專利名稱：一種見血飛的快速繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域，涉及植物組織培養(yǎng)技術，具體地說是一種見血飛的組織培養(yǎng)方法。
背景技術：
植物是藥物的天然寶庫，人們利用藥用植物的歷史源遠流長，全世界約有75%的人口以植物作為治療預防疾病的藥物來源(邢建民，2001)。人類已經從植物中發(fā)現(xiàn)了許多具有高度生理活性的藥物，目前從植物來源的藥物占藥物總量的25%以上(鄭光植，1987)。我國的傳統(tǒng)中草藥已有數千年的歷史，至今仍在我國和許多國家和地區(qū)廣為使用。 但由于傳統(tǒng)的中草藥獲取方法是以采集和消耗大量的野生植物資源為代價的，當采集和消耗量超過自然資源的再生能力時，必然會導致物種的瀕危甚至滅絕。同時隨著自然生態(tài)環(huán)境的日益破壞，也進一步導致藥用植物資源的匱乏。生物技術的蓬勃發(fā)展為從根本上改變傳統(tǒng)藥材的生產提供了一個嶄新的方法，植物組織和細胞培養(yǎng)技術則是其中一個重要的手段。我國自1964年羅士韋教授首先報道了人參組織培養(yǎng)獲得成功的研究成果以來，許多科學家先后從事了多種藥用植物的組織培養(yǎng)研究。至今，我國藥用植物的組織培養(yǎng)研究迅速發(fā)展。目前，世界各國對植物的藥用開發(fā)和研究都十分重視，就以美國來說，其成藥中有47%是以植物為原料制成的(謝啟昆，1986)。為了解決藥用植物的供需矛盾，人們采用人工栽培的方法擴大藥源。但在人工栽培的藥用植物中，有不少名貴藥材等生產周期較長，如人參、黃連，如果以常規(guī)方法育種或育苗，需要花費很長的時間；另有一些藥用植物如貝母、番紅花等，因繁殖系數小、耗種量大，導致育種速度很慢，生產成本增加。利用植物的有性繁殖方式對其有效成分含量波動比較大，所以利用植物組織培養(yǎng)技術解決藥用植物的植株再生與繁殖問題迫在眉睫。近年來，國內外在這方面已做了大量工作，已成功離體培養(yǎng)獲得試管植株的藥用植物至少有200種，如云南黑節(jié)草、延齡草、高山紅景天、莪術、水母雪蓮、星花繡線菊、溪黃草、玉葉金花、遼東榴木等；其中包括一些具有抗癌有效成分的珍稀植物，如紅豆杉、艾、黃楊、大戟屬植物、長春花、米仔蘭、七葉一枝花、狗牙花和香榧等。見血飛，又名麻藥，散血飛、黃椒、刺三加、紅三百棒，屬于雙子葉植物蕓香科。多年生藤本莖具粗壯的鉤刺，刺基部膨大而成扁圓形木栓化凸起，小枝無毛，疏生黑色倒鉤刺。二回羽狀復葉，葉軸長20— 40厘米，無毛，具鉤刺，羽片2— 5對，羽軸有鉤刺，小葉大，4一5對，革質，卵圓形至長圓形，長5 —12. 5厘米，寬4一5. 5厘米，先端漸尖或銳尖，基部闊楔形或鈍圓，稍不對稱，無毛，葉面深綠色，有光澤，背面灰白色，小葉柄長3— 5毫米。總狀花序單I或2支，或為頂生圓錐花序，長10 — 20厘米；花梗長6 —12毫米，無毛；萼片5，無毛，下方I片盔狀，長9毫米，其余4枚三角狀長圓形，黃色；花瓣5，黃色，不等大，4片相似，長圓形，黃色有紅色斑紋，上面I片寬而短，先端2裂成魚尾狀，有短梗；雄蕊10，伸出花冠外，花絲基部稍粗，被褐色長柔毛；子房具柄，無毛，花柱細長，柱頭小，截形。莢果長圓形，長8—12厘米，寬2. 5-3. 5厘米，扁平，紅褐色，沿腹縫線有翅，翅寬6—7毫米，不開裂。種子I(一2)粒，位于莢果中央。花期11月至翌年2月，果期3 —10月。異葉花椒的葉，性味功能亦同根皮。多配伍外敷，用于接骨。治風寒咳嗽、治跌打損傷，風濕麻木、治刀傷出血黃椒適量，搗緘，外敷患處、治大便秘結。其根主要與淫羊霍等配合使用用于壯陽，造成對野生見血飛需求巨大，見血飛的價格也一路高升。因此，為了滿足日益增大的藥用需求，種子收獲量小，種子繁殖出苗率極低，種子培育過程煩瑣，生長速度慢，同時保護見血飛的野生資源，利用組培快繁技術，實現(xiàn)人工栽培是最好的解決方法。迄今為止，在國內外尚未見關于見血飛組織培養(yǎng)快繁成功的報道。我們通過大量試驗，終于摸索出一套成熟的方法，成功實現(xiàn)了見血飛的組培快繁，可以快速培育出大量幼苗，為實現(xiàn)工業(yè)化人工栽培見血飛提供可能。見血飛的組培快繁技術方法的成功建立，可以為大規(guī)模人工栽培藥用植物見血飛提供種苗，為現(xiàn)代科技農業(yè)提供了一種切實可行的開發(fā)項目
發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供見血飛的快速繁殖方法，該方法非常適合工業(yè)化生產，配方效果佳，出芽率高，培養(yǎng)時間短，植株生長旺盛，可操作性強，應用價值高等優(yōu)點。具有投入少，產出高的特點。本發(fā)明所述見血飛的快速繁殖方法，其具體操作步驟如下I)外植體的選取與滅菌選用見血飛的嫩莖上芽體作為培養(yǎng)材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經O. 1%的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用；2)芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在N6+2，4-DO. 5mg/L+6_BAl. 4mg/L+IBAO. 4mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27 °C，每天光照12小時，光照強度1000LX，接種后10-15天芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗；3)叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于N6+2，4-D0. lmg/L+6-BAl. 8mg/L+IBAO. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27 °C，每天光照16小時，光照強度1000LX，25天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上；4)生根培養(yǎng)選擇N6+6-BA0. 5mg/L +NAA1. 5mg / L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上，只需要20天左右形成完整植株；5)試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土或富養(yǎng)土中，注意保水保溫保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上。在一個具體實施方案中，步驟I中采用O. I %升汞進行消毒，消毒時間控制優(yōu)選在
9-14分鐘。在另一個具體實施方案中，步驟5中大田移栽濕度控制在40-70%;溫度控制在
10-30。。。技術效果(I)利用見血飛帶芽根莖段為外植體，使得外植體取材較容易，一年四季均可取材，而且數量多，采用根莖芽體做外植體，保證了遺傳穩(wěn)定性，同時克服了組織培養(yǎng)中，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上隨著芽的分化而逐漸停止生長，失去增殖能力的弱點，可防止傷組織繼代培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)代數的增加，分化出來的苗出現(xiàn)變異的現(xiàn)象。(2)本發(fā)明方法利用外植體建立，增殖生根同步化這一技術路線，僅需30天左右形成完整植株，4-6個月內獲得大量完整植株，實現(xiàn)見血飛的大規(guī)模工廠化育苗。(3)本發(fā)明方法獲得的試管苗在移載時所采用的基質利用沙土，方法簡單，而且大大降低了移載成本。本培養(yǎng)方法出芽快，增殖率高，方法簡單，生產成本低，可批量生產，應用價值高。(4)見血飛的生產可以在人為控制條件下進行，不受季節(jié)、氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲害的侵襲和農藥殘留的影響，嚴格控制見血飛的質量。增殖速度快，生產周期短，設備簡單，占地面積少，能節(jié)省人力、物力等，便于工廠化生產。(5)使用本發(fā)明提供的組培快繁技術得到的見血飛幼苗進行人工栽培，可以得到·個體差異小，品質均一的見血飛成品。(6)可以保存見血飛的種質資源，同時有利于保護見血飛野生資源，減少對自然資源的破壞。
具體實施例方式下面，本發(fā)明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。實施例I取材見血飛帶腋芽莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南慈利的見血飛鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在N6+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX ;接種后6_8天芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5.8，培養(yǎng)溫度23-271，每天光照16小時，光照強度1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上。4、生根培養(yǎng)選擇 N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg / L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，濕度控制在60% ;溫度控制在20°C，移載I個月后，移載成活率達到96%以上。實施例2取材見血飛帶腋芽莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南慈利的見血飛鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。
2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在N6+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX ;接種后7_8天芽體的萌發(fā)，12天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上。4、生根培養(yǎng)選擇 N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg / L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，濕度控制在50% ;溫度控制在25°C，移載I個月后，移載成活率達到94%以上。 實施例3取材見血飛帶腋芽莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南桑植的見血飛鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養(yǎng)材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。2、芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在N6+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX ;接種后6_8天左右芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于N6+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，PH值為5.8，培養(yǎng)溫度23-271，每天光照16小時，光照強度1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上。4、生根培養(yǎng)選擇N6+6-BA0. 5mg/L +NAA O. 5mg / L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到95%以上，只需要20天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，濕度控制在70% ;溫度控制在20°C，移載I個月后，移載成活率達到98%以上。
權利要求
1.一種見血飛的快速繁殖方法，其具體步驟包括 (1)外植體的選取與滅菌選用見血飛的嫩莖上芽體作為培養(yǎng)材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經O. 1%的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用； (2)芽體的萌發(fā)將滅菌處理后的芽體接種在N6+2，4-DO.5mg/L+6-BAl. 4mg/L+IBAO. 4mg/L培養(yǎng)基上，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27 °C，每天光照12小時，光照強度1000LX，接種后10-15天芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗； (3)叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)將小苗切下轉接于N6+2，4-D0.lmg/L+6-BAl. 8mg/L+IBAO. 4mg/L培養(yǎng)基上，直至形成叢生芽，pH值為5. 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，25天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上； (4)生根培養(yǎng)選擇N6+6-BA0.5mg/L +NAA1. 5mg / L作為生根培養(yǎng)基，pH值為5· 8，培養(yǎng)溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上，只需要20天左右形成完整植株； (5)試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土或富養(yǎng)土中，注意保水保溫保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上。
2.權利要求I的方法，其中步驟I中采用O.I %升汞進行消毒，消毒時間控制優(yōu)選在9-14分鐘。
3.權利要求2的方法，其中步驟5中大田移栽濕度控制在40-70%;溫度控制在10-30。。。
全文摘要
該方法是在N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)見血飛的莖段等組織，確切取帶1-2個芽的根莖段為外植體，消毒后，接種在N6+2，4-D0.5mg/L+6-BA1.4mg/L+IBA0.4mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種后6-8天左右芽體的萌發(fā)，10天左右形成帶葉的小苗，將小苗切下轉接于N6+2，4-D0.1mg/L+6-BA1.8mg/L+IBA0.4mg/L培養(yǎng)基上，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上。選擇擇N6+6-BA0.5mg/L+NAA1.5mg／L作為生根培養(yǎng)基，生根率達到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。試管苗移載到沙土中，注意保水保濕，移載1個月后，移載成活率達到90%以上，建立了一套高頻穩(wěn)定再生體系。本發(fā)明方法具有出芽快，增殖率高，方法簡單，生產成本低，可批量生產，應用價值高。
文檔編號A01H4/00GK102893863SQ201210332048
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月10日 優(yōu)先權日2012年9月10日
發(fā)明者董愛文, 于華忠, 卜曉英 申請人:向華