專利名稱：一株腐敗希瓦氏菌及其在有機廢棄物處理上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及農業生物技術領域，具體是涉及微生物在生產生物有機肥的技術應用，主要是一株腐敗希瓦氏菌及其在有機廢棄物處理上的應用。
背景技術：
在占地球表面超過80%的海洋、極地、冰川、高山和凍土等低溫環境中廣泛分布和生存著大量的低溫菌[它們在長期的進化過程中，建立了能夠適應冷環境的生長機制，依賴于獨特的低溫啟動子，其RNA聚合酶即使在0°C也能進行基因的高效轉錄，保持菌體在低溫下的正常生長和繁殖，這種有別于常溫菌和高溫菌的生命活動現象，其獨特性值得人們加倍重視。1975年，Morita首次系統的報道了低溫細菌，并分析了其生理特點，低溫微生物可以在寒冷環境下生長，而人們所熟悉的嗜溫微生物則在寒冷環境下表現為生 長停止甚至死亡，原因是嗜溫微生物在極端環境下酶活力過低和蛋白質變性，表明低溫微生物與嗜溫微生物具有明顯不同的生理機制。低溫微生物在催化低溫發酵過程和寒冷地區污水處理等領域具有潛在的應用價值。對低溫微生物耐冷性的研究，不僅可以揭示其冷適應機理，同時為低溫微生物應用提供堅實的理論基礎。近年來，對低溫微生物冷適應機理及其應用的研究逐漸展開，其中包括嗜冷酶的基本結構特點與其低溫活性的關系，膜系統的流動性保持的分子基礎和脂肪酸的組成關系，冷休克蛋白和抗凍蛋白結構及功能研究等領域。根據Morita的標準，低溫微生物被分為兩類可以在T5°C生長，最高生長溫度在20°C以上生長，最適生長溫度可以大于15°C的一類被稱為耐冷微生物(psychrotoerants);可以在0°C或0°C以下生長，最適生長溫度低于15°C，最高生長溫度不超過20°C的一類微生物被稱為嗜冷微生物(psychrophiles)。本發明應用的微生物腐敗希瓦氏菌/wire/aciefls)屬于耐冷微生物。在冬季o-io°c的低溫環境下牛糞等有機物的堆肥起溫是關鍵，中、高溫菌在低溫下難以正常繁殖，而低溫菌細胞膜含有大量不飽和脂肪酸，使膜在低溫下也能保持半流動狀態，運輸物質；加之核糖體結構和功能對低溫不敏感，酶和蛋白質仍可合成并發揮作用。因此本發明利用低溫菌的特殊生理機制，在冬季o-io°c的低溫環境下的堆肥中加入低溫菌，在堆肥發酵初期，這些低溫菌首先利用堆肥中的可溶性糖和淀粉等簡單有機物大量的快速的繁殖而產生熱量，促進堆肥溫度迅速升高，溫度升高到15-20°c啟動了中溫微生物的大量繁殖，大量繁殖的代謝熱量保證了堆肥的起溫過程。堆肥啟溫過程的快慢是由加入的低溫菌的數量和繁殖速度決定的。本發明應用的腐敗希瓦氏菌就是在0-10°C時在牛糞等有機物中繁殖最快的微生物菌種。腐敗希瓦氏菌的快速繁殖產生的熱量能有效的促進中溫菌和高溫菌的繁殖，進而啟動了堆肥的發酵溫度，使堆肥能快速的達到高溫階段，完成堆肥的無害化處理。微生物發酵法是一種常用的低投入、高效益畜禽糞便無害化處理方法，畜禽糞便多數是自然堆積發酵，時間長，堆肥溫度低，對有害微生物、寄生蟲卵的殺滅和除臭效果不理想，并且長期的堆肥導致厭氧發酵增多，反消化細菌大量增殖，大量的氮元素損失。因此，在牛糞等有機物堆積過程中添加有效微生物，不僅可以加速有機碳的分解，減少氮素損失，減少堆制過程中氨氣、硫化氫的揮發，縮短發酵時間，而且堆肥升溫高，可以殺死病原微生物和寄生蟲，使糞便達到充分腐熟，生產出優質的綠色有機肥料。在冬季等低溫環境下堆肥起溫是關鍵技術，有機物堆肥能否快速進入高溫期影響著堆肥的無害化進程和發酵周期。在堆肥中蛋白酶和纖維素等酶活和酶效最高的微生物是中溫菌，一旦環境達到中溫菌的生長條件，就能大量的分解有機物，促進堆溫升高和高溫菌大量繁殖，產生生物熱進入高溫期。溫度是堆肥順利進行的重要因素，可以直接反映堆肥進程，溫度上升是微生物代謝產熱及堆體保溫效應共同作用的結果。在已報道和公開的技術中冬季發酵牛糞等生產有機肥采用的啟溫方法是在堆肥中輸入熱蒸汽和熱水的方法來達到堆肥的啟溫過程，或者直接在堆肥的堆制部位鋪設加溫的裝置來控制和增加堆肥的溫度。比如專利CN10179234A公開的有機物堆肥啟溫的方法是采用加熱裝置在發酵倉底部加熱。專利CN101200386B是發明了一個增溫和增氧的可調螺旋攪拌式堆肥裝置，用于堆肥的溫度升高。這些方法都是在有機物堆肥前期通過增加外部的能量來啟動發酵，雖然方法先進、適用，但是采用的設備比較昂貴和大大的增加了生產有機肥的成本。僅能在有條件的有機肥生產中應用，而在中小型的有機肥生產企業中難以 推廣。同樣有專利公開了利用復合微生物應用于低溫有機物發酵，比如專利CN101381689A公開了利用枯草芽孢桿菌、圓褐固氮菌、綠色木霉制成的發酵劑用于堆肥的溫度升高；專利CN101880182A采用枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、小單孢菌和嗜纖維分解菌用在低溫是發酵畜禽糞便和處理秸桿。專利CN1800357A公開的內容提到了低溫細菌和高溫細菌，但其特指的低溫細菌是發酵酵母和白地霉。上述專利公開的一些微生物是自然界中常見的種類多數屬于中溫菌類型。雖然有些菌種適應低溫環境，但這些菌種在低溫條件下的具體生長情況和數量沒有公開說明，這些專利提到的菌種沒有包括本專利發明的腐敗希瓦氏菌或者與腐敗希瓦氏菌相近的菌種。關于低溫環境的希瓦氏菌的研究和應用也有許多公開的資料，比如微生物學報2004，44 (5):526-566中報道了希瓦氏菌在低溫環境下用于降解染料。專利申請號200910140943. 3和201010220341. I公開了希瓦氏菌用于微生物燃料電池；200310112361. 7公開了希瓦氏菌用于脫色；00806387. 7公開了希瓦氏菌用于對石油烴污染物的清除。這些公開的內容共同說明希瓦氏菌是一種低溫的微生物，比較適應低溫的環境能依據其特點發揮其功能。申請者查閱了所有公開的資料和文獻還沒有發現適應低溫環境的希瓦氏菌在處理有機廢棄物中用于堆肥啟溫方面的應用和報道。

發明內容
為了解決冬季低溫情況下中小型有機肥廠處理有機廢棄物中出現的堆肥發酵啟溫慢，甚至無法啟溫的技術難題，本發明充分利用低溫微生物的特點從長期放置于低溫的牛糞中(牛糞樣品放置低溫冰箱中6個月以上)分離到一株能在低溫環境下的牛糞等有機物堆肥內的有效微生物菌群中占主導地位的微生物菌株，命名為CR7菌株。本發明所提供的CR7菌株,經鑒定為腐敗希瓦氏菌putrefaciens),保藏編號為CGMCC No. 6192。本發明所述的腐敗希瓦氏菌CGMCC No. 6192在有機廢棄物處理中的應用。
本發明還公開了一種由腐敗希瓦氏菌CGMCC No. 6192制成的微生物菌劑。 所述微生物菌劑可通過下述方法制備
(1)將CR7細菌在低溫5°C條件下活化，挑選生長速度最快的單菌落，作為發酵菌劑的菌種；
(2)按照配方(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1L)，配制發酵所需培養基2-4L，121 °C 20min 滅菌；
(3)將豆粉與麩皮按照1:3的體積比例拌均勻，含水量30%，裝袋，每袋200g，包扎121°C30min滅菌，共滅菌兩次，間隔24h ；
(4)將(I)活化的菌種接種到(2)制備的培養基中，置15°C120r/min搖床發酵48h ；
(5)在無菌條件下，將步驟(3)發酵料與步驟(4)的菌液，按照體積比固體料菌液=2 5的比例混合均勻，放在烘箱中30V烘干，抽樣檢測后包裝。(6)檢測步驟(5)烘干的樣品中CR7的活菌數量。CR7的數量達到IO8以上，符合標準。上述制備的烘干菌劑，在包裝袋不損壞情況下，室溫條件下儲藏時間為6個月，0-4°C條件下儲藏時間為2年，保存有效菌體的數量是105cfu/min以上。上述菌劑在低溫條件下啟動發酵的應用
(I)菌劑的擴繁在室內(10°c以上)菌劑按照1:10的體積比混拌在礱糠或麩皮等有機料中，加入總體積的30%的溫水(20-30°C)，攪拌均勻，堆制發酵10-20h。(2)在室外(O-IO0C )堆制的新鮮牛糞按著生產有機肥的方法在添加配料的同時加Ad)擴繁的啟動菌劑，加入量為體積比的1:1000攪拌均勻，堆制發酵。(3)堆肥中放入溫度計，觀察加入啟動菌劑和不加入啟動菌劑(正常有機肥的生產)的堆肥中的溫度變化。堆肥48h后加入啟動菌劑的處理組溫度上升到50°C以上，高出對照組的溫度10-15°C。為啟動發酵成功。腐敗希瓦氏菌CGMCC No. 6192分離自長期處于低溫環境的牛糞堆肥中，并且低溫環境下在牛糞等有機物堆肥內的有效微生物菌群中占主導地位。由該菌種制得的菌劑能在冬季牛糞等畜禽糞便堆肥中應用，快速啟動堆肥發酵，提高堆肥發酵溫度，縮短堆肥的發酵周期，減少氮元素的損失作用。提高產量和減少生產成本。另一方面，該菌劑應用于利用畜禽糞便生產有機肥的促腐劑中，在冬季無論是在室內和露天生產有機肥均能確保有機肥發酵溫度的啟動和縮短有機質腐熟的周期。
具體實施例方式于2012年6月6日將菌株CR7送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類命名為腐敗希瓦氏菌/wire/aciefls),保藏編號為CGMCCNo. 6192 ;保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所；郵編100101 。實施例一牛糞堆肥啟動菌種的分離
采集新鮮牛糞和牛糞堆肥的拌料(牛糞中加入1%豆柏、1%礱糠、2%草木灰)放置于
0-4°C冰箱中，6個月后采用肉湯培養基分離微生物菌種，分離方法是稀釋分離法，分離溫度是1_4°C，挑取48h內生長出單菌落的微生物菌株，繼續用肉湯培養基在低溫下誘導培養，選擇在24h內生長出明顯單菌落的微生物菌種編號，保存備用。實施例二 菌種在滅菌牛糞培養基中適應性的測定
實施例一篩出的系列菌種接種到滅菌的牛糞培養基中，培養及配方是牛糞中加入1%豆柏、1%礱糠、2%草木灰。置0-5°C的冰箱中，每隔2h測菌體數量，根據菌體數量制定每個菌種的生長曲線，保留在48h內生長達到105cfu/min以上的菌種，選取在最短時間內繁殖到達最大生長數量和菌體繁殖數量最高的菌種。通過實驗得到一株在牛肉膏培養基上是乳紅色的菌種，實驗編號為CR7，CR7在16h達到I. 3X109cfu/ml, OD400是I. 473，比達到同等數量的大腸桿菌CGMCC1. 907繁殖速度快了 4h。實施例三CR7菌株在露天堆制牛糞中的生存數量測定
純化的CR7菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上發酵培養48小時，發酵液4000r/min離心，保留沉淀物，即CR7菌株菌體，這些菌體按照1:10的體積比混拌到滅菌的礱糠或麩皮
中，測定菌體含量在108cfu/min以上，及制備了 CR7菌劑。按照O. 1%的比例接種到新鮮牛糞中，混拌均勻，堆制發酵。每天取堆肥中20cm下的樣品，在實驗室內立即采用稀釋分離方法測定樣品中CR7菌株的菌體數量。分離的培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基，調查平板上乳紅色的細菌菌落數，即CR7菌株的菌落數。經測定48h達到I. 7X 109cfu/min。實施例四CR7菌株菌種鑒定
(I)形態和生理生化鑒定參照東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》，科學出版社，2001年。經觀察CR7菌株CGMCC No. 6192 :生長范圍為5_40°C，最適生長溫度在25°C左右，生長pH范圍7. 0-10. O。在牛肉膏蛋白胨固體培養基上是乳紅色菌落，革蘭氏染色陰性，過氧化酶陽性，吲哚、MR、VP和糖發酵實驗陰性，產H2S。(2) 16s rDNA 鑒定鑒定
1)設計引物P0:5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(SEQ ID NO. I)
P5 :5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ (SEQ ID NO. 2)
由上海生工公司合成(PO代表正向引物，P5代表反向引物)；
2)菌株的培養按常規方法將CR7菌株接種于肉湯培養液中，28°C，180rpm 條件下振蕩培養至對數期；
3)菌株16SrDNA的擴增和序列分析
PCR 反應體系10XPCR buffer 5 μ L, dNTP mixture (IOmM) I μ L，MgCl2 (25mM)4μ L,引物 PO (5 μ M) IyL, Ρ5(5μΜ) I μ L, Taq DNA polymerase (5U/μ L) O. 5 μ L,Template 5 μ L,加入 ddH20 致終體積 50 μ L。PCR 反應條件95°C預變性 10min，94°C變性 40s，46°C退火 40s，72°C延伸 I. 5min,30個循環，72 °C冷卻，4 1至恒定。4)擴增后PCR產物由上海生工生物技術有限公司直接測序。測序結果在GENEBANK序列比較結果是CR7與腐敗希瓦氏菌的同源性達到99%,結合形態和生理生化實驗結果判斷CR7菌株屬于腐敗希瓦氏菌Qsheivanellapu trefaci ens )。實施例五CR7菌劑的制備
(I)將CR7細菌在低溫5°C條件下活化，挑選生長速度最快的單菌落菌株，試管保藏作為發酵菌劑的菌株；(2)按照配方(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1L)，配制培養基2-4L，滅菌121°C20min ；
(3)將豆粉與麩皮按照1:3的配料體積比拌好，加入體積比30%的水，每袋裝入200g拌料，包扎好后，放入滅菌鍋中，滅菌121°C 30min，24h后再121°C 30min滅菌，共滅菌2次；
(4)將保藏的菌種接種到發酵培養基中，15°C,120r/min發酵48h ；
(5)在超凈工作臺里，先用75%酒精將瓷盤滅菌，再將瓷盤紫外滅菌20min后，將滅菌的發酵料平鋪在瓷盤上，將(4)發酵好的菌液，按照固體料菌液=200g 500mL的比例，倒在瓷盤的拌料上，用滅菌的玻璃棒攪拌均勻，放在烘箱中30°C烘干；
(6)采用稀釋涂布法檢測(5)干燥菌劑中CR7的活菌數量達到IO8以上，符合國家有機·肥接種劑的標準(NY 227-94)。·實施例六CR7菌劑在冬季牛糞堆肥生產有機肥的啟動發酵作用
CR7菌劑在應用前要先擴繁，擴繁方法是在室內(10°C以上)將包裝干燥的菌劑按照I 10的體積比混拌在礱糠或麩皮等有機料中，加入總體積的30%的溫水(20-300C )，攪拌均勻，堆制發酵10-20h。按著生產有機肥的生產方法在添加配料的同時加入擴繁的CR7啟動菌劑，加入量為體積比的1:1000攪拌均勻，堆制發酵。在冬季室外溫度是0-10°C左右，堆制的新鮮牛糞中含有的微生物或者加入的中溫菌的促腐劑很難繁殖，微生物不繁殖就不會產生溫度或者微生物繁殖很慢，產生的熱量很少。加入了 CR7啟動菌劑后，CR7菌種在5°C左右就會很快繁殖。它的繁殖會不斷的產生熱量，產生的熱量就會不斷的促進周圍的微生物開始繁殖，堆肥中大量的微生物都開始繁殖必然會產生大量的熱量。這樣堆肥的溫度就很快的升高，一般加入CR7啟動菌劑堆肥48h溫度上升到50°C以上，高出不加入CR7啟動菌劑的堆肥溫度10-15°C。CR7啟動菌劑的加入是起到啟動和引領堆肥中微生物快速繁殖的作用。實施例七CR7低溫啟動菌劑與市場上公開銷售的牛糞發酵促腐劑配合使用的效果
采用實施例五制備的菌劑，按照實施例六的方法加入牛糞的堆肥中，同時加入市場上銷售的RW促腐劑(鶴壁人元生物肥技術研發中心生產)，產品使用參照產品說明書。實驗場地選在江蘇省泗洪縣谷豐化工有機肥廠。實驗設計
每一個處理組以總量10噸設計，發酵料分別為濕度為65%左右的純牛糞6-7噸，礱糠
1-2噸，草木灰I噸，處理組一 CR7固體單菌劑和RW促腐劑按照體積比的1:10混合，每10噸加入2kg ;處理組二 每10噸加入2kgRW促腐劑；對照組不加任何促腐劑。每組的肥堆設計為長X寬X高為12mXl. 5mX I. 2m的堆體,用翻拋機進行翻拋,攪拌均勻，條垛式發酵。每天上午9點和下午4點，先測定室外溫度，再用溫度計插入肥堆30-40cm下，保持lOmin，讀取肥堆的溫度，記錄數值。分別在堆肥發酵的起始和結束進行取樣。用取土器插入堆中，每堆取5個點以上。取得的樣品立即混合均勻，用密封袋冷凍保存。每處理各采集3個平行樣品。立即烘干，用中華人民共和國有機肥新標準NY525-2011測定全氮和全碳的變化，計算C/N變化和水分變化，分析堆肥是否腐熟。
實驗結果
測得每天室外平均溫度在5°C左右，處理組一，堆肥時間在48h左右，溫度上升到30°C左右，72h內肥堆溫度升到50°C以上；處理組二，堆肥時間在60h溫度上升到30°C，達到50°C需要80h ;對照組肥堆溫度基本沒有變化。重復兩次實驗證明結果一樣，加入CR7單菌劑混合的RW菌劑，肥堆啟動發酵時間縮短20h。根據有機肥新標準NY525-2011測定全氮含量由I. 78%上升至IJ 2. 01%和全碳由38. 02%降低到31. 32%, C/N由21. 36降低到15. 58，根據文獻(吳銀寶，汪植三.堆肥腐熟指標的研究.農業環境科學學報，2003，22 (2) 189-193.)C/N小于20，再結合堆肥溫度達到50°C以上有4-5d，認為堆肥達到腐熟。因此運用CR7單菌劑混合的RW菌劑可以滿足堆肥的要求，而且可以在低溫5°C條件下，啟動發酵，縮短發 酵時間20-30d左右。
權利要求
1.一株腐敗希瓦氏菌(5^(9^3/7(9773 /w/ire/aciefls) CR7菌株，它的保藏號為CGMCCNo.6192。
2.腐敗希瓦氏菌CGMCCNo. 6192在處理有機廢棄物中的應用。
3.腐敗希瓦氏菌CGMCCNo. 6192在畜禽糞便堆肥發酵中的應用。
4.腐敗希瓦氏菌CGMCCNo. 6192在制備利用畜禽糞便生產有機肥的促腐劑中的應用。
5.一種腐敗希瓦氏菌CGMCC No. 6192微生物菌劑，其特征在于腐敗希瓦氏菌CGMCCNo. 6192活菌數量達到IO8以上。
全文摘要
本發明公開了一株腐敗希瓦氏菌(shewanella putrefaciens)CR7，該菌株的保藏編號是CGMCC No.6192。該菌株分離自長期處于低溫環境的牛糞堆肥中，該菌株制成的菌劑能在冬季牛糞等畜禽糞便堆肥中應用，有快速啟動堆肥發酵，提高堆肥發酵溫度，縮短堆肥的發酵周期，減少氮元素損失的作用。該菌株制成的菌劑應用于冬季有機肥的生產，減少有機肥堆肥前期需要加溫的環節，縮短有機肥生產周期，提高產量和減少生產成本。
文檔編號C05F17/00GK102925383SQ20121038349
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者陳雙林, 張磊, 閆淑珍 申請人:南京師范大學