系并獲得了完整的再生植株,中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所也開展了 H. 11648麻的再生體系研究，獲得了一定數量的再生植株，但均存在一定程度的玻璃化現象，最高時玻璃化比例達100%，玻璃化的植株形態異常，無法正常生長，并且組培苗玻璃化問題已成為植物組織培養過程中的瓶頸。因此，解決劍麻組培苗玻璃化問題，建立穩定高效的再生體系對開展劍麻生物技術育種有重要的理論和現實意義。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種克服劍麻不定芽玻璃化的方法。為實現上述目的本發明所采用的技術方案是
一種克服劍麻不定芽玻璃化的方法，包括如下步驟
通過將愈傷組織直接接種在SZ培養基上來誘導不定芽發生，所述的SZ培養基包括大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分、鹿糖、卡拉膠以及激素等八個組分，大量元素及其含量分別為硝酸鉀2267mg/L,磷酸二氫鉀400mg/L,硫酸氨150mg/L, 二水氯化|丐400 mg/L,七水硫酸鎂400 mg/L ；
鐵鹽及其含量為七水硫酸鐵27. 8mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37. 3mg/L ；
微量元素及其含量分別分為一水硫酸錳10mg/L，七水硫酸鋅5mg/L，硼酸5mg/L，碘化鉀lmg/L, 二水鑰酸鈉O. lmg/L,五水硫酸銅O. 2mg/L,六水氯化鈷O. lmg/L;
有機成分及其含量分別為鹽酸硫胺素O. 8 mg/L，鹽酸吡哆醇I. O mg/L，煙酸I. Omg/L,肌醇200 mg/L,甘氨酸3mg/L。
培養基的鹿糖30000mg/L,卡拉膠8000mg/L。培養基的激素為6-芐氨基嘌呤3. Omg/L，3-吲哚丁酸O. lmg/L, α -萘乙酸O. Img/L0所述的SZ培養基的pH值為5. 8。本發明的優點在于
本發明通過調節培養基的有效組分來克服劍麻不定芽玻璃化的現象，該方法操作步驟簡單易行，效果非常顯著，不僅降低了生產成本，同時也為解決劍麻不定芽玻璃化問題提供有效途徑，為劍麻再生體系建立和遺傳轉化等研究奠定了基礎。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，并不限制本發明的范圍。實施例中的MS、SH及SZ培養基成分及含量見附件2，實施例中的6-BA為6-芐氨基嘌呤，NAA為a-萘乙酸，IBA為3-吲哚丁酸，除特別說明外，所有實施例中蔗糖、卡拉膠、PH值、光照時間及強度、溫度、濕度等均相同。實施例I
2010 年 6 月，分別在 MS+6-BA3. Omg/L + NAAO. 2mg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L + NAA O. 2mg/L培養基上接種30個H. 11648麻愈傷團塊，培養條件為光照12h，黑暗12h，光照強度為2000Lx，溫度26°C ±2°C，濕度相對60%。2個月后統計試驗結果，愈傷組織不定芽誘導率分別為88. 3%和89. 2%,不定芽玻璃化比率分別為94. 8%和88. 5%。實施例2
2010年7月，將培養容器的塑料瓶蓋改為透氣性好的封口膜，分別在MS+6-BA3. Omg/L+ NAAO. 2mg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L + NAA O. 2mg/L 培養基上接種 30 個 H. 11648 麻愈傷團塊，2個月后統計試驗結果，愈傷組織不定芽誘導率分別為74. 4%和83. 3%，不定芽玻璃化比率分別為68. 9%和62. 8%
實施例3
2010年7月至9月，以SH為基本培養基，采用完全組合方式對NAA(0. I mg/L, O. 5 mg/L, I. O mg/L)、IBA (O. I mg/L,O. 5 mg/L, I. 0 mg/L)和 6-BA (I mg/L, 3mg/L, 5mg/L)的濃度及組合進行優化，其它培養條件不變。2個月后統計試驗結果，愈傷組織不定芽誘導率在34. 3-100. 0%之間，不定芽玻璃化比率在52. 8%至100%之間，其中6-BA3. Omg/L,NAAO. Img/L、IBAO. lmg/L組合玻璃化比率均優于其它激素組合，愈傷組織不定芽誘導率為100. 0%，玻璃化比率為52. 8%。實施例4
2010 年 10 月至 2011 年 3 月，在 SZ+6-BA3. Omg/L+NAAO. lmg/L+IBAO. lmg/L 培養基上接種1，350塊愈傷組織，塑料瓶蓋，其它培養條件不變，2個月后統計試驗結果，愈傷組織不定芽誘導率為90. 3%，不定芽玻璃化比率為8. 2%。實施例5
2011 年 3 月 17 號，在 SZ +6-BA3. Omg/L + NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L,MS+6-BA3. Omg/L + NAA 0. lmg/L + IBAO. lmg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L + NAA 0. lmg/L + IBAO. lmg/L 培養基上分別接種40個H. 11648麻愈傷組織團塊，培養條件不變。2個月后統計試驗結果，三種培養基愈傷組織不定芽誘導率分別為90. 6%,93. 2%和88. 9%，但誘導的不定芽玻璃化比率相差較大，其中以SZ為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為3. 1%，以MS為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為87. 5%，以SH為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為42. 5%，以SZ為基本培養基獲得的不定芽玻璃化率比MS培養基低84. 4%，比SH基本培養基低39. 4%。實施例6
2011年4月19號，在相同培養條件下，分別在SZ +6-BA3. Omg/L + NAAO. lmg/L+ IBAO. lmg/L、MS+6-BA3. Omg/L + NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L +NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L的培養基上接種141、125、131個Η. 11648麻愈傷組織團塊，2個月后統計試驗結果，愈傷組織不定芽誘導率均為100%，以SZ為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為3. 6%，以MS為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為89. 3%，以SH為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為41. 2%，以SZ為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率比MS和SH基本培養基分別低85. 7%和37. 6%。
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實施例7
2011年5月20號，在相同培養條件下，分別在SZ +6-ΒΑ3. 0mg/L + NAAO. Img/L + IBAO. lmg/L、MS+6-BA3. 0mg/L + NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L 和 SH+6-BA3. Omg/L +NAAO. lmg/L + IBAO. lmg/L的培養基上接種225、170、146個H. 11648麻愈傷組織團塊，2個月后統計試驗結果，愈傷組織不定芽誘導率92. 3%、81. 8%和93. 5%，以SZ為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為3. 03%,以MS為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為81. 5%，以SH為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率為44. 1%，以SZ為基本培養基獲得的不定芽玻璃化比率比MS和SH基本培養基分別低78. 47%和41. 07%
實施例8
從2011年12月至2012年5月，共接種H. 11648麻愈傷組織I，680塊于SZ +6-BA3. Omg/L + NAA 0. lmg/L + IBAO. lmg/L培養基上，獲得了 24，024株再生植株，其中玻璃化的植株有187株，玻璃化比例為7. 8%。附件I具體實施例
權利要求
1.一種克服劍麻不定芽玻璃化的方法，其特征在于包括如下步驟 將淡黃綠色的劍麻愈傷組織直接接種在SZ培養基上誘導不定芽，所述的SZ培養基組成為硝酸鉀2267mg/L，磷酸二氫鉀400 mg/L，硫酸銨150mg/L，二水氯化鈣400 mg/L，七水硫酸鎂400 mg/L, 一水硫酸猛10mg/L,七水硫酸鋅5mg/L,硼酸5mg/L,碘化鉀lmg/L, 二水鑰酸鈉O. lmg/L,五水硫酸銅O. 2mg/L,六水氯化鈷O. lmg/L,七水硫酸鐵27. 8mg/L,乙二胺四乙酸二鈉37. 3mg/L,鹽酸硫胺素O. 8 mg/L,鹽酸比多醇I. O mg/L,煙酸I. Omg/L,肌醇200 mg/L,甘氨酸 3mg/L,鹿糖 30000mg/L,卡拉膠 8000mg/L, pH5. 8,6-節氨基嘌呤 3. Omg/L, 3- Π引哚丁酸 O. lmg/L, α -萘乙酸 O. lmg/L。
2.根據權利要求I所述的一種克服劍麻不定芽玻璃化的方法，其特征在于所述的SZ培養基的pH值為5.8。
全文摘要
本發明涉及一種克服劍麻不定芽玻璃化的方法，是通過將愈傷組織直接接種在SZ培養基上誘導不定芽；SZ培養基的組分為硝酸鉀2267mg/L，磷酸二氫鉀400mg/L，硫酸銨150mg/L，二水氯化鈣400mg/L，七水硫酸鎂400mg/L，一水硫酸錳10mg/L，七水硫酸鋅5mg/L，硼酸5mg/L，碘化鉀1mg/L，二水鉬酸鈉0.1mg/L，五水硫酸銅0.2mg/L，六水氯化鈷0.1mg/L，七水硫酸鐵27.8mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，鹽酸硫胺素0.8mg/L，鹽酸比多醇1.0mg/L，煙酸1.0mg/L，肌醇200mg/L，甘氨酸3mg/L，蔗糖30000mg/L，卡拉膠8000mg/L，pH5.8，6-芐氨基嘌呤3.0mg/L，3-吲哚丁酸0.1mg/L，α-萘乙酸0.1mg/L；用SZ培養基進行H.11648麻愈傷組織不定芽誘導，愈傷組織分化率在90%以上，愈傷組織誘導的不定芽玻璃化比率在8%以下，即該方法可明顯克服劍麻不定芽玻璃化的發生。
文檔編號A01H4/00GK102835312SQ20121029386
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月17日 優先權日2012年8月17日
發明者張燕梅, 周文釗, 戴梅蓮, 李俊峰, 陸軍迎, 林映雪 申請人:中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所