專利名稱：一種花藥愈傷組織繼代培養獲得橡膠樹胚狀體的方法
技術領域：
本發明屬于植物組織和細胞工程領域，具體地說，涉及一種花藥愈傷組織繼代培養獲得橡膠樹胚狀體的方法。
背景技術：
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橡膠樹體胚植株具有生長快、產量高等優點，其產量較同源老態芽接無性系増加25. 8% 66. 3%，生長快10% 20%，是天然橡膠產業發展的新一代種植材料。世界上最早的橡膠樹體胚植株是我國于1977年通過花藥再生的。隨后，馬來西亞、印度也得到了花藥植株。但是植株誘導頻率均很低。在組織培養過程中發現，體胚誘導頻率低、正常胚狀體比例低是影響橡膠樹花藥培養發展的重要限制因子，因此如何培養出數量多、質量好的胚狀體成為橡膠樹組織培養工作者30多年來的主要研究方向。研究者主要從愈傷誘導及體胚分化培養基的大量元素、激素配比、蔗糖純度、椰子水的質量、活性炭的添加及培養溫度等進行研究。經過30多年的努力，體胚誘導頻率得到了有效提升，但總體仍偏低。培養基必須與好的培養方式搭配才能取得最好的效果。而至今依然沿用最初的培養方式，即花藥一愈傷組織一體胚一植株再生。組織切片結果表明，花藥愈傷組織在I 4周處于細胞啟動期和細胞分裂期，此時愈傷組織開始形成并迅速増殖。4周后開始啟動分化，愈傷組織邊增殖邊分化，5周看到大量的胚性細胞團。因此推斷4周是花藥愈傷組織分化的關鍵時期，與此前愈傷誘導擔負著完全不同的使命，是啟動體胚分化的時間節點。而一直沿用的培養方式仍將其放在誘導愈傷組織的培養基，可能是導致胚狀體誘導頻率偏低的ー個原因。2011年梁國平等研究了繼代次數對橡膠樹花藥愈傷組織體胚分化的影響，研究以40天的愈傷組織作為繼代的起始材料，繼代培養基同愈傷誘導培養基，共繼代8次，結果表明繼代I次的體胚分化率最高。最優條件下，體胚分化率為70. 8%，而不繼代時體胚分化率為39.8%。但是在研究中發現，直接以初代培養基作為繼代培養基并不能提高體胚分化率，不繼代的體胚分化率為35%，而直接以初代培養基作為繼代培養基的體胚分化率為21.8%。而且2011年梁國平等的研究以40天的花藥愈傷組織作為起始材料，此時已達最大愈傷生長量，組織切片可看到胚性母細胞或原胚，不適合繼代培養。

發明內容
本發明的目的是提供一種高效獲得橡膠樹體細胞胚狀體的方法，以滿足生產和實驗的需要。為了實現本發明的目的，本發明所述的ー種花藥愈傷組織繼代培養獲得橡膠樹胚狀體的方法，包括如下步驟(I)花藥初代愈傷組織的誘導以巴西橡膠樹花蕾為外植體，將花蕾進行表面消毒，花蕾的消毒過程是將花蕾用75%酒精表面消毒30 60秒后，用0. 1%氯化汞消毒10 15分鐘，再用無菌水沖洗3 6次，毎次3 5分鐘；然后將消毒好的花蕾中的雄蕊剝出，接種到誘導愈傷組織的誘導培養基上進行暗培養，培養溫度為24°C 30°C，暗培養28 35天，以誘導出橡膠樹花藥初代愈傷組織；所述的愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，并將MS培養基中磷酸ニ氫鉀、無水氯化鈣、一水硫酸錳、七水硫酸鎂的含量調整為磷酸ニ氫鉀350 500mg/L、無水氯化鈣150 400mg/L，一水硫酸錳10 40mg/L，七水硫酸鎂400 600mg/L ;并添加2,4-D (2，4-ニ氯苯氧こ酸)0.5 31^/しKT(激動素)0. 5 3mg/L、NAA (a-萘こ酸)
0.5 3mg/L、Phytage I (植物凝膠)2 4g/L、鹿糖50 90g/L和椰子水50 100ml/L。(2)愈傷組織繼代培養選取培養期處于28 35天的橡膠樹花藥初代愈傷組織，轉入愈傷組織繼代培養基暗培養，培養溫度為24°C 30°C，暗培養15 30天，培養出繼代胚性愈傷組織；
所述的橡膠樹花藥初代愈傷組織轉入愈傷組織繼代培養基的繼代培養次數為I次，待愈傷組織停止增殖時，立即轉入橡膠樹胚狀體誘導培養基；所述的愈傷組織繼代培養基的有效成份為改良的MS培養基和附加成份，改良的MS培養基的成份為七水硫酸鎂400 600mg/L，磷酸ニ氫鉀350 500mg/L，無水氯化鈣200 350mg/L，一水硫酸錳20 40mg/L，五水硫酸銅0. I 0. 3mg/L ；附加成份為6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)0. 01 I. 0mg/L、KT (激動素)0. 01 I. Omg/L, 3, 4-D (3，4- ニ氯苯氧こ酸)0. 05 I. Omg/L、ABA (脫落酸)0. 001 0. lmg/L、Phytagel (植物凝膠)2 3g/L、鹿糖50 90g/L、椰子水40 90ml/L。(3)胚狀體的誘導將繼代胚性愈傷組織轉入橡膠樹胚狀體誘導培養基進行暗培養，培養溫度為24°C 30°C，暗培養30 60天，以誘導出胚狀體；所述胚狀體誘導培養基的有效成分為改良的MS培養基，并添加6-BA0. 5 2mg/L、KT0. 5 4mg/L、NAAO. 05 lmg/L、GA3 (赤霉素)0. 01-lmg/L、Phytagel2 3g/L、鹿糖50 90g/L、活性碳I 2g/L、椰子水40 90ml/L。本發明ー種花藥愈傷組織繼代培養獲得橡膠樹胚狀體的方法的有益效果是(I)本發明通過愈傷組織繼代及對應愈傷組織繼代培養基的篩選，使愈傷組織更契合其發育過程，從而有效提高了胚狀體的誘導率。(2)本發明通過繼代培養基對橡膠樹花藥愈傷組織繼代，使其更利于胚性表達，經繼代培養基繼代后，體胚分化率大幅提高，比不繼代或繼代到愈傷組織誘導培養提高150% 200%，使得基于花藥再生體系的研究和生產效率大大提高，加速相關領域的發展。(3)本發明正常胚狀體誘導率高，獲得橡膠樹正常體細胞胚狀體的比例較對照大幅提高，是不繼代的2 3倍，很大程度上解決了橡膠樹組織培養畸形胚比例高的難題，為提高橡膠樹體胚植株誘導率奠定了良好的基礎。(4)本發明エ藝流程簡單，生產成本低，所采用的培養基成分易于獲取，具有很大的應用價值。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。選用橡膠樹優良無性系熱研7-33-97花蕾為外植體，將花蕾用75%酒精表面消毒30秒后，再用0. 1%氯化汞消毒15分鐘，最后用無菌水沖洗3次，毎次5分鐘。然后剝出雄蕊，接種到愈傷組織誘導培養基上進行暗培養，培養溫度為27°C，暗培養30天，誘導出橡膠樹花藥初代愈傷組織；接著選取花藥初代愈傷組織轉入繼代培養基暗培養，培養溫度為27°C，培養20天，培養出繼代胚性愈傷組織；最后將繼代胚性愈傷組織轉入橡膠樹胚狀體誘導培養基進行暗培養，培養溫度為25°C，暗培養60天，誘導出胚狀體。所述的愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，并將MS培養基中磷酸ニ氫鉀、無水氯化鈣、一水硫酸錳、七水硫酸鎂的含量調整為磷酸ニ氫鉀350mg/L、無水氯化鈣 200mg/L，一水硫酸錳 20mg/L，七水硫酸鎂 400mg/L ;并添加 2，4-D1. 5mg/L、KTL Omg/L、NAAI. Omg/L、Phytagel 2. 2g/L、鹿糖 80g/L、椰子水 70ml/L。 所述的愈傷組織繼代培養基的有效成份為改良的MS培養基和附加成份，改良的MS培養基的成份為七水硫酸鎂400mg/L，磷酸ニ氫鉀350mg/L，無水氯化鈣200mg/L，一水硫酸錳 20mg/L，五水硫酸銅 0. lmg/L ;附加成份為 6-BA0. 0lmg/L, KTO. 01mg/L,3, 4-DO. 05mg/L> ABAO. 001mg/L、Phytagel 2. 2g/L、鹿糖 50g/L、椰子水 40ml/L。所述的胚狀體誘導培養基的有效成分為改良的MS培養基，并添加6-BAlmg/L、KT2mg/L、NAAlmg/L、GA30. 01mg/L、Phytagel 2. 2g/L、鹿糖 70g/L、活性碳 lg/L、椰子水 40ml/し雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明創造作了詳盡的描述，但在本發明創造基礎上，可以對之作ー些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明創造精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明創造要求保護的范圍。
權利要求
1.一種花藥愈傷組織繼代培養獲得橡膠樹胚狀體的方法，包括花藥初代愈傷組織的誘導、愈傷組織繼代培養、胚狀體的誘導，其特征在于選取培養期處于28 35天的橡膠樹花藥初代愈傷組織，轉入愈傷組織繼代培養基暗培養，培養溫度為24°C 30°C，暗培養15 30天，培養出繼代胚性愈傷組織； 所述的愈傷組織繼代培養基的有效成份為改良的MS培養基和附加成份，改良的MS培養基的成份為七水硫酸鎂400 600mg/L，磷酸二氫鉀350 500mg/L，無水氯化鈣200 350mg/L, 一水硫酸錳20 40mg/L，五水硫酸銅O. I O. 3mg/L ;附加成份為6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)O. 01 I. Omg/L、KT (激動素)O. 01 I. Omg/L, 3, 4-D (3，4- 二氯苯氧乙酸)O.05 I. Omg/L、ABA (脫落酸)O. 001 O. lmg/L、Phytagel (植物凝膠)2 3g/L、鹿糖50 90g/L、挪子水 40 90ml/L。
2.根據權利要求I所述的一種花藥愈傷組織繼代培養獲得橡膠樹胚狀體的方法，其特征在于花藥初代愈傷組織轉入愈傷組織繼代培養基的繼代培養次數為I次。
全文摘要
本發明涉及一種花藥愈傷組織繼代培養獲得橡膠樹胚狀體的方法，包括花藥初代愈傷組織的誘導、愈傷組織繼代培養、胚狀體的誘導。所述的愈傷組織繼代培養是選取培養期處于28～35天的橡膠樹花藥初代愈傷組織，轉入愈傷組織繼代培養基暗培養，培養溫度為24℃～30℃，暗培養15～30天，培養出繼代胚性愈傷組織。本發明愈傷組織繼代培養的體胚分化率比不繼代培養提高150%～200%，正常胚狀體誘導率高,工藝流程簡單，生產成本低，所采用的培養基成分易于獲取，具有很大的應用價值。
文檔編號A01H4/00GK102845307SQ20121035513
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者黃天帶, 華玉偉, 黃華孫, 孫愛花, 周權男, 戴雪梅 申請人:中國熱帶農業科學院橡膠研究所