專利名稱：一株雞源浸麻芽孢桿菌及其制備的菌劑和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株雞源浸麻芽孢桿菌的篩選及其制備的菌劑對雞肉風味的改善應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
在厭倦少風味的飼料雞或圈養雞后，近年來，人們越來越追求散養下的口感、風味都更優的放養土雞。后院養雞作為農戶提高經濟收入的一種飼養方式。放養雞在擴大的棲息環境下，足夠的自由采食行為增加，不僅降低了飼料消耗，其雞肉風味也更受到消費者的喜愛。有別于可控制的籠養條件，雞在放養的環境中能自由接觸到各種微生物，它們隨著雞啄食行為的發生進入腸道并定殖下來，對宿主的腸道微環境的形成、穩定、營養物質的吸收或提高飼料利用轉化率都有影響。微生物菌劑添加入動物日糧中，益生菌以活的有機體形式對預防外界環境變化是 腸道菌群的紊亂作用明顯，研究表明它可直接刺激免疫器官的發育，或使SIgA生物合成增力口，提高消化道黏膜免疫功能。而芽孢桿菌類的抑菌效果已發現有促進家兔機體免疫的作用；另外，芽孢桿菌在生長繁殖過程中產生的短鏈不飽和脂肪酸能降低腸道的PH值，而有效抑制病原菌的生長；或參與多種營養物質(如維生素、氨基酸、活性酶)的合成，并參與腸道內蛋白質、脂肪、微量元素的代謝，為動物新陳代謝提供能量。對禽肉風味的大量研究揭示，脂肪族芳香化合物對雞肉風味區別于其他動物風味貢獻重大。美拉德反應、脂質降解反應以及它們產生的物質相互作用能產生大量與雞肉風味有關的揮發風味物。其中，肌肉中不飽和脂肪酸加熱產生的許多脂質氧化的產物如2反，4反-癸二烯醛和Y -十二內酯具有較低的風味閾值，對特征性雞肉風味非常重要。微生物在合成風味成分中發揮著積極的作用。比如乳酸乳球菌(LactococcusIactis)或其他乳酸菌產生了對乳制品的風味非常重要的物質一二乙酰。而谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)能提高卩比嗪類物質的含量,而增加肉中堅果和烘烤的風味。因此，通過對從160日齡健康放養雞盲腸中分離篩選出的一株浸麻芽孢桿菌，在通過模擬人工胃腸道環境的耐受試驗后，按照固體發酵最優化條件制備出粉狀微生物菌劑，直接添加入雞群飼料中，改善上市日齡時(72日齡)動物個體雞肉風味指標的應用意義重大。

發明內容
本發明的目的是提供一株從雞盲腸內容物中分離篩選出的、并通過模擬人工胃腸道環境耐受試驗的浸麻芽孢桿菌，并對該菌株以飼料原料為培養基的固體發酵條件優化，制備得到含浸麻芽孢桿菌活菌的微生物菌劑以及對改善雞肉風味上的應用。一株雞源浸麻芽孢桿菌，保藏編號=CGMCC NO. 6573。所述的雞源浸麻芽孢桿菌制備的菌劑，制備方法包括以下步驟(1)種子培養將所述的雞源浸麻芽孢桿菌菌株，在無菌條件下用接種環接I 2環于40ml液體種子培養基中，以120轉/分鐘的轉速、37°C恒溫搖床培養48h，得一級種子液；以接種環接2 3環于同樣配方的液體種子培養基中，以120轉/分鐘的轉速、37°C恒溫搖床培養36小時，得二級種子液；(2)固體發酵培養以3% 10%質量比的接種量，將二級種子液接種于經121°C、30分鐘滅菌的固體培養基中，按照料水比I : O. 9-1. 5 g/ml和容量比為8% 24%在發酵瓶進行混合后，置于恒溫培養箱上，控制環境溫度在35 42°C，并用帶4層滅菌紗布封口 ；時常拍打發酵瓶壁，使上、中、下料舒散、混合，發酵72小時，發酵結束；(3)發酵產物晾干將發酵產物于干凈搪瓷盤，加入兩倍量飼用玉米粉(過40目篩)混合均勻，平攤散開放置于通風處自然風干，當含水率低于10%時結束風干過程，收集產物并粉碎，過40目篩，所得粉末即為含浸麻芽孢桿菌活菌的固體發酵成品。所述固體培養基的配方，按質量百分含量計2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化鈉，O. 5%牛肉膏，I. 7%瓊脂粉，加滅菌水至完全溶解，調節pH至6. 8 7，高壓121 °C滅菌30分鐘后冷卻備用；
所述液體培養基的配方，按質量百分含量計2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化鈉，
O.5%牛肉膏，加滅菌水至完全溶解，調節pH至6. 8 7，高壓121°C滅菌30分鐘后冷卻備用；上述固體發酵培養基配方及制備方法為以百分比計，將玉米、豆柏、麥麩打碎過40目篩，按照玉米600g，豆柏300g，麥麩50g，高壓115°C滅菌15分鐘，冷卻后無菌條件下加磷酸緩沖液1000ml,自然pH即可。所述菌劑的應用，育雛階段按O. 15wt%浸麻芽孢桿菌微生物菌劑添加入飼料中；育成階段到上市日齡按O. lwt%浸麻芽孢桿菌微生物菌劑添加入飼料中。本發明從160日齡成年放養公雞的盲腸內容物中分離篩選出一株浸麻芽孢桿菌，并優化菌株的固體發酵條件以提高有效活菌數的含量，每克固體發酵成品中浸麻芽孢桿菌活菌數達到6. 9X 109CFU/mL ;將該微生物菌劑添加到禽飼料中，飼喂籠養雞群以開發出風味更佳的雞肉。本發明通過從健康成年160日齡放養公雞的盲腸內容物分離出一株浸麻芽孢桿菌。在經歷人工胃腸道環境耐受選擇后，優化該菌株的固體發酵條件并生產出含足夠活菌數的浸麻芽孢桿菌微生物菌劑。本發明將微生物活菌制劑直接添加入飼料，籠養雞肉中具有特征“雞香味”揮發性風味組分和含量得到了顯著地提高。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例I :(I)宿主選擇從散養雞農戶處選購一只健康的160日齡公雞；除飼喂基礎日糧夕卜，動物個體在充足的戶外活動中自由覓食；(2)菌種分離與篩選分離自散養雞盲腸內容物；取2g內容物置于80°C恒溫水浴鍋內IOmin后，直接涂抹于芽孢桿菌固體培養基上，37°C培養24小時；將芽孢桿菌固體培養基上生長所占比例最高的單個菌落重新接種在新的芽孢桿菌固體培養基上，37°C培養24小時；(3)菌株保藏步驟(2)篩選得到的浸麻芽孢桿菌SCS3菌株已于2012年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號=CGMCC NO. 6573,分類命名浸麻芽孢桿菌Bacillus macerans。(4)人工胃液耐受試驗將(3)所述菌株，在無菌條件下按照系列稀釋法在pH2 4的人工胃液中培養2小時，并進行稀釋平板計數計算活菌數，以O小時活菌數為參照；人工胃液配方為依據中國藥典2010版，取稀鹽酸16. 4毫升，加水約800毫升與胃蛋白酶10克，搖勻后，加水稀釋成1000毫升即得，放入4°C冰箱備用；(5)菌落計數以系列稀釋法進行平板計數，結果為(3)所述菌種浸麻芽孢桿菌經人工胃液耐受試驗后活菌數在PH2人工胃液中培養O小時后活菌數為2. 12X IO6CFU/mL，兩小時后活菌數為2. 34 X 106CFU/mL ;在pH3人工胃液中培養O小時后活菌數為
3.lX106CFU/mL，兩小時后活菌數為I. 3X106CFU/mL ;在？財人工胃液中培養O小時后活菌數為3. 3X 106CFU/mL，兩小時后活菌數為2. 45 X 106CFU/mL。(6)人工胰液耐受試驗將(3)所述菌株，在無菌條件下按照系列稀釋法再人工腸液中培養O 3小時，并進行稀釋平板計數計算活菌數，以O小時活菌數為參照。人工胰液配方為依據中國藥典2010版，取磷酸二氫鉀6. 8克，加水500毫升溶解，用O. 4%氫氧化鈉回調pH至6. 8，每100毫升液體加入I克胰蛋白酶，混勻，用O. 2微米的無菌濾頭過濾后即得，放入4°C冰箱備用。(7)菌落計數以系列稀釋法進行平板計數，結果為上述步驟(3)所述菌種浸麻芽孢桿菌經人工胰液耐受試驗后活菌數在O小時培養后為2. 6X 107CFU/mL，培養2小時后為 I. 52X 107CFU/mL，培養 3 小時后為 3. 6 X 107CFU/mL。(8)人工膽鹽溶液耐受試驗將(3)所述菌株，在無菌條件下按照系列稀釋法再0% O. 3%四個濃度梯度的人工膽鹽溶液中培養O 4小時，并進行稀釋平板計數計算活菌數，以0%濃度下培養O小時的活菌數為參照。人工膽鹽溶液配方為依據中國藥典2010版，稱取I. 5克豬膽鹽加入到有100毫升O. 5%滅菌氯化鈉溶液的三角瓶中，再加入O. I克胰蛋白酶，搖勻，調pH值至7. O,即制備成含膽鹽I. 5%的膽鹽溶液，放入4°C冰箱備用；(9)菌落計數以系列稀釋法進行平板計數，結果為(3)所述菌種浸麻芽孢桿菌經人工膽鹽溶液耐受試驗后活菌數在O. 1%濃度人工膽鹽溶液培養O小時后為7. 8X107CFU/mL,培養4小時后為4. 6 X 107CFU/mL ;活菌數在O. 2%濃度人工膽鹽液培養O小時后為5. OXlO7 CFU/mL,培養4小時后為I. 4 X IO7 CFU/mL ;在O. 3%濃度人工膽鹽液培養O小時活菌數為5. OX 107CFU/mL，培養4小時后為2. 9 X 106CFU/mL。(10)浸麻芽孢桿菌種子培養將(3)所述浸麻芽孢桿菌SCS3斜面活化(芽孢桿菌固體培養基按百分含量計，2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化鈉，O. 5%牛肉膏，I. 7%瓊脂粉，力口滅菌水至完全溶解，調節pH至6. 8 7，高壓121°C滅菌30分鐘后冷卻，置于37±2°C生化培養箱培養18h ;在無菌條件下用接種環接I 2環于40ml液體種子培養基中，以120轉/分鐘的轉速、37°C恒溫搖床培養48h，得一級種子液；以接種環接2 3環于同樣配方的液體種子培養基中，以120轉/分鐘的轉速、37°C恒溫搖床培養36小時，得二級種子液。菌落計數以系列稀釋法進行平板計數，二級種子液活菌含量為6. OX 109CFU/mL的發酵液。
上述液體發酵種子培養基及制備方法為按百分含量計，2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化鈉，O. 5%牛肉膏，加滅菌水至完全溶解，調節pH至6. 8 7，高壓121 °C滅菌30分鐘后冷卻備用。實施例2 (I)菌種于2012年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號=CGMCCNO. 6573,分類命名浸麻芽抱桿菌Bacillus macerans。(2)種子培養將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下用接種環接I 2環于40ml液體種子培養基中，以120轉/分鐘的轉速、37°C恒溫搖床培養48h，得一級種子液；(3)以接種環接2 3環于同樣配方的液體種子培養基中，以120轉/分鐘的轉速、37°C恒溫搖床培養36小時，得二級種子液。 (4)固體發酵培養將步驟(I)所述浸麻芽孢桿菌以5%質量比的接種量，將二級種子液接種于經121°C、30分鐘滅菌的固體培養基中，按照料水比為1:1. I g/ml和容量比為16%接入發酵瓶，混合后置于生化培養箱內，并用帶4層滅菌紗布瓶口，溫度控制為42°C ;時常拍打發酵瓶壁，使培養基舒散、上下料混合，發酵72小時，發酵結束；(5)發酵產物晾干將步驟(4)發酵產物于干凈搪瓷盤，加入兩倍量飼用玉米粉(過40目篩)混合均勻，平攤散開放置于通風處自然風干，當含水率低于10%時結束風干過程，收集產物并粉碎，過40目篩，所得粉末即為含浸麻芽孢桿菌的固體發酵成品。(6)菌落計數利用系列稀釋法對含浸麻芽孢桿菌活菌的固體發酵成品進行菌落計數，結果為浸麻芽孢桿菌微生物菌劑的有效活菌數為6. 9 X IO9/克發酵成品。上述液體發酵種子培養基及制備方法為按百分含量計，2%葡萄糖，1%蛋白胨，
0.5%氯化鈉，O. 5%牛肉膏，加滅菌水至完全溶解，調節pH至6. 8 7，高壓121 °C滅菌30分鐘后冷卻備用。上述固體發酵培養基及制備方法為以百分比計，將玉米、豆柏、麥麩打碎過40目篩，按照玉米600g,豆柏320g,麥麩50g,高壓115°C滅菌15分鐘,冷卻后無菌條件下按I :
1.I g/ml加磷酸緩沖液，自然pH即可。實施例3 本發明發酵產品的動物試驗使用效果。本實例在四川農業大學家禽育種場進行，選擇健康I日齡雛雞60只(公雞)，隨機分成2個處理，每個處理2個重復，每個重復15只雛雞，分別為空白對照組和本發明浸麻芽孢桿菌發酵組，試驗期72天；本發明浸麻芽孢桿菌發酵組本發明含浸麻芽孢桿菌活菌的發酵微生物菌劑，活菌數> IO9CFU/克，育雛階段(I日齡 42日齡)按O. 15被％浸麻芽孢桿菌微生物菌劑添加入飼料中；育成階段到上市日齡(43日齡 72日齡)按O. lwt%浸麻芽孢桿菌微生物菌劑添加入飼料中；屠宰與雞胸肉的收集達到72日齡時，從空白對照組和本發明浸麻芽孢桿菌發酵組隨機抽出6只健康雞(每個重復3只);經放血、去羽毛后，統一取整塊左胸肌肉；每個個體的雞胸肉取4克，絞碎后裝袋、標記后放入_20°C保存；整個屠宰取樣過程在I小時內完成。雞胸肉風味測定前準備將雞胸肉樣本放置于4°C冰箱，熟化過夜；帶標記的重復組內兩個體的雞胸肉混合成一個測定樣本，即兩個試驗組共有4個測定樣本。雞胸肉風味測定采用頂空固相微萃取技術萃取雞胸肉中揮發性物質，并用氣相色譜-質譜聯用技術分析雞胸肉中揮發性成分和含量；
雞胸肉風味結果與分析表I.本發明浸麻芽孢桿菌發酵組和空白對照組雞胸肉中揮發性風味成分的比較
權利要求
1.一株雞源浸麻芽孢桿菌，保藏編號CGMCC NO. 6573。
2.根據權利要求I所述的雞源浸麻芽孢桿菌制備的菌劑，其特征在于，制備方法包括以下步驟(I)種子培養將所述的雞源浸麻芽孢桿菌菌株，在無菌條件下用接種環接I 2環于40ml液體種子培養基中，以120轉/分鐘的轉速、37°C恒溫搖床培養48h，得一級種子液；以接種環接2 3環于同樣配方的液體種子培養基中，以120轉/分鐘的轉速、37°C恒溫搖床培養36小時，得二級種子液； (2)固體發酵培養以3% 10%質量比的接種量，將二級種子液接種于經121°C、30分鐘滅菌的固體培養基中，按照料水比I : O. 9-1. 5 g/ml和容量比為8% 24%在發酵瓶進行混合后，置于恒溫培養箱上，控制環境溫度在35 42 °C，并用帶4層滅菌紗布封口 ；時常拍打發酵瓶壁，使上、中、下料舒散、混合，發酵72小時，發酵結束； (3)發酵產物晾干將發酵產物于干凈搪瓷盤，加入兩倍量飼用玉米粉(過40目篩)混合均勻，平攤散開放置于通風處自然風干，當含水率低于10%時結束風干過程，收集產物并粉碎，過40目篩，所得粉末即為含浸麻芽孢桿菌活菌的固體發酵成品。
所述固體培養基的配方，按質量百分含量計2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化鈉，O. 5%牛肉膏，I. 7%瓊脂粉，加滅菌水至完全溶解，調節pH至6. 8 7，高壓121°C滅菌30分鐘后冷卻備用； 所述液體培養基的配方，按質量百分含量計2%葡萄糖，1%蛋白胨，O. 5%氯化鈉，O. 5%牛肉膏，加滅菌水至完全溶解，調節pH至6. 8 7，高壓121°C滅菌30分鐘后冷卻備用； 上述固體發酵培養基配方及制備方法為以百分比計，將玉米、豆柏、麥麩打碎過40目篩，按照玉米600g，豆柏300g，麥麩50g，高壓115°C滅菌15分鐘，冷卻后無菌條件下加磷酸緩沖液1000ml，自然pH即可。
3.根據權利要求2所述菌劑的應用，其特征在于，育雛階段按O.15#%浸麻芽孢桿菌微生物菌劑添加入飼料中；育成階段到上市日齡按O. lwt%浸麻芽孢桿菌微生物菌劑添加入飼料中。
全文摘要
本發明公開了一株雞源浸麻芽孢桿菌及其制備的菌劑和應用，雞源浸麻芽孢桿菌保藏編號CGMCC NO.6573。育雛階段按0.15wt%浸麻芽孢桿菌微生物菌劑添加入飼料中；育成階段到上市日齡按0.1wt%浸麻芽孢桿菌微生物菌劑添加入飼料中。本發明通過從健康成年160日齡放養公雞的盲腸內容物分離出一株浸麻芽孢桿菌。在經歷人工胃腸道環境耐受選擇后，優化該菌株的固體發酵條件并生產出含足夠活菌數的浸麻芽孢桿菌微生物菌劑。本發明將微生物活菌制劑直接添加入飼料，籠養雞肉中具有特征“雞香味”揮發性風味組分和含量得到了顯著地提高。
文檔編號A23K1/16GK102899274SQ201210430869
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月1日 優先權日2012年11月1日
發明者孫靜, 劉益平, 李念珍, 熊彥, 朱慶, 鐘航 申請人:四川農業大學