專利名稱：來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的epsp合酶基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物基因工程領域，具體涉及一種來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因及其應用。
背景技術：
草甘膦是一種廣譜滅生性、內吸傳導型優秀除草劑，廣泛用于果園、膠園、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理。1974年在美國注冊登記以來，至今已在世界100多個國家注冊，成為世界上使用面積最大的除草劑品種之一。但是該除草劑同樣是一種非選擇性除草劑，對農作物有著殺死作用。因此，為了在農業生產中使用草甘膦，必須培育出具有草甘膦抗性或者降解性的農作物。·
草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine, glyphosate)毒性作用機理是競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(簡稱EPSP合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物體內芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成過程中的一個關鍵酶，該酶由aroA基因編碼。目前種植抗除草劑轉基因作物的國家越來越多，面積也迅速增加，種植面積不斷擴大，占全球種植轉基因作物的78%以上。根據2002年資料表明，耐草甘膦大豆依舊是美國、阿根廷、加拿大、墨西哥、羅馬尼亞、烏拉圭和南非等七國的主要商品化轉基因農作物。耐草甘膦除草劑大豆在全球范圍內種植3650萬公頃，占全球總轉基因農作物種植面積的62%。然而現在應用于生產的抗草甘膦基因僅有兩個，且都受到專利的保護，因此發掘新型的EPSP合成酶基因對于培育具有自主知識產權的抗草甘膦轉基因作物將是非常有必要的。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因及應用，從而為培養新型的抗草甘膦轉基因作物提供必要的理論與實驗支持。為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案來實現。所述的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因，含1284個堿基，編碼氨基酸428個。具體地，所述的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO I所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。所述的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因，采用人工方法合成，具體包括以下步驟I)抗草甘膦菌株的篩選采集草甘膦頻繁使用果園地里土壤中的樣品，用0. 9% (w/v)氯化鈉溶液混合，之后將樣品涂布與含有60mM草甘膦的LB固體培養基中培養24h。將長出來的菌株再次涂布與含有200mM草甘膦LB固體培養基中培養24h，最后將一個生長最好的菌株挑選出來進行進一步研究。2)菌株總DNA的提取及鑒定將上述分離獲得的細菌單株在IOml液體LB培養基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH=7. 5)中培養過夜(16小時)，菌體培養液以6000r重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。這些沉淀在-20° C下冷凍lh。之后使用TE( IOmM Tris-HCl,ImMEDTA, pH=8. O)溶液清洗一次。加入濃度為10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的無菌水懸浮，在37° C下搖床培養lh。加入O. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和濃度為5M的NaCl輕輕振蕩混勻。再加入濃度為20mg/mL蛋白激K(Takara日本)，反應物在37° C下培養lh。用與培養菌液液體體積相當I倍體積的苯酚氯仿異戊醇混合液(25:24:1，v/v)提取DNA。水相用與相當水相體積1/2倍體積的氯仿異戊醇混合液(24:1，v/v)萃取，振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當I倍體積的異戍醇，振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (v/v)酒精沖洗DNA，干燥，之后在TE緩沖液中重懸浮，所得總DNA儲存于4° C下備用。 以16SR (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ )和16SF(5’ -ACGGCTACCT TGTTACGACTTC-3’ )為擴增引物，以菌株的 DNA 為模板進行16S rDNA的PCR擴增，隨后對PCR產物進行凝膠回收，克隆和測序。3)基因組文庫的構建菌株DNA用Sau3A I酶切，經瓊脂糖凝膠回收2_4kbDNA片斷備用。此片斷經過末端去磷酸化連接到同樣去磷酸化的PACYC184質粒載體。上述連接產物轉入E. coli DH5 α電擊感受態細胞，涂布與LB固體培養基，37° C下培養24h后進行質粒大抽。這樣就構建成了包含有目的基因的基因組文庫。4)篩選草甘膦抗性轉化子將上述得到的大抽質粒轉入大腸桿菌ER2799(NEB公司)分別涂布與含有50、100、150mM草甘膦的LB固體培養基中培養48h，發現有一個菌落能在含有150mM草甘膦的LB固體培養基上生長，即篩選得草甘膦抗性轉化子。以基因合成法Nucleic Acids Research, 2004，32，e98克隆上述獲得的轉化子，設計26個引物，篩選即獲得EPSP合酶基因，進行序列測定，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示，全長1284個堿基；編碼氨基酸428個，其序列如SEQ ID NO 2所示。以 Pl (5，_gagagaccatggaatccctgacg_3，)矛口 P2(5，—gtctcgagttcaggcgagggtact-3’)為引物，以上述獲得的EPSP基因為模板進行PCR擴增。PCR產物經Nco I和Xho I酶切后連接入同樣經Nco I和Xho I酶切的pET-28a載體(Novagen公司)，構建質粒。然后將此質粒轉入大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司)轉化,所得轉化子用HisTrap HP kit(Amersham Biosciences)試劑盒進行蛋白表達純化,并進行EPSP酶活測定和動力學參數的測定。采用蘸花法Nature Protocol, 2006, (2) : 641-646將上述獲得的EPSP合酶基因轉入擬南芥，進行草甘膦萌發試驗，結果表明所述的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保持著與PEP較強的親和性，因而說明本發明的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因可應用于轉化擬南芥中，這些特征為用于轉基因作物的培育提供可能。


圖I為本發明的EPSP合酶的SDS-PAGE電泳圖，其中I代表用HisTrap HP試劑盒純化的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶蛋白，2代表在大腸桿菌BL21 (DE3)過量表達的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶蛋白，3代表蛋白分子量MARKER。圖2為轉本發明的肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因的擬南芥在含有不同濃度草甘膦平板上的萌發實驗，其中，Kp2，Κρ4，Κρ5分別代表轉本發明的EPSP合酶基因的不同的擬南芥株系 ；CK代表對照。
具體實施例方式以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。本發明所用的試劑若未經說明，均購自西格瑪一奧德里奇(Sigma — Aldrich)公司。本發明涉及的分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學出版社)實施例I高耐受草甘膦的DNA片斷克隆I、草甘膦頻繁使用水稻地里土壤樣品的采集從一年至少使用四次并且連續使用十年以上的果園的土壤中采集土壤樣品。2、抗草甘膦菌株的篩選稱取草甘膦頻繁使用果園土壤樣品lg，加入O. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000轉/分震蕩混勻，3000轉/分輕離心，倒掉上清，再加入O. 9% (w/v)氯化鈉溶液1ml，5000轉/分震蕩混勻，冰上IOmin靜置，吸取150 μ I溶液涂布與含有60mM草甘膦的LB固體培養基中培養24h。將長出來的單菌落接種與加入1.6ml LB液體培養基的試管中，28° C培養48h，然后吸取150 μ I的培養液再次涂布與含有200mM草甘膦的LB固體培養基中培養24h，最后將一個生長最好的菌落選出來進行進一步研究。3、菌株總DNA的提取及鑒定將上述分離獲得的細菌單株在IOml液體LB培養基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl,10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH=7. 5)中培養16h，菌體培養液以6000轉/分速度離心5min，得到菌體沉淀，這些沉淀在-20° C下冷凍lh。之后使用TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA,pH=8. O)溶液清洗一次。加入含有20 μ I濃度為10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的無菌水懸浮，在 37° C 下搖床培養 lh。加入 50 μ L O. 5M EDTA，50 μ I 10% (w/v) SDS 和 50 μ I 濃度為5Μ的NaCl輕輕振蕩混勻。再加入10 μ I濃度為20mg/mL蛋白激K (Takara日本)，反應物在37° C下培養lh。用與培養菌液液體體積相當I倍體積的苯酚氯仿異戊醇混合液(25:24:1)提取DNA。水相用與相當水相體積1/2倍體積的氯仿異戊醇混合液(24:1)萃取，振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當I倍體積的異戊醇，振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (v/v)酒精沖洗DNA，干燥，之后在TE緩沖液中重懸浮，所得總DNA儲存于4° C下備用。以抽提的總DNA為模板，利用肺炎克雷伯氏桿菌342的16sRNA特異性引物進行擴增。擴增的引物為 16SR(5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ )和 16SF(5’ -ACGGCTACCTTGTTACGACTTC-3，)。以KOD Plus (Toyobo日本)為Taq DNA聚合酶，擴增條件依次為MV 30s，55°C 30s, 72°C 120s，擴增30個循環。循環結束后，加入2U的rtaq酶(大連寶生物工程公司)，72°C延伸90s，擴增片段長1500bp。PCR結束后，l%(w/v)瓊脂糖凝膠回收，取10 μ I直接與Τ/Α克隆載體相連(大連寶生物工程公司)，4°C連接過夜。再將該載體轉化入DH5a感受態中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛細管自動化測序儀測序，測得的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行對比分析，得到的菌株與肺炎克雷 伯氏桿菌342中的16s rRNA有99%的同源性，從而證實上述所挑選的菌株為肺炎克雷伯氏桿菌342。4、肺炎克雷伯氏桿菌342基因組文庫的構建將上述獲得的肺炎克雷伯氏桿菌342的DNA用Sau3AI酶切在10 μ I反應體系進行部分酶切試驗，Sau3A I 酶按 1:100 稀釋,37°C分別酶切 IOmin, 20min, 30min, 40min, 50min,60min后加入IOX loading buffer I μ I終止反應，電泳檢測最適酶切反應時間。而后選擇相同的體系酶切30min進行大量酶切。經O. 7% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳后，切下長度為2-4kb的DNA片段，用凝膠試劑盒(上海生物工程公司)回收。質粒載體pACYC184 (NEB公司)用BamH I完全酶切后SAP堿性磷酸酯酶進行末端去磷酸化，以減少載體自連。上述回收后的菌株DNA (200ng)和末端去磷酸化的質粒載體pACYC184 (150ng)用2U的T41igase在4°C下連接16h。連接產物用正丁醇沉淀后，用70% (v/v)的乙醇離心洗滌，最后用10 μ I的超純水溶解，將連接物進行電擊轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，電擊參數為電脈沖為2. 5 μ F，電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時間為4. 5. S。復蘇后，將菌液涂布于LB (含有50 μ g/mL氨芐青霉素)平板上，37°C培養12-16h。而后用質粒大量提取試劑盒(美國Omega公司)進行質粒提取，這樣就構建成了包含有目的基因的基因組文庫。5、篩選草甘膦抗性轉化子將上述大量提取的質粒轉入大腸桿菌ER2799 (NEB公司)涂布與含有50mM草甘膦的M9平板上培養48h，發現有三個菌落生長良好。將這三個菌落分別接種到含有lOOmM、150mM草甘膦的M9平板上培養，發現只有I個能在含150mM草甘膦的M9平板上生長，將其所含的質粒命名為PAroAk. pne_niae。將該質粒PAroAk.pneummiae再次轉入大腸桿菌ER2799(NEB公司)中轉化，將轉化獲得的轉化子用無菌牙簽點與含150mM草甘膦的M9固體培養基上檢驗抗性，結果證明這個克隆所產生的轉化子具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性確實是由于轉入質粒引起的。 實施例2高耐受草甘膦的DNA片斷的序列分析利用逐步序列測定方法對實施例I篩選獲得的高耐受草甘膦質粒PAr0A1^pneummia全序列進行DNA測序。分析結果表明該片斷大小為2100bp，其中包含了一個1284的閱讀框，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示，編碼氨基酸428個，其序列如SEQ ID NO 2所示。。實施例3高耐受草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成與篩選以基因合成方法Nucleic Acids Research, 2004，32，e98克隆上述含有質粒PAroAk.pneimonia的轉化子，設計26個引物，合成并篩選本發明的EPSP合酶基因。所設計的引物如下I. KP-I: Tm=54, 60merGGA, TCC, ATG, GAA, TCC, CTG, ACG, TTA, CAA, CCC, ATC, GCA, CGC, GTA, GAG, GGC, ACC, GTG, AAC, CTG2. KP-2: Tm=54, 60merGAG, CGG, CCA, GCA, GCA, GCG, CGC, GGT, TGG, AGA, CGC, TTT, TCG, AAC, CTG, GCA, GGT, TCA, CGG, TGC3. KP-3: Tm=54, 60merTGG, CCC, GCG, GCA, CGA, CGG, TGC, TGA, CCA, ACC, TGC, TGG, ACA, GCG, ACG, ATG, TGC, GCC, ATA, TGC 4. KP-4: Tm=54, 60merGAT, AGG, GTA, TAT, TGA, ACC, CCC, AGC, GCA, CTC, AGG, GCA, TTC, AGC, ATA, TGG, CGC, ACA, TCG, TCG5. KP-5: Tm=54, 60merTGC, CGA, CCG, CAC, CCG, CTG, CGA, AGT, GAC, CGG, CAA, CGG, CGG, CCC, GCT, GCG, CGC, TGC, TGC, GGC6. KP-6: Tm=54, 60merCCG, CAT, CGC, GGT, TCC, GGC, GTT, GCC, GAG, GAA, CAG, CTC, CAG, CGC, CGC, AGC, AGC, GCG, CAG, CGG7. KP-7: Tm=54, 60merCCG, CTG, GCG, GCG, GCC, CTG, TGC, CTT, GGC, AGC, AAC, GAT, ATT, GTG, CTG, ACC, GGC, GAA, CCG, CGG8. KP-8: Tm=54, 60merGCA, GGG, CAT, CCA, CCA, GAT, GGC, CGA, TCG, GGC, GCT, CTT, TCA, TCC, GCG, GTT, CGC, CGG, TCA, GCA 9. KP-9: Tm=54, 60merGTC, AGG, GCG, GCG, CTC, AGA, TCG, ACT, ATC, TTG, AGC, AGG, AAA, ATT, ATC, CAC, CGC, TGC, GCC, TGC10. KP-IO: Tm=54, 60merCTG, CCG, TCA, ACC, TCG, ACG, TTC, CCG, CCC, TGA, AAA, CCG, CCG, CGC, AGG, CGC, AGC, GGT, GGA, TAA11. KP-II: Tm=54, 60merCGT, CTC, CAG, TCA, GTT, CCT, GAC, CGC, GCT, GCT, GAT, GAC, CGC, GCC, GCT, GGC, GCC, GCA, GGA, TAC12. KP-12: Tm=54, 60merATA, GGG, TTT, CGA, CAC, CAG, ATC, GCC, CTT, AAT, GGC, GAT, CAC, GGT, ATC, CTG, CGG, CGC, CAG, CGG13. KP-13: Tm=54, 60merATC, GAC, ATT, ACG, CTG, CAC, CTG, ATG, AAA, ACC, TTC, GGC, GTT, GAG, GTG, GAC, AAT, CAG, TCT, TAT 14. KP-14: Tm=54, 60merGCG, ACT, GAT, ACT, GCT, GCT, TGC, CGC, GCA, CCA, CAA, AAC, GCT, GAT, AAG, ACT, GAT, TGT, CCA, CCT15. KP-15: Tm=54, 60merCAG, GGG, ATT, ACC, TGG, TGG, AAG, GCG, ATG, CTT, CCT, CGG, CCT, CGT, ATT, TCC, TCG, CCG, CTG, GCG16. KP-16: Tm=54, 60mer
CGG, CCG, ATA, CCG, GTG, ACT, TTT, ACC, GTG, CCG, CCC, TTA, ATG, GCG, CCA, GCG, GCG, AGG, AAA, TAC17. KP-17: Tm=54, 60merCGG, CAG, TGT, GCA, GGG, CGA, TAT, CCG, TTT, CGC, CGA, CGT, CCT, GGA, GAA, AAT, GGG, CGC, TAC, CGT18. KP-18: Tm=54, 60merCTC, GCC, GCG, GGT, GCA, GGC, GAT, AAA, ATC, GTC, GCC, CCA, GGT, CAC, GGT, AGC, GCC, CAT, TTT, CTC 19. KP-19: Tm=54, 60merCTC, AAG, GCT, ATC, GAT, ATG, GAT, ATG, AAC, CAT, ATC, CCG, GAC, GCG, GCG, ATG, ACC, ATC, GCC, ACC20. KP-20: Tm=54, 60merTAT, TGC, GCA, GCG, TAG, TGG, TCC, CTT, GCG, CGA, ACA, GCG, CGG, CGG, TGG, CGA, TGG, TCA, TCG, CCG21. KP-21: Tm=54, 60merTCT, ACA, ACT, GGC, GGG, TCA, AAG, AGA, CGG, ACC, GTC, TGT, TCG, CCA, TGG, CGA, CCG, AGT, TGC, GTA22. KP-22: Tm=54, 60merCGA, ATA, TAA, TCT, TCA, CCC, TCT, TCC, ACC, TCG, GCG, CCT, ACT, TTA, CGC, AAC, TCG, GTC, GCC, ATG23. KP-23: Tm=54, 60merCAT, CAC, CCC, GCC, GGC, AAA, GTT, GAA, ATA, TGC, TGA, AAT, TGG, CAC, CTA, TAA, CGA, CCA, CCG, GAT 24. KP-24: Tm=54, 60merCGG, CGT, ATC, AGA, CAG, CGC, CAC, CAG, CGA, GAA, GCA, CAT, CGC, CAT, CCG, GTG, GTC, GTT, ATA, GGT25. KP-25: Tm=54, 60merGTG, ACC, ATC, CTT, GAT, CCC, AAA, TGT, ACG, GCC, AAA, ACG, TTC, CCG, GAC, TAT, TTT, GAG, CAA, CTG26. KP-26: Tm=54, 50merGAG, CTC, TCA, GGC, GAG, GGT, ACT, GAT, CCG, CGC, CAG, TTG, CTC, AAA, ATA, GTC, CG
利用PCR進行EPSP合酶基因擴增，在100 μ I反應體系中，ΚΡ_2至ΚΡ-25共24個內側引物的添加量為2ng，外側引物KP-I和KP-26添加量為30ng，擴增條件為94°C預熱Imin ;94°C 30s，50°C 30s，72°C 2min，使用的 Taq DNA 聚合酶為 KOD FX taq 酶(Toyobo 公司，日本)，共25個循環。PCR結束后，1%瓊脂糖膠回收，取10 μ I直接與Τ/Α克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，高效轉化DH5ci感受態中。獲得陽性克隆，經序列檢測，其核苷酸序列如SEQID NO I所示，它包含1287個堿基，其編碼氨基酸428個，序列如SEQ ID NO 2所示，即該陽性克隆為本發明的EPSP合酶基因。
實施例4高耐受草甘膦的EPSP表達將上述合成的EPSP 基因用引物 Pl (5，-gagagaccatggaatccctgacg-3’ )和 P2 (5’-gtctcgagttcaggcgagggtact-3，)進行 PCR 擴增，以 KOD Plus (Toyobo 日本)為 Taq DNA聚合酶，擴增條件依次為94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，擴增30個循環。循環結束后，加入2U的rtaq酶(大連寶生物工程公司)，72°C延伸90s，擴增片段長1353bp。PCR產物用Nco
Iand Xho I酶切后，連入相同酶切的載體pET-28a (NEB公司)得到重組質粒pET-pAroAk.Pneumonia并將其轉化大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司)，將轉化子涂布在LB固體培養基中培養24h。用凝膠-蛋白純化試劑盒HisTrap HP (Amersham Biosciences公司)對其進行蛋白表達純化，SDS-PAGE電泳檢測。經SDS-PAGE電泳檢測，蛋白大小約45kDa，與預測值相符(電泳圖參看圖I)。實施例5EPSP合酶基因的酶活測定和動力學參數的測定I.測定方法無機磷標準曲線:10mM無機磷按1:10稀釋，分別取0、1、2、3......20 μ I與I. 5ml
Eppendorf離心管中，加入純水至100 μ I混勻，加入MAT溶液O. 8ml混勻，計時三分鐘后加入SC溶液(？ >100 μ I迅速混勻，室溫靜置20min后測定OD66tl值，重復三次。以無機磷濃度為橫坐標，OD660值為縱坐標作圖，得到無機磷標準曲線。I)酶活測定蛋白定量采用考馬斯亮藍G-250染色法。在冰上與I. 5ml Eppendorf離心管中加入以下溶液IOmM PEP溶液2 μ 1，IOmM S3P溶液2 μ 1，0. 5Μ HEPES溶液2 μ 1，ImM(NH4)6MO7O24 · 4Η20溶液2 μ I和雙蒸水12 μ I混勻，與28°C溫浴5min后各管樣品間隔2s加入5 μ I純化蛋白并計時，2min后再間隔2s依次加入200 μ I MAT溶液，顯色3min后再間隔2s依次加入20 μ I 34%SC溶液迅速混勻，室溫顯色20min后測定OD66tl值。對照除不加純化蛋白外，其余同樣品管。樣品管與對照管的OD66tl值相減后，對照無機磷標準曲線即可求得反應釋放出的無機磷摩爾量，再除以反應時間和酶蛋白量就得到酶的酶活力(nkat/mg)。2)半抑制量(IC50)測定上述反應液中添加O、10' 10' 10' I、10、100、500mM草
甘膦，所得酶比活力數據以草甘膦濃度為X軸，采用對數坐標，以反應速度(nkat/mg)為Y軸作圖。3)Km (PEP)測定將S3P溶液濃度恒定于ImM，在不同PEP濃度(0. 05、0. 067、0. I、0. 2,0. 5、I. OmM)下按上述反應體系測定酶反應速度，所測數值按V_v/[S] (Eadic-Hofstee)法作圖。4) Ki (glyphosate)測定在不同草甘膦濃度(O、10、50、100 μ Μ)下測定PEP濃度為O. 05,0. 067,0. 1、0. 2、0. 5、I. OmM時EPSP的酶反應速度。采取雙倒數作圖，得到1/V-1/直線，再將各直線的斜率作為縱坐標，草甘膦的濃度作為橫坐標得到一條新的直線，該直線與X軸的交點即為Ki (glyphosate)值。2.測定結果
本發明的EPSP合酶活性為71. 53±0. 13nkat/mg，其動力學參數如下表I所示。表I本發明的EPSP合酶的動力學參數
權利要求
1.一種來源于肺炎克雷伯氏桿菌342 (Klebsiella pneumoniae 342)的EPSP合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.根據權利要求I所述的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.權利要求I或2所述的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因在擬南芥轉化中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，采用蘸花法將所述的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因轉入擬南芥中。
5.權利要求I或2所述的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因在轉基因作物培育中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種來源于肺炎克雷伯氏桿菌342(Klebsiella pneumoniae 342)的EPSP合酶基因及其應用。所述的EPSP合酶基因含1284個堿基，編碼氨基酸428個；其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明的來源于肺炎克雷伯氏桿菌342的EPSP合酶基因具有較高的草甘膦耐受性，可用于轉基因作物的培育。
文檔編號A01H5/00GK102876690SQ20121037996
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月9日 優先權日2012年10月9日
發明者田永生, 姚泉洪, 許晶, 彭日荷, 金曉芬, 韓洪娟, 韓靜, 王波, 王麗娟 申請人:上海市農業科學院