專利名稱：百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法
技術領域：
本發明涉及超低溫保存領域，具體涉及一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法。
背景技術：
百子蓮(Agapanthus praecox ssp. orientalis)又稱‘藍百合’，為多年生根莖類花卉，原產非洲南部地區。百子蓮葉形秀麗，花朵姿態優美，花色淡雅，花期持續時間長，具備抗逆性強，觀賞性強的特點，從其葉片及根莖的藥用成分利用到花的觀賞，從庭院栽培到切花生產，擁有較高的觀賞價值及應用價值，是西方發達國家高檔鮮切花、盆花和沿海公園地被材料，也是除玫瑰花之外最能表達愛意的愛情花。為了快速繁殖引進的優良種質資源，需要開展百子蓮優良種質資源無性擴繁技術研究。但發現百子蓮胚性愈傷組織增殖速率在繼代3周左右達到最大，以后開始逐漸下降。為維持較高的細胞增殖速率，必須每隔2 3周繼代一次，但長時間連續繼代在高濃度激素增殖培養基上會引起細胞胚性喪失或胚胎敗 育等問題。而胚性細胞長時間繼代培養引起胚性喪失是植物體細胞胚胎發生中普遍存在的一個問題。重復啟動胚性愈傷組織誘導不僅費時、費力、費錢，還有可能引起體細胞變異，無法為新品種的培育提供充分的材料。因此，研究建立一套細胞存活率高、遺傳性穩定的百子蓮胚性愈傷組織超低溫保存技術體系是亟待解決的技術問題。超低溫保存(Cryopreservation)是上世紀70年代發展起來的一項現代種質資源離體保存技術。通常在液氮中保存，被保存材料細胞內的物質代謝和生長活動幾乎完全停止，處在相對穩定的生物學狀態，達到長期保存種質的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續繼代的中長期保存方式。玻璃化法(Vitrification)超低溫保存是將細胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護劑組成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結晶的玻璃化態，并以這種玻璃態在低溫下保存。該方法具有簡便、成本低、保存材料遺傳性穩定等優點。國內外先后對200多種植物的不同外植體進行了超低溫保存技術研究，但有些植物(如熱帶植物或者含水量高的植物)恢復培養后成活率不高或根本不能成活，百子蓮屬于熱帶植物，其胚性愈傷組織含水量較高，是較難保存的植物材料，百子蓮超低溫保存技術也尚未見報道。

發明內容
本發明的目的在于針對現有無性擴繁技術的不足，提供一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，用于百子蓮種質資源的保存，為體細胞胚發生成苗以及新品種培育材料供給提供了一條有效途徑，將對熱帶及含水量較高的植物資源的保存以及無性擴繁技術體系的完善起到指導作用。本發明首先公開了一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，為對百子蓮胚性愈傷組織進行低溫-高滲預處理后，依次置于裝載液和玻璃化溶液中進行脫水處理，最后將脫水處理后的胚性愈傷組織重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中進行保存。
較優的，所述百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法具體步驟如下I)低溫-高滲預處理將百子蓮胚性愈傷組織置于預處理培養基中，4°C培養；2)脫水處理將步驟I)預處理后的百子蓮胚性愈傷組織置于裝載液內脫水處理后，吸除表面的裝載液，再置于玻璃化溶液中，于0°c進一步脫水處理；3)液氮保存除去步驟2)進一步脫水處理所使用的玻璃化溶液，重新添加新的玻璃化溶液后，迅速轉入液氮中進行保存。較優的，步驟I)所述百子蓮胚性愈傷組織是指繼代培養20d，易碎、松散的百子蓮胚性愈傷組織。更優的，所述繼代培養的培養基為含有I I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養基。較優的，步驟I)所述預處理培養基是蔗糖含量為O. 3 O. 7M的MS固體培養基； 預處理的培養時間為I 5d。更優的，步驟I)所述預處理培養基為含有O. 5M蔗糖的MS固體培養基；預處理的培養時間為2d。步驟I)所使用的預處理培養基的其他成分與MS固體培養基相同，僅將MS固體培養基中3wt%的蔗糖含量替換為O. 3 O. 7M的蔗糖含量。較優的，步驟2)所述裝載液為含有2M丙三醇、O. 4M蔗糖、IOmM KNOj^MS培養液。較優的，步驟2)所述玻璃化溶液為含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt% 二甲基亞砜、O. 4M蔗糖的MS培養液。較優的，步驟2)裝載液脫水處理的時間為20 80min，玻璃化溶液脫水處理的時間為20 80min。更優的，步驟2)裝載液脫水處理的時間為60min，玻璃化溶液脫水處理的時間為40mino本發明另一方面公開了一種針對上述百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存的解凍及恢復培養方法，為將玻璃化超低溫保存的胚性愈傷組織從液氮中取出，置于35 40°C水浴中快速解凍，然后用洗滌液洗滌，再吸干表面的洗滌液，最后轉入恢復培養基中進行恢復培養。較優的，35 40°C水浴中快速解凍的時間為I 2min，優選的為2min。較優的，所述洗滌液為含有I. 2M蔗糖和IOmM KNO3的MS培養液。較優的，使用洗滌液洗滌2 4次，每次8 12min。優選的，使用洗滌液洗滌3次，每次lOmin。較優的，所述恢復培養基為含有I I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養基。更優的，所述恢復培養基為含有I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養基。本發明所使用的恢復培養基的其他成分與MS固體培養基相同，僅增加了 I
I.5mg/L含量的毒莠定。較優的，所述恢復培養的條件為黑暗環境，恢復培養的溫度為23 27°C。更優的，所述恢復培養的條件為黑暗環境，恢復培養的溫度為25°C。本發明所述MS固體培養基的組成為現有的MS固體培養基組成，本發明所述MS培養液的組成比MS固體培養基的組成少了蔗糖和瓊脂兩種成分，其他組成不變；并且本發明的MS培養液還可以根據需要添加外源物質，例如醇類、蔗糖等。
本發明所使用的MS固體培養基為IL培養基中含有1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mgKH2P04，370mg MgSO4 ·7Η20，440mg CaCl2 ·2Η20，37. 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 ·7Η20，IOOmg肌醇,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸批B多醇,O. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸,O. 83mgKI,6. 2mgH3BO3, 22. 3mg MnSO4 ·4Η20,8. 6mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mg Na2MoO4 *2H20,0. 025mg CuSO4 · 5H20,0. 025mg CoCl2 · 6H20，30g蔗糖，IOg瓊脂粉，余量為水，調整培養基pH為5. 8。本發明所使用的MS培養液為IL培養基中含有1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mgKH2PO4, 370mg MgSO4 · 7H20,440mg CaCl2 · 2Η20，37· 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20,IOOmg肌醇,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸批B多醇,0. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸,0. 83mgKI,6. 2mgH3BO3, 22. 3mg MnSO4 *4H20,8. 6mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mg Na2MoO4 *2H20,0. 025mg CuSO4 · 5H20,0. 025mgCoCl2 · 6H20，余量為水，調整培養基pH為5.8。在液氮中保存時間的長短對胚性愈傷組織存活率沒有影響，因此，可以實現百子蓮胚性愈傷組織長期保存的目的。 本發明通過對玻璃化超低溫保存過程中處理方法、條件、試劑的特殊設計實現了百子蓮胚性愈傷組織的超低溫保存，為百子蓮種質資源的保存提供了技術保證，為體細胞胚發生成苗以及新品種培育材料供給提供了一條有效途徑，將對熱帶或含水量較高的植物資源的保存以及無性擴繁技術體系的完善起到指導作用。


圖I :恢復培養30d胚性愈傷組織增殖狀態圖2 :恢復培養65d胚性愈傷組織增殖狀態
具體實施例方式在進一步描述本發明具體實施方式
之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。實施例II.實驗材料I. I實驗對象百子蓮胚性愈傷組織在含有I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養基中，25°C增殖20d，獲得的易碎、松散的胚性愈傷組織作為玻璃化超低溫保存的實驗對象(制備方法可參考文獻“藍百合快速繁殖技術的研究”，范現麗，2009，上海交通大學碩士學位論文)。I. 2實驗試劑I. 2. I裝載液為含有2M丙三醇、O. 4M蔗糖、IOmM KNO3的MS培養液。I. 2. 2玻璃化溶液為含有30 七％丙三醇、15wt%乙二醇、15wt% 二甲基亞砜、O. 4M蔗糖的MS培養液。I. 2. 3洗滌液為含有I. 2M蔗糖和IOmM KNO3的MS培養液。1.2.4預處理培養基是蔗糖含量分別為O. 3M、0. 5M、0. 7M的MS固體培養基I. 2. 5恢復培養基為含有I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養基。I. 2. 6MS 固體培養基IL培養基中含有 1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4,370mgMgS04 · 7H20，440mg CaCl2 · 2Η20，37· 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌酉享,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸卩比卩多醇,0. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸，O. 83mgKI,6. 2mg H3BO3,22. 3mgMnS04 ·4Η20,8. 6mg ZnSO4 ·7Η20,0. 25mg Na2MoO4 ·2Η20,0. 025mg CuSO4 ·5Η20,0. 025mgCoCl2 · 6H20，30g蔗糖，IOg瓊脂粉，余量為水，調整培養基pH為5.8。I. 2. 7MS 培養液1L 培養基中含有 1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4,370mgMgS04 · 7H20，440mg CaCl2 · 2Η20，37· 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌酉享,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸卩比卩多醇,0. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸，O. 83mgKI,6. 2mg H3BO3,22. 3mgMnS04 ·4Η20，8· 6mg ZnSO4 ·7Η20，0· 25mg Na2MoO4 ·2Η20，0· 025mg CuSO4 ·5Η20，0· 025mgCoCl2 · 6Η20，余量為水，調整培養基pH為5. 8。2.實驗方法2. I低溫-高滲預處理培養基的篩選
通過蔗糖調節預處理培養基的滲透壓，使預處理培養基成分為分別含有O. 3、0. 5、O. 7M蔗糖的MS培養基，取三份相同的百子蓮胚性愈傷組織分別在上述三種含不同蔗糖濃度的MS培養基中4°C條件下預處理2d后，放入裝載液中室溫下脫水處理40min，吸除愈傷組織表面的裝載液，再放入玻璃化溶液中于0°C進一步脫水40min、換上新的玻璃化溶液后，迅速放入液氮保存lh。超低溫保存Ih后，將三組胚性愈傷組織從液氮中取出，置于40°C水浴中快速解凍，然后用培養液洗滌3次，再用無菌濾紙吸干表面的培養液，最后轉入恢復培養基中進行恢復培養，恢復培養為黑暗條件25°C。表I不同滲透壓培養條件對玻璃化超低溫保存百子蓮胚性愈傷組織相對存活率的影響
權利要求
1.一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，為對百子蓮胚性愈傷組織進行低溫-高滲預處理后，依次置于裝載液和玻璃化溶液中進行脫水處理，最后將脫水處理后的胚性愈傷組織重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中進行保存。
2.如權利要求I所述的超低溫保存方法，其特征在于，具體步驟如下 1)低溫-高滲預處理將百子蓮胚性愈傷組織置于預處理培養基中，4°C培養； 2)脫水處理將步驟I)預處理后的百子蓮胚性愈傷組織置于裝載液內脫水處理后，吸除表面的裝載液，再置于玻璃化溶液中，于0°C進一步脫水處理； 3)液氮保存除去步驟2)進一步脫水處理所使用的玻璃化溶液，重新添加新的玻璃化溶液后，迅速轉入液氮中進行保存。
3.如權利要求2所述的超低溫保存方法，其特征在于，步驟I)所述百子蓮胚性愈傷組織為繼代培養20d，易碎、松散的百子蓮胚性愈傷組織。
4.如權利要求3所述的超低溫保存方法，其特征在于，所述繼代培養的培養基為含有I I. 5mg/L毒莠定的MS固體培養基。
5.如權利要求2所述的超低溫保存方法，其特征在于，步驟I)所述預處理培養基是蔗糖含量為O. 3 O. 7M的MS固體培養基；預處理的培養時間為I 5d。
6.如權利要求I或2任一權利要求所述的超低溫保存方法，其特征在于，所述裝載液為含有2M丙三醇、O. 4M蔗糖、IOmM KNO3的MS培養液；所述玻璃化溶液為含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt% 二甲基亞砜、O. 4M蔗糖的MS培養液。
7.如權利要求I或2任一權利要求所述的超低溫保存方法，其特征在于，裝載液脫水處理的時間為20 80min，玻璃化溶液脫水處理的時間為20 80min。
8.一種針對權利要求1-7任一權利要求所述百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法的解凍及再培養方法，為將玻璃化超低溫保存的百子蓮胚性愈傷組織從液氮中取出，置于35 40°C水浴中快速解凍，然后用洗滌液洗滌，再吸干表面的洗滌液，最后轉入恢復培養基中進行恢復培養。
9.如權利要求8所述的解凍及再培養方法，其特征在于，所述洗滌液為含有I.2M蔗糖和IOmM KNO3的MS培養液。
10.如權利要求8所述的解凍及再培養方法，其特征在于，所述恢復培養基為含有I .1.5mg/L毒莠定的MS固體培養基，所述恢復培養的條件為黑暗環境，恢復培養的溫度為.23 27。。。
全文摘要
本發明涉及超低溫保存領域，具體涉及一種百子蓮胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，為對百子蓮胚性愈傷組織進行低溫-高滲預處理后，依次置于裝載液和玻璃化溶液中進行脫水處理，最后將脫水處理后的胚性愈傷組織重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中進行保存。本發明通過對玻璃化超低溫保存過程中處理方法、條件、試劑的特殊設計實現了百子蓮胚性愈傷組織的超低溫保存，為百子蓮種質資源的保存提供了技術保證，為體細胞胚發生成苗以及新品種培育材料供給提供了一條有效途徑，將對熱帶或含水量較高的植物資源的保存以及無性擴繁技術體系的完善起到指導作用。
文檔編號A01H4/00GK102823582SQ201210349629
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者申曉輝, 李曉丹, 任麗, 張荻 申請人:上海交通大學