一種大葉藻野生外植體獲取方法
【專利摘要】本發明涉及一種大葉藻野生外植體的獲取方法，步驟是：在大葉藻長勢旺盛的海域將其植株挖出，就地清洗根、莖上底泥，在室內將克隆幼苗從主枝上折下，放入天然海水中，于光照培養箱中暫養，3-5天后將天然海水換為滅菌天然海水繼續培養；5天后，選出根狀莖含有5個節以上幼苗，于超凈工作臺上進行修剪；將修剪后的幼苗先用滅菌海水洗3-5次，再放入10％的過氧化氫溶液中浸泡15分鐘，滅菌海水再洗5次；將消毒過的幼苗進行再修剪以獲得目的外植體，如根尖、莖尖或根狀莖，用于接種。本發明保障了大葉藻組織培養中以野生植株為外植體供體時初代培養中的低污染率和低致死率，為大葉藻組織培養的成功提供了最基本的技術支持。
【專利說明】 一種大葉藻野生外植體獲取方法

【技術領域】
[0001]本發明所屬植物組織培養【技術領域】，涉及一種大葉藻野生外植體的獲取方法。

【背景技術】
[0002]大聽薇(Zostera marina L.)是全球72種海草的代表種,廣泛分布于北半球溫帶海域，在我國山東、河北和遼寧近海也有分布。雖然許多陸生植物的組織培養技術均已成熟，但作為單子葉植物的海草的組織培養技術卻歷經四十多年的研究仍無大的突破，其中一個重要的原因就是無合適野生外植體的獲取方法。
[0003]雖然因種子對消毒劑的耐受性較強，且實生苗生理年齡最幼，無菌實生苗被認為是大葉藻組織培養的最佳外植體選擇，但大葉藻種子產量小、保存時間有限、種子萌發率也存在不確定性，因此，有必要尋求野生外植體的獲取方法，以保證大葉藻組織培養外植體獲取方法的多樣性。
[0004]研究表明，由于大葉藻葉表皮細胞無角質層、葉和莖組織中散布有大量氣道、根中也有許多氣體空腔，所以以野生植株為組織培養的外植體供體時，消毒劑濃度和消毒時間極難掌握，致使外植體消毒常處于過或不及的兩難境地，初代培養也因此多以失敗告終。本發明通過對野生大葉藻克隆幼苗進行前期培養并加以有效的表面消毒方法，大大提高了大葉藻野生外植體的有效獲得率，目前采用該技術方案的相關專利和文獻未見報導。


【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種能保證初代培養中外植體低污染率和低致死率的大葉藻野生外植體獲取方法。
[0006]本發明的技術方案為:一種大葉藻野生外植體獲取方法，以大葉藻新發出的克隆幼苗為外植體供體，通過對其進行室內預培養后再獲取易于消毒的大葉藻野生外植體，其獲取的具體步驟如下:
(1)克隆片段的野外采集:選擇環境良好、大葉藻長勢旺盛的海域，將大葉藻植株挖出，就地清洗根莖上的底泥，將帶有多個克隆幼苗的克隆片段在冷藏條件下帶回實驗室；
(2)克隆幼苗的室內暫養:將克隆片段上的幼苗從主枝上折下，放入裝有天然海水的100ml燒杯中，于光照培養箱中培養，3-5天后將天然海水換為滅菌天然海水繼續于培養箱中培養；
(3)外植體供體選擇和修剪:滅菌海水中培養5天后即可進行外植體選擇，將根狀莖含有5個節以上的克隆幼苗選出，于超凈工作臺上進行修剪；
(4)外植體消毒:將修剪后的幼苗先用滅菌天然海水沖洗3-5次，放入10%的過氧化氫溶液中浸泡15分鐘，用滅菌海水沖洗5次；
(5)外植體再修剪:在接種前，將消毒過的幼苗進行再修剪，以獲得目的外植體，如根尖、莖尖或根狀莖，用于接種。
[0007]本發明的優點在于:以大葉藻新發出的克隆幼苗為外植體供體，利用了克隆幼苗旺盛的生長特性；通過對其進行室內預培養，大大降低了外植體供體的帶菌率，預培養中水溫的緩慢變化為供體提供了適應日后培養溫度的時間；表面消毒前修剪過的外植體較一般外植體大，不將根、莖和莖尖切下進行獨立消毒，增加了外植體對消毒液的耐受力；過氧化氫溶液消毒前略去了常規外植體表面消毒過程中的70-75%酒精浸泡環節，減少了酒精對氣孔豐富的水生植物的傷害；過氧化氫溶液殘留后分解會變成氧氣，無后毒。
[0008]

【具體實施方式】
[0009]本發明所述的一種有效減少污染率的大葉藻無菌實生苗的培養方法包括以下實施例，下面的實施例可進一步說明本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0010]實施例1:一種大葉藻莖尖外植體的獲取方法，其實施步驟包括:
(1)克隆片段的野外采集:于大潮低潮時在海域采集大葉藻植株，用鐵锨將大葉藻連同根莖一起從底泥中挖出，就地清洗根莖上的底泥，將帶有多個克隆幼苗的克隆片段裝入塑料自封帶冷藏條件下帶回實驗室；
(2)克隆幼苗的室內暫養:將克隆片段上的幼苗從與主枝連接處折斷，并將幼苗端部已開始脫落腐爛的葉片和葉鞘以及一些老根都清理掉，5個一組放入裝有天然海水的100ml燒杯中，于光照培養箱中培養，培養條件為:光照強度30001UX，光照:黑暗=12h:12h，溫度最初與種源海域相近(如海域水溫低于10°C，則培養箱最低溫只能設為10°C)，日后每天升或降1°C，最終接近15°C。3-5天后將天然海水換為滅菌天然海水繼續于培養箱中培養，在將幼苗放入滅菌海水前要清理脫落葉片，并將根狀莖的前端剪去一小截；
(3)外植體選擇和修剪:滅菌海水中培養5天后即可進行外植體選擇，將根狀莖含有5個節以上的克隆幼苗選出，放入空的滅菌大燒杯中，于超凈工作臺上進行修剪，剪去根狀莖前端一個節間，剝去外層老葉，只留里面的3-4片葉，并將葉片前端剪去，留3cm長，只留最幼的兩族不定根；
(4)外植體消毒:將修剪后的幼苗放入新的滅菌培養瓶中，用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干，再放入10%的過氧化氫溶液(加0.1%吐溫,過氧化氫溶液用滅菌海水來稀釋配制)中消毒15分鐘，再用滅菌天然海水沖洗5次；
(5)外植體再修剪:將根狀莖前端的根莖切除一個莖節，可取其莖的節間、節或帶節的節間為外植體進行莖培養。
[0011]本實施例所用光照培養箱為上海博訊SPX-250B-G型光照培養箱。
[0012]實施例2:—種大葉藻莖外植體的獲取方法，其步驟為:
(1)克隆片段的野外采集:于大潮低潮時在海域采集大葉藻植株，用鐵锨將大葉藻連同根莖一起從底泥中挖出，就地清洗根莖上的底泥，將帶有多個克隆幼苗的克隆片段裝入塑料自封帶冷藏條件下帶回實驗室；
(2)克隆幼苗的室內暫養:將克隆片段上的幼苗從與主枝連接處折斷，并將幼苗端部已開始脫落腐爛的葉片和葉鞘以及一些老根都清理掉，5個一組放入裝有天然海水的100ml燒杯中，于光照培養箱中培養，培養條件為:光照強度30001UX，光照:黑暗=12h:12h，溫度最初與種源海域相近(如海域水溫低于10°C，則培養箱最低溫只能設為10°C)，日后每天升或降1°C，最終接近15°C。3-5天后將天然海水換為滅菌天然海水繼續于培養箱中培養，在將幼苗放入滅菌海水前要清理脫落葉片，并將根狀莖的前端剪去一小截；
(3)外植體選擇和修剪:滅菌海水中培養5天后即可進行外植體選擇，將根狀莖含有5個節以上的克隆幼苗選出，放入空的滅菌大燒杯中，于超凈工作臺上進行修剪，剪去根狀莖前端一個節間，剝去外層老葉，只留里面的3-4片葉，并將葉片前端剪去，留3cm長，只留最幼的兩族不定根；
(4)外植體消毒:將修剪后的幼苗放入新的滅菌培養瓶中，用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干，再放入10%的過氧化氫溶液(加0.1%吐溫,過氧化氫溶液用滅菌海水來稀釋配制)中消毒15分鐘，再用滅菌天然海水沖洗5次；
(5)外植體再修剪:將葉片進行剝離后，留3-5_長的莖尖為外植體進行培養。
[0013]本實施例所用光照培養箱為上海博訊SPX-250B-G型光照培養箱。
[0014]實施例3:—種大葉藻根外植體的獲取方法，其步驟為:
(1)克隆片段的野外采集:于大潮低潮時在海域采集大葉藻植株，用鐵锨將大葉藻連同根莖一起從底泥中挖出，就地清洗根莖上的底泥，將帶有多個克隆幼苗的克隆片段裝入塑料自封帶冷藏條件下帶回實驗室；
(2)克隆幼苗的室內暫養:將克隆片段上的幼苗從與主枝連接處折斷，并將幼苗端部已開始脫落腐爛的葉片和葉鞘以及一些老根都清理掉，5個一組放入裝有天然海水的100ml燒杯中，于光照培養箱中培養，培養條件為:光照強度30001UX，光照:黑暗=12h:12h，溫度最初與種源海域相近(如海域水溫低于10°C，則培養箱最低溫只能設為10°C)，日后每天升或降1°C，最終接近15°C。3-5天后將天然海水換為滅菌天然海水繼續于培養箱中培養，在將幼苗放入滅菌海水前要清理脫落葉片，并將根狀莖的前端剪去一小截；
(3)外植體選擇和修剪:滅菌海水中培養5天后即可進行外植體選擇，將根狀莖含有5個節以上的克隆幼苗選出，放入空的滅菌大燒杯中，于超凈工作臺上進行修剪，剪去根狀莖前端一個節間，剝去外層老葉，只留里面的3-4片葉，并將葉片前端剪去，留3cm長，只留最幼的兩族不定根；
(4)外植體消毒:將修剪后的幼苗放入新的滅菌培養瓶中，用滅菌天然海水沖洗3-5次，用滅菌濾紙將水吸干，再放入10%的過氧化氫溶液(加0.1%吐溫,過氧化氫溶液用滅菌海水來稀釋配制)中消毒15分鐘，再用滅菌天然海水沖洗5次；
(5)外植體再修剪:將消毒過的兩簇幼葉在無菌培養皿中切下，再切取根尖3-5mm長進行培養。
[0015]本實施例所用光照培養箱為上海博訊SPX-250B-G型光照培養箱。
【權利要求】
1.一種大葉藻野生外植體獲取方法，其特征在于獲取的具體步驟如下: (1)克隆片段的野外采集:選擇海域環境良好、大葉藻長勢旺盛的海域，將大葉藻植株挖出，就地清洗根莖上的底泥，將帶有多個克隆小苗的克隆片段在冷藏條件下帶回實驗室; (2)克隆小苗的室內暫養:將克隆幼苗從與主枝上折下，放入裝有天然海水的100ml燒杯中，于光照培養箱中培養，3-5天后將天然海水換為滅菌天然海水繼續于培養箱中培養; (3)外植體供體選擇和修剪:滅菌海水中培養5天后即可進行外植體選擇，將根狀莖含有5個節以上的克隆幼苗選出，于超凈工作臺上進行修剪； (4)外植體消毒:將修剪后的小苗先用滅菌天然海水沖洗3-5次，再放入10%的過氧化氫溶液中浸泡15分鐘，用滅菌海水沖洗5次； (5)外植體再修剪:在接種前，將消毒過的幼苗進行再修剪，以獲得目的外植體，如 根尖、莖尖或根狀莖，用來接種。
【文檔編號】A01H4/00GK104126503SQ201310431214
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】鄭鳳英, 李樂樂, 陳玉, 金艷梅, 韓曉弟, 劉雪芹, 竇國棟 申請人:山東大學（威海）