專利名稱：與硅轉運相關的組合物和方法
與硅轉運相關的組合物和方法
背景技術：
本發明涉及可以用于在植物中(比如大豆)增加硅吸收并且增加對生物性以及非生物性脅迫的耐受性的組合物和方法。對植物的生物性以及非生物性脅迫每年對作物引起價值數十億美元的危害。例如，大豆銹病(由豆薯層銹菌真菌所引起的一種疾病)2003年在巴西導致價值大約十億美元的損害。這種疾病現在已經開始傳播進入美國(全世界大豆最大的生產者)。雖然這種銹病可以使用化學殺菌劑來治療，這么做是昂貴的、對環境有潛在的損害、并且可能僅僅是部分有效的。因此，對于用于保護植物免受生物性連同非生物性脅迫的額外的或改進的方法存在一種需求。大豆銹病的預防或控制是在這方面最重要的應用之
O發明概述我們已經發現在已知的有效吸收硅的植物中硅流入和流出轉運蛋白的基因，這些植物包括小麥、木賊、高粱、燕麥、以及大麥。這些編碼的轉運蛋白當在一種植物(如大豆)中表達時增加對生物性以及非生物性應激源的耐受性。因此，本發明的特征在于對硅轉運蛋白進行編碼的多核苷酸；包括這類多核苷酸的載體、細胞、以及植物；以及用于制造這類植物的方法。該發明的特征還在于硅轉運蛋白多肽以及它們的片段。具體地講，有用的是用在此所說明的這些硅轉運蛋白轉化的大豆植物，其中該硅轉運蛋白的表達導致對大豆銹病的耐受性增加。相應地,在一個第一方面中,本發明的特征在于一種基本上純的多核苷酸，該多核苷酸包括與選自下組的一種序列基本上一致的一個核酸序列(例如至少85^^90^^95%、96%,97%,98%,99%,99. 5%、或 100%—致性)，該組的組成為SEQ ID NO :4、9、12、13、 14、15、33、52、67、SEQ ID NO 21 的核苷酸 124-919,SEQ ID NO 22 的核苷酸 146-694、以及SEQ ID NO 32的核苷酸124-1014、或其一種片段。本發明的特征還在于包括一個核酸序列的一種多核苷酸，該核酸序列編碼與選自下組的一種序列基本上一致的一種多肽，，該組的組成為SEQ ID NOS :5、6、34-38、60、以及68、或其一種片段。在其他的實施方案中，將該核酸序列進行修飾以便包含一種或多種(例如至少2、3、4、5、8、10、15)突變、缺失、插入、或它們的一種組合。該修飾的核酸序列可以編碼當它在一種細胞中表達時具有增加或者減少硅轉運的一種多肽。該多肽在與小麥SIITl序列(SEQ ID NO 37)的位置132對應的位置可以具有一種突變。在某些實施方案中，該突變是一種蘇氨酸到丙氨酸的突變)。在某些實施方案中，該多核苷酸是與SEQ ID NO :50基本上一致的或該多核苷酸編碼與SEQ ID NO 51基本上一致的一種多肽。在一些實施方案中，在一種細胞中由該第一方面的多核苷酸編碼的多肽的表達增加或能夠增加進入所述細胞的硅轉運。在另一方面,本發明的特征在于包括與選自下組的一種核苷酸序列基本上一致的(例如至少 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%、或 100%—致性)一個核酸序列的一種基本上純的多核苷酸，該組的組成為SEQ ID NOS :29、71、以及73、或其一種片段。本發明的特征還在于包括一個核酸序列的一種基本上純的多核苷酸，該核酸序列編碼與選自下組的一種氨基酸序列基本上一致的一種多肽，該組的組成為SEQ ID N0S:31、72、以及74、或其一種片段。在一些實施方案中,在一種細胞中由該多核苷酸編碼的多肽的表達增加或能夠增加離開所述細胞的硅轉運。在另一方面,本發明的特征在于包括與選自下組的一種核苷酸序列基本上一致的(例如至少 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%、或 100%—致性)一個核酸序列的一種基本上純的多核苷酸，該組的組成為SEQ ID N0:56、58、以及59、或其一種片段。本發明的特征還在于包括一個核酸序列的一種基本上純的多核苷酸，該核酸序列編碼與選自下組的一種序列基本上一致的一種多肽，該組的組成為SEQ ID N0:63、65、以及66、或其一種片段。在一些實施方案中，在一種細胞中由該多核苷酸編碼的多肽的表達增加或能夠增加進入所述細胞的硅轉運。在上述方面的任何一種中，該多核苷酸長度可能是小于1，000、500、100、50、30、 20、15、10、8、6、5、4、3、或21*。該多核苷酸可以被可操作地連接到一種啟動子上，例如能夠在一種植物細胞中表達的一種啟動子。該啟動子可以是時間依賴性的、細胞特異性的(例如根細胞)、或組織特異性的(例如在此所說明的任何一種組織中)。該啟動子可以是組成型的或誘導型的，例如在類似任何一種非生物性或生物性脅迫的環境條件之下(例如在此所說明的那些)。本發明的特征還在于包括本發明的一種多核苷酸的一種載體。該載體可以進一步包括一種第二多核苷酸。在一個實施方案中，該第二多核苷酸編碼一種娃流出轉運蛋白或其一種片段(例如與選自下組的一種序列基本上一致的一種多核苷酸，該組的組成為SEQ ID NO :28、29、71、以及73;對與選自下組的一種序列基本上一致的一種多肽進行編碼的一種多核苷酸，該組的組成為SEQ ID NO :30、31、72、以及74、或其一種片段)。在另一個實施方案中，該第二多核苷酸編碼一種硅流入轉運蛋白或其一種片段(例如與選自下組的一種序列基本上一致的一種多核苷酸，該組的組成為SEQ ID N0:3、4、9、12、13、14、
15、33、50、52、53、55、56、57、58、59、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO :22 的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO 32的核苷酸124-1014 ;對與選自下組的一種氨基酸序列基本上一致的一種多肽進行編碼的一種多核苷酸，該組的組成為SEQ ID NO :5、6、34-38、51、54、60、61、62、63、64、65、66、以及68、或其一種片段)。本發明的特征還在于一種細胞，例如包括該載體的一種植物細胞(例如一種大豆細胞或來自在此所說明的任何一種植物的一種細胞)、一種細菌細胞、或在此所說明的任何一種細胞。在一些實施方案中，該細胞可以是一種植物種子或來自一種植物(例如在此所說明的任何一種植物)的一種組織的一部分。本發明的特征還在于由在此所說明的這些多核苷酸的任何一種進行編碼的一種多肽、或其片段。該多肽可以是基本上純的或可以在一種細胞中重組表達。在另一方面，本發明的特征在于包括一個或多個異源多核苷酸的一種植物(例如大豆或在此所說明的任何一種植物)、植物組織、或種子，該異源多核苷酸包括與對一種硅流入轉運蛋白或其一種片段進行編碼的一個核酸序列基本上一致的一個核酸序列(例如，與選自下組的一種序列基本上一致的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :3,4,9,
12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO :22 的核苷酸146-694、以及SEQ ID NO :32的核苷酸124-1014，或其一種片段)或對與SEQ ID NO :5、6、34-38、51、54、60、61、以及68、或其一種片段的一種氨基酸序列基本上一致的一種多肽進行編碼的一個核酸序列。由該異源多核苷酸編碼的多肽在表達時可以增加或能夠增加進入該植物內至少一個組織或細胞(例如根細胞)的硅轉運。該植物、植物組織、或種子可以進一步包括與對一種硅流出轉運蛋白、一種硅流入轉運蛋白、或其一種片段進行編碼的一種多核苷酸基本上一致的一種第二異源多核苷酸。該第二異源多核苷酸可以是與以下序列基本上一致的(a)選自下組的一個核酸序列，其組成為SEQ ID NO :28、29、71、以及73，(b)對選自下組的一種氨基酸序列進行編碼的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :30,31,72、以及74，或(c)其一種片段。在其他的實施方案中，該第二異源多核苷酸是與以下序列基本上一致的(a)SEQ ID NO :55、56、57、58、或 59 的核酸序列，(b)對 SEQ ID NO :62、63、64、65、或66的氨基酸序列進行編碼的一個核酸序列，或(c)其一種片段。該植物可以顯示對一種或多種生物性或非生物性脅迫(例如在此所說明的那些)增強的耐受性。在一個實施方案中，該植物是展示了對大豆銹病增強的耐受性的一種大豆植物、或來自這樣一種植物的一種組織或種子。在另一方面，本發明的特征在于一種植物(例如大豆或在此所說明的任何一種植 物)、植物組織、或種子，它們包括一種或多種異源多核苷酸，這些異源多核苷酸包括與對一種硅流出轉運蛋白或其一種片段進行編碼的一個核酸序列基本上一致的一個核酸序列。該多核苷酸可以包括與以下序列基本上一致的一種序列(a)選自下組的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID勵28、29、71、以及73，或(13)對選自下組的一種氨基酸序列進行編碼的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID N0:30、31、72、以及74，或(c)其一種片段。該異源多核苷酸可以編碼一種多肽，該多肽在表達時增加或能夠增加離開該植物內至少一個組織或細胞(例如，根細胞)的硅轉運。該植物、植物組織、或種子可以進一步包括與對一種硅流入轉運蛋白、或其一種片段進行編碼的一個核酸序列基本上一致的一種第二異源多核苷酸序列。該第二多核苷酸可以是與以下序列基本上一致的(a)選自下組的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919,SEQ ID NO :22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO 32 的核苷酸 124-1014，(b)對選自下組的一種氨基酸序列進行編碼的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :5,6,34-38、51、54、60、61、以及68，或(c)其一種片段。在其他的實施方案中，該第二異源多核苷酸是與以下序列基本上一致的(a)選自下組的一個核酸序列，其組成為SEQ ID NO 55,56、57、58、以及59，(b)對選自下組的一種氨基酸序列進行編碼的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :62、63、64、65、以及66，或(c)其一種片段。該植物、植物組織、或種子可以顯示對一種或多種生物性或非生物性脅迫(例如在此所說明的那些)增強的耐受性。在一個實施方案中，該植物是展示了對大豆銹病增強的耐受性的一種大豆植物、或來自這樣一種植物的一種組織或種子。在又一方面，本發明的特征在于一種植物(例如大豆或在此所說明的任何一種植物)、植物組織、或種子，它們包括與對一種硅流入轉運蛋白或其一種片段進行編碼的一個核酸序列基本上一致的一種異源多核苷酸。該多核苷酸可以包括與以下序列基本上一致的(例如至少 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%、或 100% —致性)一個核酸序列(a)選自下組的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :55、56、57、58、以及59，(b)對選自下組的一種氨基酸序列進行編碼的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :62、63、64、65、以及66，或(c)其一種片段。由該異源多核苷酸編碼的多肽在表達時可以增加或能夠增加進入該植物內至少一個組織或細胞(如根、莖、或葉細胞)的硅轉運。該植物、植物組織、或種子可以進一步包括一種第二異源序列。該第二多核苷酸可以是硅流入轉運蛋白(例如與以下序列基本上一致的一種多核苷酸(a)選自下組的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :3、4、9、12、13、14、15、33、50、52、53、67、SEQ ID NO :21 的核苷酸 124-919、SEQ ID NO :22 的核苷酸 146-694、以及 SEQ ID NO 32 的核苷酸 124-1014，
(b)對選自下組的一種氨基酸序列進行編碼的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO 5,
6、34-38、51、54、60、61、以及68,或(c)其一種片段)。在某些實施方案中，用一種第三異源多核苷酸轉化該植物，例如對一種硅流出轉運蛋白進行編碼的一種多核苷酸。在其他的實施方案中，該第二異源多核苷酸編碼硅流出轉運蛋白。對一種硅流出轉運蛋白進行編碼的多核苷酸可以是與以下序列基本上一致的一種多核苷酸(a)選自下組的一個核酸序列，其組成為SEQ ID NO :28、29、71、以及73，(b)對選自下組的一種氨基酸序列進行編碼的一個核酸序列，該組的組成為SEQ ID NO :30、31、72、以及74，或(c)其一種片段。本發明的特征還在于用于生成如上說明的這些植物、植物組織、或種子的任何一 種的方法。在一方面，該方法包括(a)提供一種第一載體，該載體包括與一個核酸序列基本上一致的一種多核苷酸，該核酸序列對一種硅流入轉運蛋白或其一種片段(例如如上說明的那些的任何一種)進行編碼；(b)用該載體對一種植物細胞(例如一種大豆細胞或來自在此所說明的任何一種植物的一種細胞)進行轉化；以及(C)從該細胞生長一種植物，其中該植物表達該多核苷酸，由此生成具有增加的硅吸收的一種植物。可以使用在本領域中已知的任何一種方法進行該轉化(例如在此所說明的任何一種方法)。該載體可以包括一種第二多核苷酸，該第二多核苷酸包括與一種硅流出轉運蛋白(例如如上說明的那些的任何一種)或其一種片段基本上一致的一個核酸序列。在另一方面，本發明的特征還在于生成具有增加的硅轉運的一種植物、植物組織、或植物種子的一種方法。該方法包括(a)提供一種第一載體，該第一載體包括與對一種硅轉運蛋白或其一種片段(例如一種流入轉運蛋白(例如一種SIITl或SIIT2)或一種流出轉運蛋白，例如以上所說明的那些的任何一種)進行編碼的一個核酸序列基本上一致的一種多核苷酸；(b)用該載體對一種植物細胞(例如一種大豆細胞或來自在此所說明的任何一種植物的細胞)進行轉化；以及(c)從該細胞生長一種植物，其中該植物表達該多核苷酸，由此生成具有增加的硅轉運的一種植物。該載體可以進一步包括一種第二多核苷酸，該第二多核苷酸與對一種硅流入轉運蛋白(例如以上所說明的那些的任何一個)或其一種片段進行編碼的一個核酸基本上一致。在這兩種上述方法的任何一個中，該第二多核苷酸可以可替代地包含在一種第二載體中，將該第二載體轉化為第一載體(例如同時地或順序地)。在這上述的兩種方法的任何一個中，該方法可以進一步包括步驟(d)從該植物生成種子或從該植物收獲至少一個組織。在一個實施方案中，該第一多核苷酸是一種硅流出轉運蛋白并且該第二多核苷酸是一種娃流入轉運蛋白。在針對植物、植物組織、以及種子或相關方法的方面中，該植物組織可以是、例如根、果實、胚珠、雄性組織、種子、珠被、塊莖、柄、果皮、葉、柱頭、花粉、花藥、花瓣、萼片、花梗、長角果、以及莖。種子組織包括胚、胚乳、以及種皮。其中“基本上純的多核苷酸”意思是指一個核酸(例如、一種DNA或一種RNA分子)，該核酸不含有在從中得到本發明的核酸分子的生物體的天然發生的基因組中位于該基因兩側的這些基因。因此，該術語包括，例如結合進入一種載體；進入一種自主復制質粒或者病毒；或進入一種原核生物或真核生物的基因組DNA的一種重組DNA ;或作為一種獨立于其他序列的單獨的分子存在(例如一種cDNA或由PCR或限制性核酸內切酶消化生成的一種基因組或cDNA片段)的一種重組DNA。此外，該術語包括一種RNA分子，該RNA分子是從一種DNA分子轉錄的；連同一種重組DNA，該重組DNA是對額外的多肽序列進行編碼的一種雜合基因的一部分。其中“基本上純的多肽”意思是指已經與自然伴隨它的組分分離的一種多肽。典型地，當以重量計，該多肽至少是30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或甚至99%不含有這些蛋白以及與這些蛋白天然結合的天然發生的有機分子的時，該多肽基本上是純的。一種基本上純的多肽可以通過從一種天然來源提取，通過在正常不表達該蛋白的一種細胞中表達一種重組核酸，或通過化學合成而獲得。其中“轉化的細胞”意思是指通過重組DNA技術已經將一種DNA分子(例如對一種硅流入或流出轉運蛋白進行編碼的一種DNA分子或在此所說明的這些核酸的任何一種) 的引入其中(或引入其一種祖細胞中)的一種細胞。其中一種多核苷酸或氨基酸序列的“片段”意思是指一種較長序列(例如在此所說明的一種序列)的任何一種的至少10、15、20、25、30、50、75、100、250、300、400、或500個
連續核酸或氨基酸。當用于氨基酸序列時，術語“基本上一致”表示多肽的一種特征，其中該肽包括與另一種序列(例如圖I這些序列的任何一種或其一種片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%序列一致性的一種序列。當用于核酸序列時，術語“基本上一致”表示多核苷酸序列的一種特征，其中該多核苷酸包括與一個參照相比(例如在此所說明的這些序列的任何一種)具有至少50%，優選地 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%一致性的一種序列。核苷酸序列基本上一致的另一個指標是是否兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。嚴格條件是序列依賴性的并且在不同的情況下將是不同的。總體上，選擇的嚴格條件是約5°C至約20°C，通常約10°C至約15°C，低于在一個定義的離子強度和pH下對于該特異的序列的熱解鏈溫度CU。Tm是50%的目標序列雜交到一個匹配的探針上的溫度(在定義的離子強度以及PH下)。典型地，嚴格條件將是那些，其中在pH7下該鹽濃度是約O. 02摩爾并且該溫度是至少約60°C。例如在一種標準的DNA雜交步驟中，嚴格條件將包括在42°C下在6xSSC中的一次初始洗滌，隨后在至少約55°C的溫度下(典型地約60°C并且經常地約65°C )在O. 2xSSC中的進行一次或多次額外的洗滌。為了本發明的目的當所述核苷酸序列編碼基本上一致的多肽和/或蛋白時，核苷酸序列也是基本上一致的。因此，當一個核酸序列編碼與一種第二核酸序列基本上相同的多肽時，這兩個核酸序列基本上是一致的即使由于遺傳密碼允許的簡并性在嚴格條件下它們可能不會雜交(參見Darnell等人的Molecular Cell Biology,第二版ScientificAmerican Books ff. H. Freeman and Company New York, 1990 對于密碼子簡并性和遺傳密碼的一種解釋)。蛋白質的純度或者均一性可以通過本領域中眾所周知的多種方式表示，例如一種蛋白樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后通過染色顯像。為了某些目的，高分辨率可能是需要的并且可以使用HPLC或一種類似的方法用于純化。其中“增加(進入或離開一種細胞的)硅轉運”的一種多肽意思是指一種多肽，在那種細胞中該多肽的表達導致與缺乏該多肽的一種細胞相比較，穿過該細胞膜(例如進入或離開該細胞)的硅或鍺轉運速率增加(例如至少5%、10%、25%、50%、100%、200%、300%、500%、1，000%、5，000%、或10，000% ),但基本上不破壞該細胞膜或以一種非特異性方式增加其他分子(例如甘油)的轉運。一種“硅流入轉運蛋白”或一種“硅流出轉運蛋白”是對應地能夠增加進入或離開一種細胞的硅轉運一種多肽。本發明的其他特征與優點從以下詳細說明、附圖
以及權利要求中將會是清楚的。附圖簡要說明圖Ia-Ivvv是在此所說明的序列(SEQ ID NO 1-74)的列表。圖2是預測的SIITl與SIIT2的氨基酸序列的一個比對。一致的氨基酸被標記為黑色；相似的氨基酸被標記為灰色。圖3是預測的SIITl的氨基酸序列的一個比對。一致的氨基酸被標記為黑色；相似的氨基酸被標記為灰色。圖4是一組圖示，顯示在一種無Si或具有I. 7mM Si的溶液中孵育O、15、30、或60分鐘后在卵母細胞中量化的硅濃度。用水注入對照卵母細胞。對于水稻和小麥SIITl進行測試檢測它們轉運Si的能力。圖5是一組圖示，顯示在一種無Si或具有I. 7mM Si的溶液中孵育O、15、30、或60分鐘后在卵母細胞中量化的硅濃度。用水注入對照卵母細胞。“Lsi_”表示用突變的SIITlcRNA注入的卵母細胞，并且“Lsi+”表示用野生型SIITl cRNA注入的卵母細胞。詳細說明木賊與禾本科植物比如小麥、燕麥、高粱、以及大麥已知是硅的高度積聚植物。具體地說已知木賊非常有效地積聚硅，并且硅化合物可以占木賊干重的15%。因此我們猜測這些植物，由于它們的高的硅含量，將可能有效地轉運硅，例如能夠使高濃度的硅在該植物中積聚，能夠快速轉運硅、或兩者都能夠。因此，這些轉運蛋白可以用于在一種異源的細胞中(例如在正常時具有較低的硅吸收或轉運的一種植物中)通過表達在此所說明的一種轉運蛋白，增加硅吸收。因為在植物中增加的硅含量與對生物性以及非生物性脅迫二者的增強的耐受性相關聯，在一種植物中這些轉運蛋白的表達可以增強對脅迫的耐受性。當由豆薯層銹菌真菌所引起的大豆銹病對大豆作物引起顯著損害時，這樣一種方法在大豆中可能是特別有用的。因此，本發明的特征在于具有與在此識別的這些硅轉運蛋白序列一致的多核苷酸和多肽，包含這類多核苷酸的載體、細胞、以及植物(例如大豆)，以及用于制造這類植物的方法。表達硅轉運蛋白的植物可以顯示對真菌(例如銹菌)增強的耐受性。植物中的硅硅(Si)是以硅酸的形式通過根系吸收的，其中它可以以聚合硅的形式最終積聚在這些植物的嫩枝和葉中。然而，植物在它們吸收硅的能力上有很大的不同，由此引起它們從Si攝食受益的能力上的可變性。在接近500個植物物種的一項調查中，將這些植物按照它們的硅積聚情況分成三組1)高的Si積聚植物，包括禾本科(草)；2)中等積聚植物，包括葫蘆科；以及3)低積聚植物，包括大多數其他植物物種(對于一個匯總，參見Maand Takahashi, Soil， Fertilizer, and Plant Silicon Research in Japan， AmsterdamrElsevier Science, 2002)。例如，當在包含45ppm SiO2 (在pH 6. O下在溶液中)的土壤中生長時，禾本科植物例如燕麥、黑麥、以及黑麥草，包含2. 04%、2.41%、以及2. 34%的SiO20相比之下，絳三葉草、豌豆、以及芥菜，在相同的土壤中對應地包含O. 12%,O. 25%、以及 O. 15% 的 SiO2 (Jones et al, Advances in Agronomy, 107-149,1967)。在娃積聚上的差異已經歸結于根吸收Si的能力，由此植物將具有以下三種吸收方式的一種主動的、被動的、或拒絕吸收。硅是地球表面上最豐富的元素之一，但是其在植物生長中的本質還沒有被清楚地證實(Epstein, Silicon in Agriculture. Datnoff et al. , eds. New York ElsevierScience ；2001 :1-15 ；Epstein, Proc Natl Acad Sci USA 91 :11-17,1994 ；Epstein, AnnuRev Plant Physiol Plant MoI Biol50 :641_664，1999)。雖然其在植物中營養作用似乎有限，有越來越多的證據表明硅吸收在保護使免受生物性以及非生物性脅迫中起一種重要的 作用。許多報告已經隱含在營養缺乏或過剩的情況中硅改善植物生長。硅施肥也已經與植物對疾病的增強的耐受性相關聯，這些疾病包括發生在小麥、大麥、玫瑰、黃瓜、甜瓜、西葫蘆、南瓜、葡萄、以及蒲公英上的白粉病病原體，以及其他疾病(例如發生在水稻上的稻瘟病(灰梨孢菌)和褐斑病(稻平臍蠕孢菌)，發生在黃瓜上的由終極腐霉菌和瓜果腐霉菌所引起的灰葡萄孢、蔓枯病(Didymella bryoniae)、鐮孢菌枯萎病(Fusarium wilt)、以及根腐病)。在水稻中已經識別了三種娃轉運蛋白(Ma et al. , Nature 440 :688-691, 2006 ；Ma et al. , Nature 448 :209-212,2007 ；Yamaji et al, The Plant Cell 20 :1381-1389,2008)，包括兩種硅流入轉運蛋白(SIIT1、也稱為Lsil，SEQ ID NO :3和5，以及SIIT2、也稱為 Lsi6;SEQ ID NO :55 和 62)和一種 Si 流出轉運蛋白(SIET1、也稱為 Lsi2 ;SEQ ID NO :28和30)。預測該流入轉運蛋白SIITl和SIIT2是類似于水通道蛋白aquaporins的膜蛋白。這些蛋白屬于NIP亞家族(Nod26-樣主要內在蛋白)。該通道由六個跨膜區段(TM)、兩個親水性的環(在TM3與TM4之間的HL3 ;在TM4與TM5之間的HL4)、以及兩個Asn-Pro-Ala (NPA)基序，在aquaporins中保守的一種安排組成。一種孔結構和可能決定選擇性的水滲透性的收縮是用HL3與在細胞外側的該第二 NPA結構域(NPA2)以及用HL4與在該細胞質膜中該第一 NPA結構域(NPAl)裝配的。該NPA盒子對于aquaporins的三維結構的正確裝配可能是重要的，因為在NPA盒子附近具有突變的這類蛋白可能被不適當地折疊。該SIITl轉運蛋白的表達似乎是位于具有通過硅水平調節的一種組成型表達的根中。該轉運蛋白SIIT2似乎是在該根尖中以及在葉鞘和葉片的木質部薄壁組織細胞中表達的。預測編碼具有11個跨膜結構域的一種膜陰離子轉運蛋白的水稻的硅流出基因與該硅流入轉運蛋白SIITl沒有相似性。SIETl是一種有活性的流出轉運蛋白。在根中SIETl的表達似乎遵循SIITl的一樣的模式，但是位于外胚層和內胚層細胞的近端側，然而SIITl是位于根細胞的遠端側。SIIT2也顯示在木質部薄壁組織細胞中在面對該木質部維管側的極性的定位。SIIT2被認為涉及Si從該木質部轉運出Si并且轉運進入這些葉子中。多核苷酸我們已經從小麥、燕麥、大麥、高粱、以及木賊中識別并且克隆了硅轉運蛋白。因此，本發明的特征在于具有與在此所說明的這些多核苷酸的任何一種基本上一致的多核苷酸、或這類多核苷酸的片段。在某些實施方案中，這些多核苷酸可以編碼有功能的硅轉運蛋白多肽(例如當在一種細胞中表達時能夠增加硅流入或流出的多肽)。本發明的示例性的多核苷酸的識別在以下更詳細地進行說明。本發明的特征還在于在此所說明的這些多核苷酸的片段。這類片段也可以編碼有功能的硅轉運蛋白多肽。較短的片段可以被用作為引物、或可以編碼抗原性的多肽序列。片段可以包括該轉運蛋白的跨膜區段、或親水性的環。在植物中硅流入轉運蛋白的識別通過BLAST搜索，我們已經在小麥、燕麥、大麥、以及木賊中識別了硅轉運蛋白序列。使用小麥EST數據庫，我們在小麥中識別了一種轉運蛋白序列并且稱這種序列為SIITl小麥Si-轉運基因(SEQ ID NO 2) 將該小麥cDNA、編碼序列(SEQ ID NO :4)、以及該296個氨基酸的小麥多肽序列(SEQ ID NO 6)與對應的水稻序列(SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 5)進行比較揭示對應地70 %、84. 2 %、以及82 %的一致性。然后我們克隆了來自從水栽培養回收的小麥植物栽培品種HY644的一種SIITl基因。將根冷凍在液氮中，使用一種研缽壓碎并且使用來自QIAGen的一種RNA純化試劑盒提取總RNA并且儲存在-80°C。使用逆轉錄酶(Superscript III, Invitrogen)用oligodT引物制備總cDNA。引物IF (TCCCTCCTCACCTCCTCAAGAAG (SEQ ID NO :7))以及2R (AGCTTGAAGGAGGAGAGCTTCTG (SEQ ID NO :8))用于在小麥 cDNA 制品中通過 PCR 證實該轉運基因的存在。在94°C下進行PCR持續120秒；隨后94°C的30個循環持續30秒；62°C持續30秒；以及72°C 90秒；隨后72°C 10分鐘。IOOng的小麥cDNA與O. 2 μ M的每種引物一起使用。這種PCR反應擴增一種700bp片段，然后將它測序(SEQ ID NO 9)并且與該數據庫EST序列進行比較。使用ClustalW程序SEQ ID NO 9的序列分析表明在659bp重疊的序列上有98. 9%的一致性。這些差異很可能通過用于獲得在該數據庫中SEQ ID NO :4的栽培品種與在我們的實驗中使用的該栽培品種的種類來解釋。然后我們設計了兩個額外的反向引物3R(CGAAGATGGACGTAATGCAAACC(SEQ ID NO:10))以及IR(CGCCCAGTAGAACGGAACCT(SEQ ID NO :11))以便識別在其他植物物種中的硅轉運蛋白同系物。從包括Torka小麥栽培品種、ACCA大麥栽培品種、Rigodon燕麥栽培品種、以及木賊的植物中獲得總cDNA。將植物生長在一個培養箱中在一個充滿Promix PGX生長培養基(Premier Horticulture,Riviere-du-Loup, ()ιι !.χχ、，加拿大)6cm的塑料盆中。生長之后，將根回收、在蒸餾水中洗滌從而去除所有痕量的Promix底物，在液氮中冷凍、并且使用一種研缽壓碎。使用來自QIAGen的一種RNA純化試劑盒提取總RNA。使用來自Invitrogen的Superscript III逆轉錄酶使用一種oligodT引物獲得總cDNA。將所獲得的cDNA保存在-20°C下。使用表I所示的這些引物對在Torka小麥栽培品種、ACCA大麥栽培品種、Rigodon燕麥栽培品種、以及木賊中檢出一種硅-轉運基因的存在。表I:使用的引物
權利要求
1.一種基本上純的多核苷酸，其是與SEQ ID NO: 50的核苷酸序列具有至少85%—致性的核酸序列。
2.如權利要求I所述的多核苷酸，其中在一種細胞中由所述多核苷酸編碼的該多肽的表達能夠增加進入所述細胞的硅轉運。
3.如權利要求I所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少95%。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其中所述一致性是至少99%。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其是SEQID N0:50的核苷酸序列。
6.如權利要求I所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在長度上小于20kB。
7.如權利要求I所述的多核苷酸，該多核苷酸被可操作地連接至一種啟動子上。
8.如權利要求7所述的多核苷酸，其中所述啟動子能夠在一種植物細胞中表達。
9.如權利要求8所述的多核苷酸，其中所述植物細胞是一種根細胞。
10.一種載體，包括如權利要求7所述的多核苷酸。
11.如權利要求10所述的載體，進一步包括對一種硅流出轉運蛋白進行編碼的一種第二多核苷酸。
12.如權利要求11所述的載體，其中所述第二多核苷酸與選自下組的一個核酸序列具有至少80%的一致性，該組的組成為SEQ ID NO:28、29、71、以及73。
13.—種基本上純的多肽，該多肽由如權利要求I所述的多核苷酸編碼。
14.一種生成具有增加的硅吸收的植物的方法，所述方法包括 (a)提供一種與SEQID NO:50的多核苷酸具有至少85%—致性的核酸的第一載體； (b)用所述載體轉化一種植物細胞；并且 (C)從所述細胞生長一種植物,其中所述植物表達所述多核苷酸，由此生成一種具有增加的硅吸收的植物。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述載體進一步包括對一種硅流出轉運蛋白進行編碼的一個第二序列。
16.如權利要求14所述的方法，其中用一種第二載體與所述第一載體同時地或順序地將所述細胞進一步轉化，該第二載體包括對一種硅流出轉運蛋白進行編碼的一個第二序列。
17.如權利要求15或16所述的方法，其中所述第二序列與選自下組的一種序列具有至少80%的一致性，該組的組成為SEQ ID NO:28、29、71、以及73。
18.如權利要求14所述的方法，其中所述植物細胞是一種大豆細胞。
全文摘要
基于我們在已知有效吸收硅的植物(包括小麥、木賊、燕麥、高粱、以及大麥)中對硅流入和流出轉運蛋白基因的識別，本發明的特征在于對硅轉運蛋白進行編碼的多核苷酸；包括這類多核苷酸的載體、細胞、以及植物；以及用于制造這類植物的方法。本發明的特征還在于硅轉運蛋白多肽以及它們的片段。表達異源的硅轉運蛋白的植物可以顯示增加的硅吸收以及對生物性和非生物性脅迫的增強的耐受性二者。具體而言，表達硅轉運蛋白的植物例如大豆可以顯示對病原體例如銹菌的增強的耐受性。
文檔編號A01H5/00GK102943078SQ20121034384
公開日2013年2月27日 申請日期2009年3月24日 優先權日2008年3月24日
發明者理查德·貝朗葛, 維爾弗雷德·雷穆斯-博雷爾, 卡洛琳·格萊戈瓦 申請人:拉瓦爾大學