專利名稱：一株根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌yc0136及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136及其應用，屬于微生物技術領域，主要是ー株多粘類芽孢桿菌能有效促進煙株生長并誘導其系統(tǒng)抗性。
背景技術：
煙草黑胚病(Phytophthoraparasitica var. nicotianae)是我國發(fā)生最為嚴重的煙草土傳病害之一，其造成的年均損失12303. 38萬元，僅次于病毒病。目前我國主要采用甲霜靈等化學農(nóng)藥來防治該病，但是長期使用化學農(nóng)藥容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導致防治效果下降。此外，長期、反復和大量使用化學農(nóng)藥可引起土壌、水體和大氣的污染，同時也殺傷了其他有益微生物、昆蟲和畜禽，破壞了生態(tài)平衡。生物防治越來越受到人們的重 視，其中利用植物根際促生細菌(PGPR)防治土傳病害成為生物防治的重要研究領域。利用PGPR誘導系統(tǒng)抗性使煙草具有對多種病害的抵抗能力在煙草生產(chǎn)中具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一株根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136及其應用，目的是研究煙草黑胚病拮抗菌多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136的防病和促生效果，并且通過測定煙草抗性相關生理指標來探討其對煙株系統(tǒng)抗性的誘導作用，為拮抗菌在煙草田間的應用提供理論依據(jù)。本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)—株分離自貴州煙田根際土壤的多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)菌株編號為YC0136,平板對峙實驗中對煙草寄生疫霉(Phytophthora nicotianaevar.nicotianae)和煙草青枯病病原菌爺科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)具有很強的拮抗能力。該菌株分類命名為PaenibacilluspolymyxaYC0136,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。以菌株YC0136的總DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物(27F :5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 1495R :5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ )進行 PCR 擴增，得到約為I. 4kb的擴增產(chǎn)物，其核苷酸序列如SEQ NO. I所示。根據(jù)GenBank序列Blast比對，菌株YC0136與多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDSM 8320 的 16S rDNA 序列相似性達 99%。結合菌株的生理生化特征，將YCO13 6初歩鑒定為多粘類芽孢桿菌，命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的菌落和菌體特征為在LB平板上培養(yǎng)24h后呈圓形不透明，微黃，表面干燥；產(chǎn)芽抱，卵圓形，芽孢囊膨大，G+，細胞桿狀。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的生理生化特征為接觸酶試驗陽性，氧化酶實驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，淀粉水解試驗陽性，吲哚試驗陰性，檸檬酸鹽利用試驗陰性，運動性試驗陽性，葡萄糖產(chǎn)酸，果糖產(chǎn)酸，蔗糖產(chǎn)酸，甘露醇產(chǎn)酸。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的培養(yǎng)條件為菌株活化采用LB培養(yǎng)基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml。搖瓶發(fā)酵采用豆芽汁培養(yǎng)基黃豆芽200g，蔗糖20g，蒸餾水1000mL。30°C、170r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3d。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株可以用于制備微生物菌齊U。應用時，培養(yǎng)菌種，得菌懸液，作為液態(tài)肥料，菌懸液的濃度優(yōu)選為I. OX IO8CfuAil。溫室盆栽試驗結果表明，煙草根際接種多粘類芽孢桿菌(Paenibocilluspolymyxa) YC0136顯著降低了黑胚病病情指數(shù)，定植35d后溫室相對防效達到95. 9%，防治效果好于甲霜靈錳鋅，同時能夠促進煙草的生長發(fā)育。對煙草根系發(fā)育的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)接種拮抗菌能夠促進煙草的根部生長，根系活力高于對照。接種YC0136后在不同時期測定了煙草葉片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL的活性和葉綠素、電解質(zhì)相對滲透率等生理指標，發(fā)現(xiàn)拮抗細菌YC0136誘導系統(tǒng)抗性好于化學誘導因子(甲霜靈錳鋅)，葉片中幾 種防御酶活性和葉綠素含量均顯著高于對照，電解質(zhì)相對滲透率比對照有所降低，同時溫室試驗中發(fā)現(xiàn)接種拮抗菌的煙草花葉病發(fā)病率比對照有所降低，最高幅度可達33. 33%，以上結果證明生防細菌可誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強煙草對病害的抵抗力。煙草定植60d時，生防細菌誘導系統(tǒng)抗性作用最為顯著，此時也是煙草田間病害的高發(fā)期，誘導作用在煙草生長后期仍有一定體現(xiàn)。結果表明拮抗菌YC0136能有效防治煙草黑脛病、促進煙株生長，具有良好的應用潛力。保藏信息一株多粘類芽抱桿菌YC0136 (Paenibacilluspolymyxa),于 2012 年 8月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號=CGMCCNO. 6475。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進ー步的說明。實施例I菌株的特性及其鑒定(I)菌株的分離篩選土壤樣品來自貴州煙田根際土壌。供試病原菌為煙草寄生疫霉(Phytophthoranicotianaevar. nicotianae)和煙草青枯病病原菌爺科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)。分離用培養(yǎng)基為馬鈴薯鹿糖培養(yǎng)基(PDA)和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)。拮抗菌的分離采用樣品梯度稀釋法得到分離物。采用平板對峙法篩選拮抗菌將馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基倒平板，用接種鋤將活化好的病原真菌切成黃豆粒般大小的塊狀，置于平板中央，于28°C培養(yǎng)2cT3d，待病原真菌長到直徑為2cm時，用接種環(huán)挑取分離物，從靠近病原真菌的一側沿與其生長方向相交的方向劃線接種，每個培養(yǎng)皿接種6-8個試驗菌，于28°C培養(yǎng)24tT48h，根據(jù)有無抑菌帶及抑菌帶的大小判斷其拮抗效果。篩選得到ー株煙草根際拮抗菌，其分類命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YCO136,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。(2)多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株的菌落和菌體特征在LB平板上30°C培養(yǎng)24h后呈圓形不透明，微黃，表面干燥；產(chǎn)芽孢，卵圓形，芽孢囊膨大，G+，細胞桿狀。(3)多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株的生理生化特征接觸酶試驗陽性，氧化酶實驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，淀粉水解試驗陽性，吲哚試驗陰性，檸檬酸鹽利用試驗陰性，運動性試驗陽性，葡萄糖產(chǎn)酸，果糖產(chǎn)酸，蔗糖產(chǎn)酸，甘露醇產(chǎn)酸。(4) 16S rDNA 序列分析 PCR 擴增 16S rDNA 序列采用常規(guī)方法提取細菌總DNA，以細菌總DNA為模板，27F和1495R作引物擴增YCO136 的 16S rDNA 序列。PCR 反應條件為95°C 5min，94°C lmin，56°C lmin，72°C I. 5min,30個循環(huán)，72 °C延伸lOmin。用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(3S SpinAgaroseGel DNA purification kit)純化 PCR 產(chǎn)物。16S rDNA序列測定及分析測序由上海博尚生物技術有限公司完成。測序結果用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST進行相似性分析。16S rDNA基因序列提交GenBank，其登錄號為EU430119. I。將所測16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對，結果表明YC0136的16S rDNA序列與PaenibacilluspolymyxaDSM 8320的16S rDNA序列相似性達99%。結合菌落形態(tài)，生理生化特征和16S rDNA序列分析,將其鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。實施例2制備菌劑多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的最適培養(yǎng)條件為菌株活化采用LB培養(yǎng)基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml。搖瓶發(fā)酵采用豆芽汁培養(yǎng)基黃豆芽200g，蔗糖20g，蒸餾水lOOOmL。30°C、170r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3d。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株可以用于制備微生物菌齊U。在LB培養(yǎng)基上劃線接種于30°C溫箱培養(yǎng)過夜，然后取菌種接種至三角瓶液體豆芽汁培養(yǎng)基，30°C搖床轉速為170r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3d，得菌懸液，作為液態(tài)肥料，使用時進行稀釋至菌懸液的濃度為I. OX 108CfU/ml最佳，最高稀釋倍數(shù)可以達到200倍，稀釋菌液作為液態(tài)肥料可以浸根、灌根或噴施。實施例3盆栽試驗將煙草盆栽試驗在日光溫室內(nèi)進行，設置三個處理，其中A處理接種多粘類芽孢桿菌(PaenibaCilluSpOlymyXa)YC0136菌液；B處理為施加甲霜靈錳鋅作為藥劑對照；C處理為發(fā)病對照。每處理五次重復，每重復三棵煙苗。選擇長勢一致的5-6片真葉期的煙苗，移栽前將煙草幼苗在I X 108CFU/mL濃度的YC0136菌液中浸根30min，然后將煙苗移栽至盆中，藥劑對照和發(fā)病對照采用培養(yǎng)基浸根。緩苗3天后用移液槍頭將相應的YC0136菌懸液(I X 108CFU/mL)灌入煙株根際，每株煙4mL菌液，同時取ImL菌液淋于莖基部，發(fā)病對照接入等量培養(yǎng)基，藥劑對照采用58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑500倍稀釋液澆灌處理，每盆150mL。Id后將配制好的黑脛病游動孢子菌懸液(IO4個/mL)灌接于各處理煙苗根部，接種量為5mL/株。其余按照溫室常規(guī)管理，澆水保濕以利于發(fā)病。(I)拮抗菌多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136對煙草病害的防治效果表I拮抗菌對煙草黑脛病溫室防效
權利要求
1.一株保藏編號為CGMCC NO. 6475的根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136(Paenibacilluspolymyxa),其特征在于已于2012年8月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.如權利要求I所述的根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136在煙草中的應用，可防治煙草黑脛病、促進煙草根系的發(fā)育，提高煙草的根系活力，促進煙株生長。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136及其應用，目的是研究煙草黑脛病拮抗菌多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136的防病和促生效果，并且通過測定煙草抗性相關生理指標來探討其對煙株系統(tǒng)抗性的誘導作用，為拮抗菌在煙草田間的應用提供理論依據(jù)；本發(fā)明分離得到的菌株能有效防治煙草黑脛病、促進煙株生長，具有良好的應用潛力。
文檔編號C05F11/08GK102851250SQ20121034806
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權日2012年9月18日
發(fā)明者丁延芹, 姚良同, 杜秉海 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學, 德州創(chuàng)迪微生物資源有限公司