專利名稱：寡雄腐霉發酵液制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵技術領域，特別是涉及一種寡雄腐霉發酵液制備方法及其使用該發酵液有效控制煙草黑脛病的方法。
背景技術：
黑胚病nicotiana Breda ofe/fea/ )是我國烤煙的常見病害,發病率高，分布廣泛，危害嚴重。除黑龍江省之外，全國各地均有發生，常年發病面積占當年烤煙種植面積的18%，嚴重影響烤煙的產量、質量和經濟效益。目前，化學農藥是防治煙草黑脛病的主要手段。黑脛病病原菌的小種甚多，對化學農藥的敏感性不一樣，且容易產生抗藥性，多種化學藥劑對黑脛病的防治效果隨施藥時間的延長而降低。此外，這些化學藥劑的殘效期長，殘留量高，影響煙葉安全性。所以，在烤煙栽培中，安全、高效地防治煙草黑脛病是迫切需要解決的生產問題。 寡懺腐霉(Pythium能有效抑制番爺葡萄灰霉病、黃瓜的種腐和苗期猝倒病等多種病原真菌的生長繁殖。在歐洲發達國家，人們已制備出對人畜和環境無毒且高度安全的寡雄腐霉卵孢子制劑，廣泛應用于綠色水果和蔬菜生產。但寡雄腐霉形成卵孢子，人工產孢困難，限制了寡雄腐霉的普遍應用，目前，北京比奧瑞生物科技有限公司從捷克引進了寡雄腐霉卵孢子制劑(菌株oligandrum DV 74),為寡雄腐霉防病制劑的后續開發與應用奠定了基礎。眾所周知，卵孢子的萌發和菌絲生長與環境條件密切相關。作為一種微生物制劑，大田應用寡雄腐霉卵孢子時，氣溫、濕度、光照(尤其是紫外線強度)、降雨、營養環境等均影響卵孢子的萌發和菌絲生長。此外，田間條件易于變化，難以提供寡雄腐霉卵孢子萌發和菌絲生長的合適環境，故卵孢子制劑在實際應用中穩定性極差。通過發酵工程生產其具有生防作用的次生代謝產物，在田間應用時不僅可以提高防治效果，還可克服微生物菌劑效果不穩定的常見缺點。因此，利用優良高產寡雄腐霉菌株，優化發酵條件制備生防發酵液可能更好、更可靠地防治煙草黑脛病。迄今為止，國內外尚無寡雄腐霉發酵液制備方法的研究報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種寡雄腐霉發酵液制備方法及發酵液的施用方法，為有效控制煙草黑脛病提供技術支持。本發明選用北京比奧瑞生物科技有限公司從捷克引進的“多利維生.寡雄腐霉”卵孢子制劑(菌株oligandrum DV 74),該產品已在歐盟、美國、加拿大、巴西等國家正式登記，并于2009年在我國農業部登記(登記號LS20091213)，還獲得歐洲FiBL和美國OMRI有機認證。本發明所述的一種寡雄腐霉發酵液制備方法，通過以下步驟實現
(I)寡雄腐霉菌種的獲得
將“多利維生.寡雄腐霉”卵孢子制劑用無菌水稀釋10，105倍，改進馬丁氏(Martin)瓊脂培養基100° C溶化搖勻，取5 mL培養基于25 mL試管中，121° C蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至45° C，每支試管加入16.5 mL 1%孟加拉紅無菌水溶液和15 mL 1%鏈霉素無菌水液，搖勻，傾斜放置制備斜面；接入稀釋后的寡雄腐霉卵孢子，25° C暗培養1(Γ12天，挑選出寡雄腐霉菌絲，并用上述培養基和培養方法擴繁菌絲；
改進馬丁氏(Martin)瓊脂培養基I g KH2PO4、O. 5 g MgSO4 · 7H20、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酒石酸銨、I g琥拍酸、20 g瓊脂、1000ml水、ρΗ5· 5-6. O ;
(2)寡雄腐霉發酵液的制備
(2. I)培養基種子罐培養基2%玉米粉，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸銨，O. 1%琥珀酸，余量為水，初始ΡΗ5. 5-6. O ;二級罐培養基同種子罐培養基；發酵罐培養基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸銨，O. 2%琥珀酸，余量為水，初始ρΗ5. 5-6. O ； (2. 2)液體發酵種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的種子罐培養基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風量為1:0. 1，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養48小時；二級罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的二級罐培養基，將種子罐中的培養液轉入二級罐中，在通風量為1:0. 25，罐壓O. 05Mpa，30°C 土1°C的條件下培養24小時；發酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的發酵罐培養基，將二級罐中的培養液轉入到發酵罐中，在通風量為1:0. 5，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養12(Tl40小時；
(2. 3)過濾濃縮發酵液放入緩存罐，用板框壓濾機壓濾；濾液打入另一個緩存罐，真空刮板濃縮5倍，蒸發溫度4(T42°C，即得發酵液。上述方法步驟(I)中，在3-5 ° C條件下，菌絲可保存3個月，多代擴繁，長期自主保存做為菌種，在進行液體發酵時，取出擴繁用于液體發酵的菌種。本發明所得寡雄腐霉發酵液的施用方法為
在煙草黑脛病高發期前7-10天，在我國西南地區一般為71月降雨后的高溫高濕期，將濃縮的寡雄腐霉發酵液兌水稀釋5 10倍，灌根f 2次，每次每株煙苗50 mL,間隔1(Γ 5天。本發明所得寡雄腐霉發酵液對煙草黑脛病菌有明顯的抑制作用，對黑脛病菌絲生長和孢子萌發的抑制率分別達到80. 5%和52. 9%。在離體葉片試驗中，發酵液對中感紅花大金元的防效高達74. 2%，對易感紅花大金元防效也能達到71. 4% ；溫室盆栽試驗中，接種煙草黑脛病菌前24h施用發酵液防治效果為65. 1%，接種后24h施用發酵液的防治效果為60. 1% ；在田間試驗中，施用發酵液防治煙草黑脛病的效果為57. 5飛6. 3%，施用孢子粉防治煙草黑脛病的效果(Γ25. 4%。本發明的優點是
I.寡雄腐霉發酵設備簡單、通用，資源消耗少，工業化生產要求低，一般微生物發酵工廠即可滿足生產。2.與寡雄腐霉卵孢子制劑相比，利用寡雄腐霉發酵液防治煙草黑脛病效果好而穩定，受環境條件影響小，施用方法簡單，實用性強，容易推廣。3.成本低廉，寡雄腐霉卵孢子制劑進口價格高昂，用本發明方法生產發酵液，施用成本僅為寡雄腐霉孢子制劑的20%。
具體實施例方式實施例I :
I、培養基種子罐培養基2%玉米粉(磨細過100目篩，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸銨，O. 1%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 5 ;二級罐培養基同種子罐培養基；發酵罐培養基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸銨，O. 2%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 5。2、發酵液制備種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至35°C的種子罐培養基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風量為1:0. 1，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養48小時；二級罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至35°C的二級罐培養基，經轉移管道將種子罐中的培養液轉入二級罐中，在通風量為1:0. 25，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養24小時；發酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至35°C的發酵罐培養基，經轉移管道將二級罐中的培養液轉入到發酵罐中，在通風量為1:0. 5，罐壓O. 05Mpa，30°C ±1°C的條 件下培養12(Γ140小時；發酵液經放料管道進入緩存罐，經板框壓濾機進行壓濾；濾液打入另一個緩存罐，再進行真空刮板濃縮5倍(蒸發溫度4(T42°C)，即制備獲得發酵液。3、施用在四川省某煙地于2012年8月3日和8月13日分別用兌水稀釋5倍的寡雄腐霉發酵液灌根，每株50mL，防治煙草黑脛病的效果為66. 3 %，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做為對照無防治效果。實施例2:
I、培養基種子罐培養基2%玉米粉(磨細過100目篩，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸銨，O. 1%琥珀酸，余量為水，初始pH6. O ;二級罐培養基同種子罐培養基；發酵罐培養基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸銨，O. 2%琥珀酸，余量為水，初始pH6. O。2、發酵液制備種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至33°C的種子罐培養基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風量為1:0. 1，罐壓O. 05Mpa，30°C 土1°C的條件下培養48小時；二級罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至32°C的二級罐培養基，經轉移管道將種子罐中的培養液轉入二級罐中，在通風量為1:0. 25，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養24小時；發酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至31°C的發酵罐培養基，經轉移管道將二級罐中的培養液轉入到發酵罐中，在通風量為1:0. 5，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養12(Γ140小時；發酵液經放料管道進入緩存罐，經板框壓濾機進行壓濾；濾液打入另一個緩存罐，再進行真空刮板濃縮5倍(蒸發溫度4(T42°C)，即制備獲得發酵液。3、施用在貴州省某煙地于2012年7月20日和8月4日分別用兌水稀釋8倍的寡雄腐霉發酵液灌根，每株50mL，防治煙草黑脛病的效果為57. 5%，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做為對照的防治效果為25. 4%。實施例3:
I、培養基種子罐培養基2%玉米粉(磨細過100目篩，下同)，1%葡萄糖，O. 25%酒石酸銨，O. 1%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 7 ;二級罐培養基同種子罐培養基；發酵罐培養基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，O. 5%酒石酸銨，O. 2%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 7。2、發酵液制備種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至30°C的種子罐培養基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風量為1:0. 1，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養48小時；二級罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至30°C的二級罐培養基，經轉移管道將種子罐中的培養液轉入二級罐中，在通風量為1:0. 25，罐壓O. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養24小時；發酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至30°C的發酵罐培養基，經轉移管道將二級罐中的培養液轉入到發酵罐中，在通風量為1:0. 5，罐壓O. 05Mpa，30°C ±1°C的條件下培養12(Γ140小時；發酵液經放料管道進入緩存罐，經板框壓濾機進行壓濾；濾液打入另一個緩存罐，再進行真空刮板濃縮5倍(蒸發溫度4(T42°C)，即制備獲得發酵液。3、施用在重慶市某煙地于2012年7月25日和8月5日分別用兌水稀釋10倍的寡雄腐霉發酵液灌根，每株50mL，防治煙草黑脛病的效果為59. 4%，施用寡雄腐霉孢子粉各500克做為對照的防治效果為15 . 7 %。
權利要求
1.一種寡雄腐霉發酵液制備方法，其特征在于通過以下步驟實現 (1)寡雄腐霉菌種的獲得 將“多利維生.寡雄腐霉”卵孢子制劑用無菌水稀釋10，105倍，改進馬丁氏(Martin)瓊脂培養基100° C溶化搖勻，取5 mL培養基于25 mL試管中，121° C蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至45° C，每支試管加入16.5 mL 1%孟加拉紅無菌水溶液和15 mL 1%鏈霉素無菌水液，搖勻，傾斜放置制備斜面；接入稀釋后的寡雄腐霉卵孢子，25° C暗培養1(T12天，挑選出寡雄腐霉菌絲，并用上述培養基和培養方法擴繁菌絲； 改進馬丁氏(Martin)瓊脂培養基I g KH2PO4、0. 5 g MgSO4 7H20、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酒石酸銨、I g琥拍酸、20 g瓊脂、1000ml水、pH5. 5-6. 0 ; (2)寡雄腐霉發酵液的制備 (2. I)培養基種子罐培養基2%玉米粉，1%葡萄糖，0. 25%酒石酸銨，0. 1%琥珀酸，余量為水，初始PH5. 5-6. 0 ;二級罐培養基同種子罐培養基；發酵罐培養基2%玉米粉，I. 5%葡萄糖，0. 5%酒石酸銨，0. 2%琥珀酸，余量為水，初始pH5. 5-6. 0 ； (2. 2)液體發酵種子罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的種子罐培養基，在無菌操作下，將寡雄腐霉菌絲接入種子罐，在通風量為1:0. 1，罐壓0. 05Mpa，30°C 土 1°C的條件下培養48小時；二級罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的二級罐培養基，將種子罐中的培養液轉入二級罐中，在通風量為1:0. 25，罐壓0. 05Mpa，30°C 土1°C的條件下培養24小時；發酵罐盛有121°C滅菌30min并冷卻至3(T35°C的發酵罐培養基，將二級罐中的培養液轉入到發酵罐中，在通風量為1:0. 5，罐壓0. 05Mpa，30°C ± 1°C的條件下培養12(Tl40小時； (2. 3)過濾濃縮發酵液放入緩存罐，用板框壓濾機壓濾；濾液打入另一個緩存罐，真空刮板濃縮5倍，蒸發溫度4(T42°C，即得發酵液。
全文摘要
本發明涉及一種寡雄腐霉發酵液制備方法及其使用該發酵液有效控制煙草黑脛病的方法，利用“多利維生．寡雄腐霉”卵孢子制劑(菌株PythiumoligandrumDV74)獲得寡雄腐霉菌種，再經液體發酵和過濾濃縮等步驟得到。與寡雄腐霉卵孢子制劑相比，利用寡雄腐霉發酵液防治煙草黑脛病效果好而穩定，受環境條件影響小，施用方法簡單，實用性強；成本低廉，施用成本僅為寡雄腐霉孢子制劑的20%；寡雄腐霉發酵設備簡單、通用，資源消耗少，工業化生產要求低，一般微生物發酵工廠即可滿足生產。
文檔編號A01N63/04GK102796674SQ20121033261
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者黃建國, 趙建, 袁玲 申請人:西南大學