專利名稱：一株暗褐網柄牛肝菌菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株暗褐網柄牛肝菌菌株，具體涉及一株適合制備液體菌種和袋料栽培的暗褐網柄牛肝菌菌株，屬生物技術領域。
背景技術：
暗揭網柄牛肝菌Phlebopus portentosus隸屬于小牛肝菌科Boletinellaceae,脈柄牛肝菌屬Phlebopus。國外分布于泰國、斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、巴西、墨西哥、澳大利亞、新西蘭等熱帶地區(Maria2007, Bandala2004, Watling2001, Barbaral987, Peglerl986，Heinemannl982)。國內主要分布在云南，廣西、海南也有分布(臧穆等1986,2006 ;楊祝 良和臧穆2003)。暗褐網柄牛肝菌含有豐富的蛋白質、粗脂肪、總糖、粗纖維、多種礦質元素和氨基酸，是一種營養價值較高的食用菌(R. Sanmee2003，張春霞等2010)，深受產地消費者喜愛的美味食用菌。優良的菌種，是決定暗揭網柄牛肝菌廣量與質量的提聞和穩定的關鍵。暗揭網柄牛肝菌菌株的獲得主要是利用野生暗褐網柄牛肝菌子實體進行分離、純化，然后直接用于暗褐網柄牛肝菌的液體菌種和固體菌種的培養。

發明內容
本發明的目的在于提供一株適合制備液體菌種和袋料栽培的暗褐網柄牛肝菌菌株。本發明從云南省西雙版納州景洪市野生牛肝菌組織分離獲得，對其進行了形態學、生理生化性質和ITS-RNA分析，該菌株命名為暗褐網柄牛肝菌(Phlebopusportentosus) PP10003,屬于小牛肝菌科 Boletinellaceae,脈柄牛肝菌屬 Phlebopus ,于2012年6月21日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 6240。本發明的暗褐網柄牛肝菌(Phlebopus portentosus) PP10003的主要形態特征和生理生化性質為該菌株的菌落在Ml斜面培養基上培養圓形或近圓形，菌絲褐色，濃密。在光學顯微鏡下菌絲無色透明，多分支，菌絲直徑約3 μ m,鎖狀聯合明顯。本發明按常規方法用常規設備制備。即將暗褐網柄牛肝菌(Phlebopusportentosus) PP10003擴大發酵培養后得到。本發明的優點在于利用該菌株制備的優良液體菌種發菌快，菌球整齊，污染少；用于袋料栽培，其出菇培養時間短，出菇整齊，子實體產量高；能實現規模化生產暗褐網柄牛肝菌，具有較高的應用價值。
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。
本發明是這樣實現的I、菌株的分離與保藏。在超凈工作臺內，將采來的野生暗褐網柄牛肝菌子實體組織塊接種到Ml試管培養基斜面上，于28°C -30°C下暗培養30天，每天觀察記錄，剔除污染的試管，挑選出長勢良好的菌株，獲得暗褐網柄牛肝菌試管母種。切取菌絲塊置于無菌蒸餾水中15°C保存。2、菌株PP10003的鑒定分子鑒定用CTAB法提取人工子實體PP10003基因組DNA，并以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用于真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITSl(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)由華大基因合成。以提取到的PP10003基因組DNA為模板，以ITS1，ITS4為引物(用dH20稀釋至IOmM)進行 PCR 擴增，PCR 擴增體系10 X PCR buffer 5μ L ；10mM dNTP mix 4yL;Taq 酶 0· 5 μ L ;引物各2 μ L ；DNA模板2 μ L ;加超純水補足至50 μ L0充分混合均勻后，于PCR儀中進行擴增反應,PCR 反應條件如下94°C 4min ；94°C Imin54°C Imin72°C 2min 35 個循環;72°C IOmin; 12°C °o。PCR擴增產物經I. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA純化回收試劑盒回收600bp大小的片段，與T-載體(Takara pMD_18T)，轉化大腸桿菌E. coli DH5a感受態細胞，然后在含有Amp，IPTG，X-Gal的LB平板上進行藍白斑篩選，并進行菌落PCR篩選出陽性克隆，提取質粒送至華大基因完成測序。所得的測序結果經過人工校正后獲得一段666bp的序列I GAGGGTGATG CTAGGTGGGA CGACTGTCGC TGGCATATAT OGTATGCATG TGCACGT0GA61 AACCTTGGCT OGCCCCTCTT CCTTT0GG0G TAATGCTTAA TACACCTGTG AACCTGTTGT121 AGGTTGTTCC CCTAOGAGCA GTAGGAGGAC GATCTATGTC TTTCCATCAC ACTACATGTA181 TGTCTACAGA ACGTTGAAAG TOGTCTCGAC CCTTGACGGG GTTGGAOGCA AAACTATAAT241 ACAACTTTCA GCAAOGGATC TCTTGGCTCT CGCATOGATG AAGAACGCAG CGAATTG0GA301 TAAGTAATGT GAATTGCAGA TTTTCAGTGA ATCATOGAAT CTTTGAACGC ACCTTGCGCT361 CCTTGGTATT CCGAGGAGCA TGCCTGTTTG AGTGTCATCG AATTCTCAAC CATGTCTTGA421 TGTTAACTTT OGAGGCATGG CTTGGACTTG GGAGCTTTGC TGGTTGGACC CCCCTCTCTT481 CGAGGGGGGA ATGTCAGCTC TCCTCAAAAG CATTAGCAAA AGGGACGTGT T0GTCGCATG541 AACTGACGGC CTTCGAOGTG ATAATGATOG TOGTGGCTGG AGGGAAAAGT GTGATGG0GA601 AGGTCTGTCC TAGCTTCTAA TCAAAGGCGA GGGGCTTGTG TCACGCATGC CCTCTGTCTT661 ATCGAA包括ITSl區，5. 8S區及ITS2區，將這段序列提交GeneBank,應用BLAST (www.ncbi. nlm. nih. rov/BLAST)進行同源性搜索,與數據庫中各菌株序列進行相似性分析,與數據庫中已有的Phlebopus portentosus的各個菌株相應序列一致性(Identities)都到達到 99 100%,該菌株鑒定為 Phlebopus portentosus。3、暗褐網柄牛肝菌液體菌種培養在超凈工作臺中將暗褐網柄牛肝菌PP10003斜面菌種切碎，菌塊小于2 mm，將菌塊接種于裝有300ml的Ml液體培養基500ml三角瓶中，每只斜面種可接種至10瓶，將三角瓶放在125r/min回旋式搖床中振蕩培養，溫度為28°C，培養8天后即得到液體菌種。4、暗揭網柄牛肝囷袋料栽培
a.將配置好的固體培養基分裝于聚丙烯(規格17 cm X33 cm)菌種袋中，每袋裝800g IOOOg栽培培養基，121°C滅菌60分鐘，待冷卻后備用。b.將培養好的液體菌種接種于a.步驟滅菌后的栽培袋中，每瓶液體種可接種8 10袋，接種后將培養袋置于26 28°C的培養室暗光培養40 60天，菌絲體長滿菌袋。c.覆土培養出菇 將制備好的覆土材料覆蓋在培養好的菌袋表面，覆土層厚4 6 Cm，置于溫度為28 30°C的菇房里，菇房的相對濕度為80 90%，光照度為60 700LX，保持覆土層表面濕潤，覆土后10 15天，子實體發育成熟。
權利要求
1.一株暗褐網柄牛肝菌菌株，其特征在于暗褐網柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)PP10003菌株，已于2012年6月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6240。
全文摘要
本發明涉及一株暗褐網柄牛肝菌菌株，具體涉及一株適合制備液體菌種和袋料栽培的暗褐網柄牛肝菌菌株，屬生物技術領域。暗褐網柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)PP10003菌株，已于2012年6月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.6240。本發明的優點在于利用該菌株制備的優良液體菌種發菌快，菌球整齊，污染少；用于袋料栽培，其出菇培養時間短，出菇整齊，子實體產量高；能實現規模化生產暗褐網柄牛肝菌，具有較高的應用價值。
文檔編號A01G1/04GK102870597SQ20121037046
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者何明霞, 張春霞, 曹旸, 劉靜, 紀開萍, 王文兵, 高鋒, 周茂, 伍英, 王云 申請人:云南省熱帶作物科學研究所