專利名稱：醉魂藤外植體滅菌接種方法
技術領域：
本發明屬于植物外植體滅菌接種領域，特別是醉魂藤外植體滅菌接種技術領域。
背景技術：
醉魂藤，拉丁名Heterostemma alatum Wight,為蘿蘑科醉魂藤屬的植物。分布于印度、尼泊爾以及中國大陸的云南、貴州、廣西、廣東、四川等地，生長于海拔1，200米的地區，常生于山谷水旁林中蔭濕處，目前尚未由人工引種栽培。醉魂藤可入藥，其根可治療風濕。現已運用多種色譜技術從云南產醉魂藤Heterostemma alatum wight中分離得到10個化合物。通過理化鑒別和波譜數據確定了他們的化合物結構分別為￠-谷留醇(I)、正二十四烷酸(2)、芹菜素(3)、胡蘿卜苷(4)、芹菜素-7-0-0-D-葡萄糖苷(5)、醉魂藤堿A (6)、醉魂藤堿B (7)、醉魂藤堿C (8)、醉魂藤堿D (9)和醉魂藤堿F (10)。因此利用組培技術 大量繁殖該植物育有重要的生物和醫學意義。醉魂藤外植體滅菌以往先用自來水清洗，再用70%酒精漂洗，然后用3%安替福民溶液浸泡30分鐘，用無菌水沖洗3次，用無菌紙吸干后進行接種。由于醉魂藤外植體莖干較細弱，傳統滅菌方法使外植體死亡率和污染率較高，因此找到合適的消毒藥劑和合適的消毒時間是完善醉魂藤組培快繁的必要舉措。

發明內容
本發明的目的是提供一種更加適合醉魂藤外植體滅菌的方法。實現上述目的采用下述技術方案一種醉魂藤外植體滅菌接種方法，包括如下步驟(I)剪取醉魂藤休眠枝或當年生新梢莖段；(2)用消毒劑消毒；( 3 )再用滅菌劑滅菌；(4)滅菌后立即用無菌水清洗3次；(5)在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于培養基進行組織培養。進一步，所述的消毒劑為70%酒精，消毒時間為5-lOs。進一步，所述的滅菌劑為0. 1%升汞，滅菌時間為10_20min。進一步，所述的培養基是1/2MS培養基，培養條件是光照強度2000LX，溫度26°C，光照時間14h/d。1/2MS培養基是購自上海士鋒生物科技有限公司的，與MS培養基相比，大量元素減半，微量元素和維生素的成分不變。本發明的有益效果是使用上述外植體滅菌方法，提高了存活率和萌芽率達，同時降低了污染率。
具體實施方式
實施例1
休眠枝對照組消毒藥劑及其用法70%酒精，3%安替福民。酒精浸泡35s后，在安替福民溶液中的休眠枝浸泡時間為30min。經過安替福民消毒過的休眠枝，在休眠枝消毒后均立即用無菌水清洗3次，在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于1/2MS培養基上。
休眠枝實驗組消毒藥劑及其用法酒精中浸泡35s，在升汞溶液中的休眠枝浸泡時間分為15min，在休眠枝消毒后均立即用無菌水清洗3次，在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于1/2MS培養基上。
實驗材料及方法
將醉魂藤莖段接種后，均放在培養室培養，培養條件為光照強度2000LX，溫度 26°C，光照時間14h/d。培養2周后觀察接種莖段的污染率和萌芽率等指標，其中污染率=受污染莖段數/接種莖段數X 100%，萌芽率=萌芽的未受污染莖段數/未受污染莖段X 100%。
在該組4000株莖段中，2000株使用安替福民溶液滅菌30min的污染率為69%，而剩余2000株使用升汞溶液滅菌15min的污染率為30%，活率達70%，萌芽率達65%。
實施例2
當年生新梢對照組消毒藥劑及其用法70%酒精，3%安替福民。酒精浸泡IOs后，在安替福民溶液中的當年生新梢浸泡時間為20min。經過安替福民消毒過的當年生新梢，在當年生新梢消毒后均立即用無菌水清洗3次，在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于1/2MS培養基上。
當年生新梢實驗組消毒藥劑及其用法酒精中浸泡10s，在升汞溶液中的當年生新梢浸泡時間為lOmin，在當年生新梢消毒后均立即用無菌水清洗3次，在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于1/2MS培養基上。
實驗材料及方法
將醉魂藤當年生新梢莖段接種后，均放在培養室培養，培養條件為光照強度 2000Lx，溫度26°C，光照時間14h/d。培養2周后觀察接種莖段的污染率和萌芽率等指標， 其中污染率=受污染莖段數/接種莖段數X 100%,萌芽率=萌芽的未受污染莖段數/未受污染莖段X 100%。
在該組4000株莖段中，2000株使用安替福民溶液滅菌20min的污染率為70%，而剩余2000株使用升汞溶液滅菌IOmin的污染率為15%，存活率達85%，萌芽率達80%。
實施例3
休眠枝對照組消毒藥劑及其用法70%酒精，3%安替福民。酒精浸泡35s后，在安替福民溶液中的休眠枝浸泡時間為30min。經過安替福民消毒過的休眠枝，在休眠枝消毒后均立即用無菌水清洗3次，在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于1/2MS培養基上。
休眠枝實驗組消毒藥劑及其用法酒精中浸泡40s，在升汞溶液中的休眠枝浸泡時間分為20min，在休眠枝消毒后均立即用無菌水清洗3次，在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于1/2MS培養基上。
實驗材料及方法
將醉魂藤莖段接種后，均放在培養室培養，培養條件為光照強度2000LX，溫度 26°C，光照時間14h/d。培養2周后觀察接種莖段的污染率和萌芽率等指標，其中污染率=受污染莖段數/接種莖段數X 100%，萌芽率=萌芽的未受污染莖段數/未受污染莖段X 100%。
在該組4000株莖段中，2000株使用安替福民溶液滅菌30min的污染率為69%，而 剩余2000株使用升汞溶液滅菌15min的污染率為20%，存活率達80%，萌芽率達75%。
權利要求
1.一種醉魂藤外植體滅菌接種方法，包括如下步驟(1)剪取醉魂藤休眠枝或當年生新梢莖段；(2)用消毒劑消毒；(3)再用滅菌劑滅菌；(4)滅菌后立即用無菌水清洗3次；(5)在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于培養基進行組織培養。
2.如權利要求1所述的醉魂藤外植體滅菌接種方法，其特征在于，所述的消毒劑為70% 酒精，消毒時間為30-40S。
3.如權利要求1所述的醉魂藤外植體滅菌接種方法，其特征在于，所述的滅菌劑為O.1%升汞，滅菌時間為10-20min。
4.如權利要求1所述的醉魂藤外植體滅菌接種方法，其特征在于，所述的培養基是 1/2MS培養基，培養條件是光照強度2000Lx，溫度26°C，光照時間14h/d。
全文摘要
本發明公開了一種醉魂藤外植體滅菌接種方法，包括如下步驟(1)剪取醉魂藤休眠枝或當年生新梢莖段；(2)用消毒劑消毒；(3)再用滅菌劑滅菌；(4)滅菌后立即用無菌水清洗3次；(5)在無菌培養皿中切取外植體莖段接種于培養基進行組織培養。本發明的有益效果是使用上述外植體滅菌方法，提高了存活率和萌芽率達，同時降低了污染率。
文檔編號A01H4/00GK102986531SQ20121049160
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者楊鐵順, 趙亮, 柯盛發, 郭笑非, 劉青, 吳建平, 閔宇 申請人:天津濱海國際花卉科技園區股份有限公司