專(zhuān)利名稱(chēng)：具有改良生長(zhǎng)特性的木本植物及其產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及用于改良植物生長(zhǎng)特性的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于從表型上改良植物和轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述植物中在木質(zhì)形成不同階段特異性表達(dá)之基因的表達(dá)發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致改良的生長(zhǎng)表型。本發(fā)明還提供了本發(fā)明方法中使用的構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，林木改造和分子育種的主要目標(biāo)是改進(jìn)樹(shù)木的質(zhì)量和產(chǎn)量。全球?qū)δ静闹破返男枨笳悦磕昙s1. 7%的速度增長(zhǎng)，而這種木材消耗的增長(zhǎng)是在已達(dá)到或超過(guò)世界森林中的最高可持續(xù)收獲率的情況下發(fā)生的。因此，需要在世界范圍內(nèi)提高栽植木材的產(chǎn)量。森林栽植還可具有作為碳匯作物(carbon sequestration crop)應(yīng)對(duì)大氣CO2增加的優(yōu)點(diǎn)。類(lèi)似地，也需要提高來(lái)自非木本植物的生物量產(chǎn)生，例如為了滿(mǎn)足對(duì)能源生產(chǎn)原材料的需求。因此，對(duì)高等物種細(xì)胞發(fā)育期間特定過(guò)程的改良是具有巨大商業(yè)價(jià)值的，這不僅包括改良樹(shù)木的特性，還包括對(duì)其它植物的改良。依靠頂端分生組織進(jìn)行的植物生長(zhǎng)導(dǎo)致了一系列初生組織的發(fā)育以及莖和根的伸長(zhǎng)。除了這種初生生長(zhǎng)之外，樹(shù)木種類(lèi)還會(huì)經(jīng)歷次生生長(zhǎng)并產(chǎn)生來(lái)自形成層的次生組織“木質(zhì)”。所述次生生長(zhǎng)增加了莖和根的周長(zhǎng)。Sterky 等 1998 (Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1998 (95)，13330-13335)已公布了針對(duì)兩個(gè)楊屬物種的大規(guī)模基因探索計(jì)劃的結(jié)果，包括來(lái)自歐洲山楊X美洲山楊(Populustremula L. Xtremuloides Michx.)和毛果楊(Populus trichocarpa “Tfichobel，，)之木質(zhì)形成組織的5，629個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。這些EST代表了針對(duì)兩個(gè)cDNA文庫(kù)的總共3，719種獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄物，并且這些轉(zhuǎn)錄物中的2，245種具有推定的功能。作者表示，所展示的EST數(shù)據(jù)對(duì)于鑒定參與植物次生木質(zhì)部和韌皮部形成的基因?qū)⒕哂袃r(jià)值，但對(duì)于如何進(jìn)行鑒定則沒(méi)有給出清楚的指導(dǎo)。Sterky等1998的文章還揭示了一大批功能未知或未確定的EST的存在。在現(xiàn)有技術(shù)(例如Sterky等1998)中，從分離自活躍生長(zhǎng)樹(shù)木的莖組織構(gòu)建文庫(kù)。從多種組織的混合物制備形成層的文庫(kù)，包括歐洲山楊X美洲山楊的發(fā)育中的木質(zhì)部、分生組織形成層以及發(fā)育中及成熟的韌皮部。這些形成層組織是通過(guò)剝離樹(shù)皮并用解剖刀刮擦兩個(gè)暴露表面而獲得的。從毛果楊制備發(fā)育中的木質(zhì)部文庫(kù)。這些組織是通過(guò)剝離樹(shù)皮并刮擦暴露的木質(zhì)部一側(cè)而獲得的。使用所述方法只可能建立分別代表完整形成層、發(fā)育中的木質(zhì)部以及韌皮部(利用刮擦暴露的樹(shù)皮來(lái)制備)的三個(gè)不同文庫(kù)。現(xiàn)有技術(shù)對(duì)形成層中的基因表達(dá)與發(fā)育中木質(zhì)部組織中的基因表達(dá)進(jìn)行了比較。由于組織制備實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)的局限性，該實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了粗略的比較。用于制備發(fā)育中木質(zhì)部文庫(kù)的組織包含從擴(kuò)大中的木質(zhì)部細(xì)胞到晚期木質(zhì)部發(fā)育的組織。還有一個(gè)問(wèn)題是如何鑒定可能最具重要性的基因并將其與特定發(fā)育階段和細(xì)胞最終特性聯(lián)系起來(lái)。另一問(wèn)題是如何鑒定至今未知的基因，將其與植物中的特定細(xì)胞類(lèi)型和/或功能聯(lián)系起來(lái)。最后，一個(gè)特別的問(wèn)題是如何發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞擴(kuò)大、細(xì)胞壁合成、凋亡和程序性細(xì)胞死亡以及與決定樹(shù)木生長(zhǎng)和木質(zhì)特性有關(guān)的其它重要過(guò)程的特定基因。 Hertzberg 等 2001 (Proc. Natl. Acad. Sc1. USA，2001 (98)，14372-14737)和Schrader等2005 (Plant Cell, (16)，2278-2292)已利用轉(zhuǎn)錄物特征譜來(lái)揭示木質(zhì)部發(fā)育期間數(shù)千種基因的轉(zhuǎn)錄層次，并提供了可有助于進(jìn)一步闡明許多未知功能基因的表達(dá)數(shù)據(jù)(White 等 1999 (Science 1999(286)2187-2184) ；Aharoni 等 2000 (Plant Cell2000 (12) 647-662) ο然而，這對(duì)于木本植物(例如樹(shù)木)來(lái)說(shuō)在技術(shù)上很復(fù)雜。Hertzberg等和Schrader等已研究了發(fā)育中的楊樹(shù)次生木質(zhì)部，它是高度組織化的并且在不同發(fā)育階段中具有易識(shí)別且獨(dú)特的邊界。木質(zhì)形成起始于維管形成層。形成層衍生物通過(guò)分裂、擴(kuò)大、次生壁形成、木質(zhì)化以及最終的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程發(fā)育成木質(zhì)部細(xì)胞。樹(shù)木中大尺寸的維管分生組織為通過(guò)切向冷凍切片獲取來(lái)自確定發(fā)育階段的樣品提供了特有的可能性(Uggla 等 1996Proc. Natl. Acad. Sc1. USA，1996 (93) ,9282-9286)。為了測(cè)定歐洲山楊 X美洲山楊(雜交山楊)中個(gè)體發(fā)育的木質(zhì)形成期間特定階段的穩(wěn)定狀態(tài)mRNA水平，收集貫穿木質(zhì)發(fā)育區(qū)的30 μ m厚切片并隨后利用數(shù)個(gè)由來(lái)自雜交山楊的多達(dá)20，000個(gè)獨(dú)特EST組成的已點(diǎn)樣cDNA微陣列進(jìn)行分析(Schena等1995Science 1995(270)467-470)。盡管從EST方法、基因組測(cè)序以及利用DNA陣列技術(shù)進(jìn)行的表達(dá)研究顯然可證實(shí)基因在何處和何時(shí)表達(dá)，但是僅通過(guò)這些類(lèi)型的分析工具不太可能闡明基因在生物學(xué)和/或技術(shù)上的功能。為了分析以及證實(shí)基因的功能，必須進(jìn)行功能表征，例如通過(guò)基因失活和/或基因過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，為了能鑒定具有令人感興趣且經(jīng)常難以預(yù)料之可商用特征的基因，需要有新的分析平臺(tái)來(lái)基于多重標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估候選基因。發(fā)明概述本發(fā)明涉及利用生物信息學(xué)工具、來(lái)自EST測(cè)序和DNA陣列的數(shù)據(jù)從鑒定得到的大批候選基因中選擇具有可商用表型之基因的一種新的應(yīng)用廣泛的分析平臺(tái)。該分析平臺(tái)致力于基于多重標(biāo)準(zhǔn)的組合對(duì)生長(zhǎng)行為進(jìn)行分析。本發(fā)明提供了通過(guò)改變滿(mǎn)足所述標(biāo)準(zhǔn)的一種或多種基因的表達(dá)來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。因此，本發(fā)明的一方面提供了產(chǎn)生與其野生型相比生長(zhǎng)有所提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括改變植物中在樹(shù)木形成不同階段特異性表達(dá)的至少一種基因的基因產(chǎn)物水平。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述至少一種基因的選擇滿(mǎn)足該基因的RNAi下調(diào)在一組3-8株轉(zhuǎn)基因植物中引起以下效果的標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)比較在18小時(shí)光周期、22°C/15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用I 100稀釋的Weibulls Rika S NPK 7_1_5的條件下于溫室中培育8周的所述一組轉(zhuǎn)基因植物與相同條件下培育的一組野生型植物時(shí)，a)在最終高度平均值(average final height, AFH)、最終高度最大值(maximumfinal height, MFH)、最大高度生長(zhǎng)速率平均值(averagemaximum height growth rate,AMHGR)和最大高度生長(zhǎng)速率最大值(maximum maximum height growth rate,MMHGR)中具有5%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(average final diameter,AFD)、最終直徑最大值(maximumfinal diameter, MFD)、直徑生長(zhǎng)速率平均值(averagediameter growth rate, ADGR)和直徑系數(shù)最大值(maximum diametercoefficient, MDC)中具有5%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)中具有18%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)和/或直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有18%或更大的差異；其中最大高度生長(zhǎng)速率定義為以4個(gè)連續(xù)的高度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合的線性函數(shù)的斜率，高度生長(zhǎng)速率值是以逐步的方式針對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)1-4、數(shù)據(jù)點(diǎn)2-5等計(jì)算得到的，而最大高度生長(zhǎng)速率值是針對(duì)每株植物計(jì)算得到的。利用該新分析平臺(tái)分析的許多基因顯示出令人感興趣且經(jīng)常難以預(yù)料的可商用特征。因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含重組多核苷酸(DNA構(gòu)建體)的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組多核苷酸含有能夠改變植物中在樹(shù)木形成階段特異性表達(dá)的至少一種基因之基因產(chǎn)物水平的核苷酸序列，其中所述至少一種基因的選擇滿(mǎn)足該基因的RNAi下調(diào)在一組3-8株轉(zhuǎn)基因植物中引起以下效果的標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)比較在18小時(shí)光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/l、K 56g/l的條件下于溫室中培育8周的所述轉(zhuǎn)基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時(shí)，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和最大高度生 長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)中具有5%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)和直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有5%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)中具有18%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)和/或直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有18%或更大的差異；其中最大高度生長(zhǎng)速率定義為以4個(gè)連續(xù)的高度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合的線性函數(shù)的斜率，高度生長(zhǎng)速率值是以逐步的方式針對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)1-4、數(shù)據(jù)點(diǎn)2-5等計(jì)算得到的，而最大高度生長(zhǎng)速率值是針對(duì)每株植物計(jì)算得到的。本發(fā)明的另一方面提供了根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物并且包含重組多核苷酸的植物細(xì)胞或植物后代。本發(fā)明的又一方面提供了由具有上述特性的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的木材。本發(fā)明的又一方面提供了包含至少一個(gè)如上所述序列的DNA構(gòu)建體。最后，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含本發(fā)明DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞或植物后代。


圖1顯示了樹(shù)木形成的不同階段，其中(A)是用甲苯胺藍(lán)染色的雜交山楊莖橫切片。黑條指示采樣組織的位置。為了給出來(lái)自形成層的其它組織中基因表達(dá)的低分辨率照片，因而包括了韌皮部樣品。(B)是維管發(fā)育期間不同細(xì)胞類(lèi)型和階段的示意圖。棒狀圖表示不同發(fā)育階段的時(shí)間和程度以及主要細(xì)胞壁成分的出現(xiàn)。(C)顯示了在采樣組織中對(duì)具有差異表達(dá)的1791種選定基因的分級(jí)聚類(lèi)分析。底部的顏色標(biāo)度表示樣品之間的倍數(shù)變化。(D)(1-X)顯示了具有不同的差異表達(dá)模式的基因群以Iog2為刻度的表達(dá)比。樣品示于圖底部。圖2顯示了來(lái)自木質(zhì)部差異數(shù)據(jù)的選定基因的表達(dá)模式。將選自Hertzberg等(2001)數(shù)據(jù)之基因的9種主要實(shí)例用于對(duì)雜交山楊進(jìn)行功能分析。該樣品和圖與圖1D中相同。該圖顯示了覆蓋木質(zhì)部差異區(qū)的那些基因的表達(dá)模式。表達(dá)比以log標(biāo)度表示。圖3顯示了來(lái)自分生組織實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的選定基因的表達(dá)模式。將選自Schrader等(2004)數(shù)據(jù)之基因的6種主要實(shí)例用于對(duì)雜交山楊進(jìn)行功能分析。該樣品和圖與圖1D中相同。該圖顯示了覆蓋形成層區(qū)域的那些基因的表達(dá)模式。表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自Schrader等2004的B輯。表達(dá)數(shù)值以log標(biāo)度表示,用于歸一化和數(shù)據(jù)準(zhǔn)備(參見(jiàn)Schrader等2004)。圖4顯示了用四個(gè)不同數(shù)據(jù)點(diǎn)的線性回歸線表示的高度生長(zhǎng)曲線實(shí)例，黑色回歸線顯示出最大的高度生長(zhǎng)速率。發(fā)明詳述定義在進(jìn)一步詳細(xì)論述本發(fā)明之前，首先對(duì)以下術(shù)語(yǔ)和慣例進(jìn)行定義術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物”是指含有在相同物種、品種和栽培變種的野生型植物中未發(fā)現(xiàn)的遺傳物質(zhì)的植物。所述遺傳物質(zhì)可包括轉(zhuǎn)基因、插入誘變事件(例如通過(guò)轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入誘變來(lái)實(shí)現(xiàn))、激活標(biāo)記序列(activation tagging sequence)、突變序列、同源重組事件或者經(jīng)嵌合修復(fù)(chimeraplasty)修飾的序列。通常，通過(guò)人為操作將外源遺傳物質(zhì)引入植物中。該術(shù)語(yǔ)還指其中已插入行使選擇標(biāo)記功能之遺傳物質(zhì)的植物。這樣的選擇標(biāo)記的實(shí)例包括卡那霉素、潮霉素、膦絲菌素(phosphoinotricin)、氯磺隆(chlorsulfron)、氨甲蝶呤、慶大霉素、壯觀霉素、咪唑啉酮類(lèi)(imidazolinones)、d_氨基酸和草甘膦(glyphosate)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)”包括植物的初生生長(zhǎng)(其包括莖和根的伸長(zhǎng))和次生生長(zhǎng)(其包括從形成層生成次生組織“木質(zhì)”以及莖和根周長(zhǎng)的增加。因此，表述““提高的生長(zhǎng)”在本文中涉及在同樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，相對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物所來(lái)源之野生型植物而言的轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)提高。如下文所述，如果植物滿(mǎn)足下文實(shí)施例中所定義之“生長(zhǎng)差異選擇標(biāo)準(zhǔn)”中的至少一條則認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)有所提高。術(shù)語(yǔ)“表型”在本文中是指植物個(gè)體的總體自然表現(xiàn)，例如生長(zhǎng)。本文中所用的不同生長(zhǎng)表型的實(shí)例列于以下表1. 2中，包括例如稱(chēng)為“ΑΠΓ (其指野生型種群及每種構(gòu)建組種群的最終高度平均值)或“AFD”(其指野生型種群及每種構(gòu)建組種群的最終直徑平均值)的表型。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“木質(zhì)形成階段”是指木質(zhì)形成的時(shí)期，例如細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)大，如以下文獻(xiàn)所定義Wilson, B. F.，ffodzicki, T. J.以及Zhaner，R. (1966)Differentiation Of cambial derivates Proposedterminology. Forest Science 12，438-440 頁(yè)。
當(dāng)論及在木質(zhì)形成的不同階段特異性表達(dá)的基因時(shí)，術(shù)語(yǔ)“特異性表達(dá)”用于表示在木質(zhì)形成階段表達(dá)提高的基因。應(yīng)當(dāng)理解，在木質(zhì)形成階段所述基因的表達(dá)可提高10%或更多，例如15%或更多、20%或更多、25%或更多、30%或更多、40%或更多、50%或更多、75%或更多、100%或更多、200%或更多、300%或更多、400%或更多、500%或更多、700%或更多或者1000%或更多。術(shù)語(yǔ)“基因”廣義上指與生物學(xué)功能相關(guān)的任何DNA片段。基因包括編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)控序列。基因還包括非表達(dá)的DNA核酸區(qū)段，例如，形成針對(duì)其它蛋白質(zhì)的識(shí)別序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它調(diào)控區(qū))。基因可從多種來(lái)源獲得，包括從目的來(lái)源克隆或者根據(jù)已知或預(yù)測(cè)的序列信息合成，還可包括設(shè)計(jì)成具有所需參數(shù)的序列。術(shù)語(yǔ)“RNA干擾”或“RNAi ” 一般是指雙鏈RNA分子或短發(fā)夾RNA改變與其共有顯著或完全同源性之核酸序列的表達(dá)的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“RNAi下調(diào)”是指由一種或多種RNAi介導(dǎo)的核酸序列表達(dá)減少。術(shù)語(yǔ)“RNAi種類(lèi)”是指引起RNAi的獨(dú)特RNA序列。術(shù)語(yǔ)“光周期”是指光照與黑暗的每日循環(huán)。術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”、“DNA構(gòu)建體”和“載體”是指用于轉(zhuǎn)化植物或其它生物的遺傳序列。核酸構(gòu)建體或DNA構(gòu)建體可以能夠在轉(zhuǎn)化植物中指導(dǎo)蛋白質(zhì)或核酸序列(例如反義RNA)的表達(dá)。通常，這樣的核酸構(gòu)建體或DNA構(gòu)建體至少包含針對(duì)所需基因產(chǎn)物或所需核酸產(chǎn)物并與5’和3’轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接的編碼區(qū)。在一些實(shí)施方案中，這樣的核酸構(gòu)建體或DNA構(gòu)建體是嵌合的，即由不同來(lái)源的序列混合組成。然而，非嵌合的核酸構(gòu)建體或DNA構(gòu)建體也可用于本發(fā)明中。在涉及例如細(xì)胞、核苷酸、載體、蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組”通常表示已通過(guò)引入異源(或外源)核酸或通過(guò)改變天然核酸而對(duì)細(xì)胞、核苷酸或載體進(jìn)行了修飾，或者通過(guò)引入異源氨基酸而對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行修飾，或者所述細(xì)胞來(lái)源于經(jīng)如此修飾的細(xì)胞。重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的核酸序列(例如基因)，或者表達(dá)在正常情況下會(huì)異常表達(dá)、低表達(dá)或者根本不表達(dá)的天然核酸序列(例如基因)。涉及細(xì)胞時(shí)術(shù)語(yǔ)“重組”表示所述細(xì)胞復(fù)制異源核酸，或表達(dá)由異源核酸編碼的肽或蛋白質(zhì)。重組細(xì)胞可包含在天然(非重組)形式細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的基因。重組細(xì)胞還可包含天然形式細(xì)胞中存在的基因，其中所述基因被修飾并通過(guò)人工手段被重新引入細(xì)胞中。該術(shù)語(yǔ)還包括含有細(xì)胞內(nèi)源核酸的細(xì)胞，所述內(nèi)源核酸被修飾而未從細(xì)胞中取出，所述修飾包括通過(guò)基因置換、定點(diǎn)突變和相關(guān)技術(shù)獲得的修飾。術(shù)語(yǔ)“核酸序列”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合體。除非特別限制，否則該術(shù)語(yǔ)涵蓋包含天然核苷酸已知類(lèi)似物的核酸序列，其具有與參照核酸類(lèi)似的結(jié)合特性并且以與天然核苷酸類(lèi)似的方式進(jìn)行代謝。除非另外指明，否則一種具體的核酸序列還暗含其保守性修飾的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子替換)和互補(bǔ)序列以及明確指示的序列。“多核苷酸”是包含眾多聚合核苷酸殘基的核酸序列，例如至少約15個(gè)連續(xù)的聚合核苷酸殘基，任選地至少約30個(gè)連續(xù)的核苷酸，至少約50個(gè)連續(xù)的核苷酸。在許多情況下，多核苷酸包含編碼多肽(或蛋白質(zhì))或其結(jié)構(gòu)域或片段的核苷酸序列。另外，多核苷酸可包含啟動(dòng)子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子區(qū)、多腺苷酸化位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)、5’或3’非翻譯區(qū)、報(bào)告基因、選擇標(biāo)記等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。多核苷酸任選地包含經(jīng)修飾的堿基或經(jīng)修飾的主鏈。多核苷酸可以是例如基因組DNA或RNA、轉(zhuǎn)錄物(例如mRNA)、cDNA、PCR產(chǎn)物、克隆DNA、合成DNA或RNA等。多核苷酸可包含有義或反義方向的序列。術(shù)語(yǔ)“多肽”以廣義使用，用于定義氨基酸殘基的線性鏈，包括天然存在的及其合成類(lèi)似物。在本發(fā)明的上下文中，“互補(bǔ)”是指在兩個(gè)核苷酸序列之間彼此精確配對(duì)的能力。例如，如果在寡核苷酸中某一位置的核苷酸能夠與某DNA或RNA分子相應(yīng)位置的核苷酸以氫鍵結(jié)合，那么該寡核苷酸與該DNA或RNA就被認(rèn)為在所述位置彼此互補(bǔ)。當(dāng)寡核苷酸中有足夠數(shù)目的核苷酸可與目標(biāo)DNA或RNA中相應(yīng)核苷酸形成氫鍵從而能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物時(shí)，所述DNA或RNA鏈被認(rèn)為是彼此互補(bǔ)的。因此，在本文上下文中表述“互補(bǔ)序列”或“互補(bǔ)”也指在嚴(yán)格條件下可與本發(fā)明核酸分子退火的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指具有高、弱或低嚴(yán)格性的一般條件。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格性”是本領(lǐng)域眾所周知的在涉及實(shí)施核酸雜交時(shí)使用的條件(溫度、離子強(qiáng)度以及其它化合物例如有機(jī)溶劑的存在)。與“弱嚴(yán)格性”或“低嚴(yán)格性”相比，在“高嚴(yán)格性”條件下，核酸堿基配對(duì)只會(huì)發(fā)生在具有高頻率互補(bǔ)堿基序列的核酸片段之間。用于測(cè)試雜交的合適條件包括預(yù)浸泡于5XSSC中，然后在約40°C下、在含20%甲酰胺、5 X Denhardt ’ s溶液、50mM磷酸鈉(pH6. 8)和50mg經(jīng)超聲變性處理的小牛胸腺DNA的溶液中預(yù)雜交I小時(shí)，隨后在約40°C下、在補(bǔ)充了 IOOmMATP的同樣溶液中雜交18小時(shí)，之后在40°C下(低嚴(yán)格性)將濾器用2XSSC、0.2% SDS漂洗30分鐘，共3次，優(yōu)選在50°C下(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選在65°C下(高嚴(yán)格性)，更優(yōu)選在約75°C下(極高嚴(yán)格性)。有關(guān)雜交方法的更多細(xì)節(jié)可參見(jiàn) Sambrook 等，Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor,19890術(shù)語(yǔ)“雜交”和“使雜交”以廣義使用，用于指互補(bǔ)或部分互補(bǔ)核酸序列之間的結(jié)合，例如使其分離之變性過(guò)程的逆向過(guò)程。雜交通過(guò)氫鍵結(jié)合而發(fā)生，其可以是在互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基之間的Watson_Crick、Hoogsteen、反Hoogsteen氫鍵結(jié)合等。在DNA中常見(jiàn)的四種核酸堿基是G、A、T和C，其中G與C配對(duì)，A與T配對(duì)。在RNA中，T被尿嘧啶(U)代替，而與A配對(duì)。參與標(biāo)準(zhǔn)雙鏈形成的核酸堿基中的化學(xué)基團(tuán)構(gòu)成Watson-Crick面。幾年后，Hoogsteen顯示嘌呤核酸堿基(G和A)除了其Watson-Crick面之外還具有Hoogsteen面，該Hoogsteen面可從雙鏈外側(cè)識(shí)別并用于通過(guò)氫鍵鍵合來(lái)結(jié)合嘧啶寡核苷酸，從而形成三螺旋結(jié)構(gòu)。“子序列”或“片段”是完整序列的任一部分。因此，片段或子序列是指分別包含較長(zhǎng)氨基酸(例如多肽)或核酸(例如多核苷酸)一部分的氨基酸或核酸序列。在本文中，兩個(gè)氨基酸序列間或兩個(gè)核苷酸序列間的同源性通過(guò)參數(shù)“序列同一性”來(lái)描述。術(shù)語(yǔ)“序列同一性”表示相等長(zhǎng)度的兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核酸序列之間同源程度的定量測(cè)量。如果待比較的兩個(gè)序列不是等長(zhǎng)的，則必須對(duì)其進(jìn)行比對(duì)以得出最佳的可能匹配，其中允許插入空位或者截短多肽序列或核苷酸序列的末端。序列同一性可根據(jù)文獻(xiàn) Fei ! Objekt kan inteskapas genom redigering aV f’iiltkodei*進(jìn)行計(jì)算，其中Ndif是在比對(duì)時(shí)兩個(gè)序列中不一致殘基的總數(shù)，并且其中Nm是序列之一中的殘基數(shù)目。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC具有75%的同一性(Ndif = 2，Nref = 8)。空位作為不一致的具體殘基來(lái)計(jì)算，即，DNA序列AGTGTC與DNA序列AGTCAGTC具有75%的同一性
(Ndif = 2，Nref = 8)。在本發(fā)明涉及核苷酸序列的所有實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)序列之間的序列同一性百分比還可基于利用默認(rèn)設(shè)置的clustalW軟件(http:/www. eb1. ac. uk/clustalff/index,html)進(jìn)行的序列比對(duì)。對(duì)于核苷酸序列對(duì)比而言，這些設(shè)置為比對(duì)(Alignment)=3Dfull、空位(Gap Open) 10. 00、空位延伸(Gap Ext.) O. 20、空位間隔距離(Gap separationDist.)4、DNA 權(quán)重矩陣(DNA weight matrix):同一性(IUB)。或者，可使用 DNASISMax程序?qū)π蛄羞M(jìn)行分析，并可通過(guò)http://www. paraliRn. ors/網(wǎng)站進(jìn)行序列比較。該服務(wù)基于稱(chēng)為Smith-Waterman(SW)和ParAlign的兩種比較算法。第一種算法由Smith和Waterman(1981)發(fā)表,它是一種發(fā)現(xiàn)兩個(gè)序列的最佳局部比對(duì)的成熟方法。另一種算法ParAlign是用于序列比對(duì)的啟發(fā)式方法；該方法的詳細(xì)描述發(fā)表于RogneS(2001)中。使用了得分矩陣和空 位罰分以及E值的默認(rèn)設(shè)置。在涉及兩個(gè)核酸或多肽的上下文中，短語(yǔ)“基本上一致”或“大致相同”是指當(dāng)進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)的比較和比對(duì)時(shí)，使用以下序列比較算法之一或通過(guò)直觀觀察來(lái)測(cè)量，兩個(gè)或多個(gè)序列或子序列分別具有至少約60 %、70 %、75 %，優(yōu)選80 %或85 %，更優(yōu)選90 %、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更大的核苷酸或氨基酸殘基百分比同一性。在一些方面，“基本上一致”存在于長(zhǎng)度至少為50個(gè)殘基的氨基酸序列區(qū)域，例如，至少約 100、110、120、125、130、135、140、145、150、155、160 或 165 個(gè)氨基酸殘基。在一些方面，“基本上一致”存在于長(zhǎng)度至少約150個(gè)核酸殘基的核酸序列區(qū)域，例如至少約200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800 個(gè)核酸殘基，例如至少約900 個(gè)核昔酸，或例如至少約 lkb、1. lkb、1. 2kb、1. 3kb、1. 4kb、1. 5kb、1. 6kb、1. 7kb、1. 8kb、1.9kb、2kb、2. lkb,2. 2kb、2. 3kb、2. 4kb、2. 5kb、2. 6kb、2. 7kb、2. 8kb、2. 9kb,或者例如至少約3kb。在一些方面，氨基酸或核酸序列在全長(zhǎng)多肽序列或相應(yīng)編碼區(qū)的范圍內(nèi)是基本上一致的。術(shù)語(yǔ)“保守替換”是在堿性氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)的組內(nèi)進(jìn)行的。氨基酸替換通常不改變特定活性是本領(lǐng)域已知的并描述于例如，H. Neurath 和 R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, AcademicPress, New York。最常發(fā)生的更替是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/IIe、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly以及這些的反轉(zhuǎn)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“保守替換變體”是指包含一個(gè)或多個(gè)保守替換的核苷酸序列變體。一般地以及在本文的上下文中，術(shù)語(yǔ)“沉默替換”是指不影響密碼子含義因而對(duì)多肽結(jié)構(gòu)無(wú)影響的堿基替換。如技術(shù)人員所知，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性使沉默替換成為可能。術(shù)語(yǔ)“保守結(jié)構(gòu)域”是指多肽在多個(gè)物種之間相似的氨基酸序列或DNA或RNA中這樣的核苷酸序列。已知的保守序列集合通過(guò)共有序列來(lái)表示。氨基酸基序常由保守序列組成。此外，術(shù)語(yǔ)“保守序列”還指核酸序列分子中在整個(gè)進(jìn)化中保持基本上未改變的堿基序列或蛋白質(zhì)中的氨基酸序列。“共有序列”定義為代表最經(jīng)常出現(xiàn)于核酸序列中各位置的堿基或最經(jīng)常出現(xiàn)于蛋白質(zhì)中各位置的氨基酸的理想序列。“共有序列”通過(guò)比對(duì)所有已知的核酸序列或蛋白質(zhì)實(shí)例使其序列同一性最大化來(lái)鑒定。對(duì)于待承認(rèn)為共有序列的序列而言，各具體堿基或氨基酸必須在其位置相當(dāng)占優(yōu)勢(shì)，并且絕大多數(shù)序列中須與共有序列一致而只有少量發(fā)生替換，例如I個(gè)或2個(gè)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游的序列決定區(qū)，并且其參與RNA聚合酶及其它蛋白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合從而起始和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。植物中可用的啟動(dòng)子不一定是植物來(lái)源的。“基本啟動(dòng)子(basalpromoter) ”是組裝轉(zhuǎn)錄起始所需之轉(zhuǎn)錄復(fù)合物所需的最小序列。基本啟動(dòng)子常包含通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游15 35個(gè)核苷酸之間的“TATA盒”元件。基本啟動(dòng)子有時(shí)還包含“CCAAT盒”元件(通常為CCAAT序列)和/或GGGCG序列，其通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的40 200個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選60 120個(gè)核苷酸之間。本文中稱(chēng)作“組成型啟動(dòng)子”的啟動(dòng)子在大多數(shù)(但不一定是所有的)環(huán)境條件以及發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下活躍地啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)以及來(lái)源于根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) TDNA的I’或2’啟動(dòng)子，以及技術(shù)人員已知的來(lái)自多種植物基因的其它轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，例如玉米泛素(ubiquitin)-l啟動(dòng)子。器官特異性啟動(dòng)子可以是，例如，來(lái)自忙藏組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴 薯塊莖和果實(shí)的啟動(dòng)子,或者來(lái)自代謝組織(metabolic sinktissue)例如分生組織的啟動(dòng)子,種子特異性啟動(dòng)子例如來(lái)自水稻的谷蛋白(gluteI in)、谷醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白或白蛋白啟動(dòng)子,來(lái)自蠶豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4以及來(lái)自蠶豆的未知種子蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子，來(lái)自種子油體蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子，來(lái)自歐洲油菜(Brassica napus)的忙藏蛋白質(zhì)napA啟動(dòng)子,或者本領(lǐng)域已知的任何其它種子特異性啟動(dòng)子，例如，如WO 91/14772中所述。此外，啟動(dòng)子可以是葉子特異性啟動(dòng)子，例如來(lái)自水稻和番茄的rbcs啟動(dòng)子、小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子、或來(lái)自水稻的aldP基因啟動(dòng)子，或者創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子。在本發(fā)明的上下文中，“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”是指受某些條件調(diào)控的啟動(dòng)子，例如光、化學(xué)物質(zhì)濃度、蛋白質(zhì)濃度；生物、細(xì)胞或細(xì)胞器的狀態(tài)等。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例是HSP啟動(dòng)子和PARSK1，后者是來(lái)自編碼絲氨酸-蘇氨酸激酶的擬南芥基因的啟動(dòng)子并且被脫水、脫落酸和氯化鈉所誘導(dǎo)。實(shí)質(zhì)上，受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的表達(dá)響應(yīng)于所應(yīng)用的刺激而“開(kāi)啟”或提高。所述刺激的性質(zhì)依啟動(dòng)子而變化并可包括上述環(huán)境因素。無(wú)論在不存在刺激時(shí)表達(dá)水平如何，在正確的刺激存在時(shí)由任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子起始的表達(dá)都是提高的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“組織特異性的”是指在特定組織中的特性，其一般并非在所有組織中出現(xiàn)，或者可僅在目的組織中出現(xiàn)。在本申請(qǐng)中，“組織特異性的”在涉及基因調(diào)控元件(啟動(dòng)子或啟動(dòng)子加增強(qiáng)子和/或沉默子)、其編碼的基因或者所述基因的多肽產(chǎn)物時(shí)使用。在涉及基因調(diào)控元件或“組織特異性啟動(dòng)子”時(shí)，該術(shù)語(yǔ)意指所述啟動(dòng)子(以及其它調(diào)控元件例如增強(qiáng)子和/或沉默子元件)在特定譜系、組織或細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞中指導(dǎo)所連接序列轉(zhuǎn)錄，而在非所述譜系、組織或細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞或組織中則基本上失活。就轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生而言，本發(fā)明可用的組織特異性啟動(dòng)子在特定組織中比在其它組織的細(xì)胞中或在同一譜系的轉(zhuǎn)化或惡性細(xì)胞中要高出至少5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或甚至1000倍。在涉及基因或基因多肽產(chǎn)物時(shí)，術(shù)語(yǔ)“組織特異性的”意指所述基因的多肽產(chǎn)物在該特定組織或細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞中可檢測(cè)到，但在某些其它細(xì)胞類(lèi)型中則基本上檢測(cè)不到。特別相關(guān)的組織特異性啟動(dòng)子包括在植物的木質(zhì)部形成組織中特異表達(dá)或活躍的啟動(dòng)子序列。這樣的啟動(dòng)子的實(shí)例有Lmpl、Lmx2、Lmx3、Lmx4和Lmx5啟動(dòng)子，參見(jiàn)WO 2004097024。“終止子序列”是指在用于轉(zhuǎn)錄的基因組DNA上標(biāo)志著基因或操縱子末端的遺傳序列部分。終止子序列被蛋白因子識(shí)別，所述蛋白因子在多腺苷化信號(hào)處共轉(zhuǎn)錄切割新生RNA,使RNA聚合酶停止進(jìn)一步延伸轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)某一核酸與另一核酸序列的位置具有功能聯(lián)系時(shí)，所述核酸即為“有效連接的”。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子增強(qiáng)了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與該編碼序列有效連接。“有效連接”意指被連接的DNA序列通常是連續(xù)的(需要時(shí)連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū))且在同一讀碼框內(nèi)。然而，由于增強(qiáng)子通常在與啟動(dòng)子相隔數(shù)千堿基的情況下發(fā)揮作用并且內(nèi)含子序列的長(zhǎng)度可能不定，所以某些多核苷酸元件可以采用非連續(xù)的有·效連接。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”與“轉(zhuǎn)染”是同義詞，其是指將DNA引入細(xì)胞的過(guò)程。DNA構(gòu)建體(包含·目的基因或啟動(dòng)子的至少一部分)可被引入宿主細(xì)胞內(nèi)，如前所述，可以是單獨(dú)的細(xì)胞、培養(yǎng)中的細(xì)胞、作為宿主生物一部分的細(xì)胞、已受精的卵母細(xì)胞或配子體或胚胎細(xì)胞。當(dāng)涉及宿主細(xì)胞時(shí)術(shù)語(yǔ)“引入”意指本領(lǐng)域已知的用于將重組載體DNA引入靶宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)步驟。這樣的步驟包括但不限于轉(zhuǎn)染、感染、轉(zhuǎn)化、自然攝取、電穿孔、生物射彈(biolistics)和農(nóng)桿菌(Agrobacterium)。“可再生細(xì)胞(regenerable cell) ”意指從其可再生出完整植物的植物細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，所述再生細(xì)胞是保持其遺傳潛能(在本領(lǐng)域內(nèi)也稱(chēng)為“全能性”)的細(xì)胞。還應(yīng)理解，在培養(yǎng)時(shí)所述再生細(xì)胞可能需要適當(dāng)?shù)拇碳?lái)表達(dá)親本植物的全部遺傳潛能。轉(zhuǎn)基因棺物的產(chǎn)牛方法用于選擇基因的功能分析可使用現(xiàn)有技術(shù)的步驟來(lái)鑒定用于改變和/或修飾生長(zhǎng)相關(guān)植物表型的候選基因，例如，如Hertzberg等(2001)和Schrader等(2004)中所述。參與生長(zhǎng)調(diào)控的候選基因還可例如在具有使用現(xiàn)有技術(shù)知識(shí)鑒定之特殊特性的轉(zhuǎn)錄因子中進(jìn)行鑒定。為了使針對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)特性/功能的功能基因組計(jì)劃的陽(yáng)性結(jié)果最多，所述候選基因鑒定在本領(lǐng)域中被認(rèn)為是重要的。因此，本發(fā)明的第一方面提供了產(chǎn)生較其野生型而言生長(zhǎng)有所提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括改變植物中在木質(zhì)形成階段特異性表達(dá)的至少一種基因的基因產(chǎn)物水平。基于靶向所述候選基因，本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括靶向已通過(guò)新方法進(jìn)一步選定供功能分析的基因。根據(jù)該方面的一個(gè)實(shí)施方案，所述至少一種基因的選擇滿(mǎn)足該基因的RNAi下調(diào)在一組3-8株轉(zhuǎn)基因植物中引起以下效果的標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)比較在18小時(shí)光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/l、K 56g/l的條件下于溫室中培育8周的所述轉(zhuǎn)基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時(shí)，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)中具有5%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)
和直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有5%或更大的差異；和/或 c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)中具有18%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)和/或直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有18%或更大的差異；并且其中最大高度生長(zhǎng)速率定義為以4個(gè)連續(xù)的高度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合的線性函數(shù)的斜率，高度生長(zhǎng)速率值是以逐步的方式針對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)1-4、數(shù)據(jù)點(diǎn)2-5等計(jì)算得到的，而最大高度生長(zhǎng)速率值是最后針對(duì)每株植物從生長(zhǎng)速率值中選擇的。含有N 84g/l、P 12g/l和K 56g/l的肥料是目前可獲得的，商品名為WeibullsRika S NPK7-1-5。該肥料的成分如下(均為 g/Ι) 總 N = 84，NO3 = 55，NH4 = 29,P = 12，K = 56，Mg = 7. 2，S = 7. 2，B =0.18，Cu = O. 02，F(xiàn)e = 0. 84，Mn = 0.42，Mo = 0. 03，Zn=0.13。在另一實(shí)施方案中采用了更嚴(yán)格的一組標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)該實(shí)施方案，所述至少一種基因的選擇滿(mǎn)足該基因的RNAi下調(diào)在一組3-8株轉(zhuǎn)基因植物中引起以下效果的標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)比較在18小時(shí)光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/、K 56g/l的條件下于溫室中培育8周的所述轉(zhuǎn)基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時(shí)，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)中具有8%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)和直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有8%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)中具有22%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)和/或直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有22%或更大的差異；其中最大高度生長(zhǎng)速率定義為以4個(gè)連續(xù)的高度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合的線性函數(shù)的斜率，高度生長(zhǎng)速率值是以逐步的方式針對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)1-4、數(shù)據(jù)點(diǎn)2-5等計(jì)算得到的，而最大高度生長(zhǎng)速率值是最后針對(duì)每株植物從生長(zhǎng)速率值中選擇的。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它提供了用于評(píng)估參與決定生長(zhǎng)特性之候選基因的極其靈敏的分析平臺(tái)。先前的基因評(píng)估方法基于依照單一標(biāo)準(zhǔn)(例如植物高度或直徑)進(jìn)行表型評(píng)估，而本發(fā)明的方法允許基于多重標(biāo)準(zhǔn)對(duì)表型進(jìn)行表征，包括最終高度平均值、最終高度最大值、最大高度生長(zhǎng)速率平均值和最大高度生長(zhǎng)速率的最大值。使用該分析平臺(tái)允許鑒定和選擇在產(chǎn)生生長(zhǎng)提高之植物的方法中所用的新的靶基因。如果使用較簡(jiǎn)單的方法，這些靶標(biāo)基因?qū)⒉粫?huì)被認(rèn)為參與生長(zhǎng)特性的決定或者它們只被認(rèn)為在產(chǎn)生生長(zhǎng)表型中起不重要的作用。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)野生型植物而言，通過(guò)改變根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估和選擇之候選基因的表達(dá)水平來(lái)產(chǎn)生具有有利的植物表型。根據(jù)這些方面提供的方法包括改變植物中至少一種基因的基因產(chǎn)物水平，所述基因包含選自以下的核苷酸序列a)選自 SEQ ID NO :1-17、50、51、54_58、60 的核苷酸序列；例如 SEQID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60 ；b)與選自 SEQ ID NO :1-17、50、51、54_58、60 的核苷酸序列(例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)具有至少 60% 同一性的核苷酸序列；c)a)或b)的核苷酸序列的子序列或片段。由序列ID 號(hào) 1-17、50、51、54-58、60 指示的序列(例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)代表克隆自雜交山楊的候選基因的部分序列。正如技術(shù)人員所應(yīng)理解地，使用常規(guī)克隆技術(shù)(例如Sambrook等所述的技術(shù))可容易地獲得在 SEQID NO :1-17、50、51、54-58、60(例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)中所述的序列5，和3，端的另外的序列。核酸構(gòu)建體 根據(jù)本發(fā)明的一些更具體的實(shí)施方案，所述方法包括提供核酸構(gòu)建體(例如重組DNA構(gòu)建體)的步驟，所述核酸構(gòu)建體包含選自以下的核苷酸序列d)包含選自 SEQ ID NO : 1_17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、
15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)之序列的核苷酸序列；e)d)之核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列；f) d)或e)之核苷酸序列的子序列或片段；g)與d)、e)和f)中的任一序列至少60% —致的核酸序列；以及h)在嚴(yán)格條件下與d)、e)或f)之核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，c)或g)中的核酸序列與a)、c)、d)、e)或f)中的任一序列至少65%—致,例如與a)、c)、d)、e)或f)中的任一序列至少70%—致,至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%—致，至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。在本發(fā)明該方面的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，a)的核苷酸序列選自SEQ IDN0:1、5、6、9、11、12、15、17、56、57 和 58。本領(lǐng)域中存在多種用于產(chǎn)生本發(fā)明的核酸序列和核酸/DNA構(gòu)建體的方法。用于鑒定和分離DNA克隆的步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，參見(jiàn)例如Sambrook等，MolecularCloning-A Laboratory Manual (第二版)，1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, New York, 1989。或者,本發(fā)明的核酸序列可利用適合本發(fā)明的多種體外擴(kuò)增方法通過(guò)適當(dāng)選擇特異性或簡(jiǎn)并性引物來(lái)產(chǎn)生。足以指導(dǎo)技術(shù)人員實(shí)施體外擴(kuò)增方法的方案實(shí)例包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、Qi3-復(fù)制酶擴(kuò)增及其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如NASBA)，例如用于產(chǎn)生本發(fā)明的同源核酸，參見(jiàn)Sambrook (同上)。或者，可從固相合成方法所產(chǎn)生的片段組裝成本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。通常，單獨(dú)合成多達(dá)約100個(gè)堿基的片段，然后利用酶促法或化學(xué)法連接以產(chǎn)生所需序列，例如編碼轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)或部分的多核苷酸。例如，利用亞磷酰胺法進(jìn)行化學(xué)合成是技術(shù)人員眾所周知的。根據(jù)所述方法，寡核苷酸被合成、純化、與其互補(bǔ)鏈退火、連接、然后任選地克隆進(jìn)合適的載體中。如所提及地，上述序列來(lái)自雜交山楊。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可從其它物種分離出所述序列的同源物，其非限制性的實(shí)例包括金合歡樹(shù)(acacia)、桉樹(shù)、角樹(shù)(hornbeam)、山毛櫸樹(shù)(beech)、桃花心木(mahogany)、胡桃、橡樹(shù)、白臘樹(shù)(ash)、山胡桃樹(shù)(hickory)、樺樹(shù)、栗樹(shù)、赤楊(alder)、楓樹(shù)、懸鈴木(sycamore)、銀杏樹(shù)、棕櫚樹(shù)、香楓(sweet gum)、柏樹(shù)、花旗松(Douglas fir)、冷杉、紅杉(sequoia)、鐵杉、雪松、杜松(juniper)、落葉松(larch)、松樹(shù)、巨杉(redwood)、云杉、紫杉(yew)、蘋(píng)果樹(shù)、李子樹(shù)、梨樹(shù)、香蕉樹(shù)、桔樹(shù)、稱(chēng)猴桃樹(shù)、朽1檬樹(shù)、樓桃樹(shù)、葡萄樹(shù)、無(wú)花果樹(shù)、棉花、竹子、柳枝稷(switch grass)、草蘆(red canarygrass)和橡膠植物。所述序列的可用同源物還可從來(lái)自楊柳科(Salicaceae)的硬木植物中分離，例如來(lái)自柳屬和楊屬。所述屬中的成員的已知常用名為柳樹(shù)、楊樹(shù)和山楊。具體地，本發(fā)明的核苷酸序列包含選自SEQ ID NO : 18_38、48、49、51_60 (例如SEQID NO :20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。顯而易見(jiàn)地，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少15個(gè)核苷酸，例如至少16個(gè)核苷酸，至少17個(gè)核苷酸，至少18個(gè)核苷酸，至少19個(gè)核苷酸，至少20個(gè)核苷酸，至少21個(gè)核苷酸，至少22個(gè)核苷酸，至少23個(gè)核苷酸，至少24個(gè)核苷酸，至少25個(gè)核苷酸，例如至少30個(gè)核苷酸，至少35個(gè)核苷酸，至少40個(gè)核苷酸，至少45個(gè)核苷酸，至少50個(gè)核苷酸，至少55個(gè)核苷酸，至 少60個(gè)核苷酸，至少65個(gè)核苷酸，至少70個(gè)核苷酸，至少75個(gè)核苷酸，至少80個(gè)核苷酸，至少85個(gè)核苷酸，至少90個(gè)核苷酸，至少95個(gè)核苷酸，或者例如至少100個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少約150個(gè)核酸殘基，例如至少約 200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800個(gè)核苷酸，例如至少約900個(gè)核苷酸，或者例如至少約lkb、1. lkb、1. 2kb、1. 3kb、1. 4kb、
1.5kb、l. 6kb、l. 7kb、l. 8kb、l. 9kb、2kb、2. lkb,2. 2kb、2. 3kb,2. 4kb、2. 5kb、2. 6kb,2. 7kb、
2.8kb、2. 9kb或例如至少約3kb。特別地，本發(fā)明的方法可包括提供含有核苷酸序列的核酸構(gòu)建體(例如重組DNA構(gòu)建體)的步驟，所述核苷酸序列與所述特定序列相比包含改變所編碼多肽中一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的保守性變化。因此，本發(fā)明的范圍中提供和使用重組DNA構(gòu)建體，其包含編碼含有a)中多肽之保守替換變體的多肽的核苷酸序列。不改變多核苷酸所編碼之氨基酸序列的序列改變被稱(chēng)為“沉默替換”。除了分別編碼甲硫氨酸和色氨酸的密碼子ATG和TGG之外，針對(duì)同一氨基酸的任何可能密碼子均可通過(guò)本領(lǐng)域中可獲得的多種技術(shù)(例如定點(diǎn)誘變)進(jìn)行替換。因此，本發(fā)明還可提供重組核酸構(gòu)建體，其中核苷酸序列包含在核苷酸序列中的沉默替換。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，所述子序列或片段與上述a)或d)中核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域具有至少65%的序列同一性，例如與上述a)或d)中核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域至少70%—致，至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%一致,至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物水平改變的方法本發(fā)明通過(guò)降低或在某些情況下消除某些基因的表達(dá)來(lái)實(shí)施，本文中提供了如何實(shí)現(xiàn)的非限制性實(shí)例。上述核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體可用于鑒定較野生型而言生長(zhǎng)特性發(fā)生改變的植物。這樣的植物可以是例如天然存在的變體或經(jīng)遺傳修飾表現(xiàn)出改變的生長(zhǎng)特性的植物。為此目的，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體可用作例如常規(guī)雜交測(cè)定中的探針或用作特異性擴(kuò)增核酸片段的引物。盡管本發(fā)明的主要部分是基因產(chǎn)物的下調(diào)如何得到所需效果，它還顯示改變本文所示基因的表達(dá)可用于改良所需特性，這是看待所述數(shù)據(jù)的另一種思路，即增加植物內(nèi)的所述基因產(chǎn)物也是改良所需性狀的一種方式。存在不同的方法來(lái)提高基因產(chǎn)物的水平，這些與下調(diào)下述基因產(chǎn)物的方法平行描述于下文中。這些基因還可用作標(biāo)記輔助育種(marker assisted breeding)的祀標(biāo)，這是因?yàn)榛蛘{(diào)控序列中的變化可引起表達(dá)模式的改變，而編碼序列中的變化可引起基因功能的改變，并且我們已知對(duì)這些基因進(jìn)行操作可引起所述性狀的改變。此外，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體可用于基因置換的目的來(lái)修飾相應(yīng)的植物生長(zhǎng)表型。可例如使用核酶來(lái)實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因表達(dá)的抑制。核酶是具有高度特異性?xún)?nèi)切核糖核酸酶活性的RNA分子。核酶的制備和使用公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利No. 4，987，071和美國(guó)專(zhuān)利No. 5，543，508中。反義技術(shù)在下文中論述，應(yīng)注意的是，包含反義RNA的合成核酶序列可用于賦予反義RNA以RNA切割活性，從而使與該反義RNA雜交的內(nèi)源mRNA分子被切割，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的反義抑制增強(qiáng)。還可使用其中由相關(guān)基因同源物編碼的RNA過(guò)表達(dá)的載體來(lái)實(shí)現(xiàn)相應(yīng)內(nèi)源基因的共抑制，例如，采用Jorgensen的美國(guó)專(zhuān)利No. 5，231，020中所述的方法。這樣的共抑制(也稱(chēng)為有義抑制)不需要將完整的序列引入植物細(xì)胞中，也不需要所引入序列與內(nèi)源目的序列完全一致。然而，當(dāng)雜交的特異性增加時(shí)(例如，當(dāng)加長(zhǎng)所引入序列時(shí)，和/或當(dāng)所引入序列與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子基因之間的序列相似性增加時(shí))抑制效率將會(huì)提高。表達(dá)不可翻譯形式之基因(例如含有一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或無(wú)義突變的序列)的載體也可用于抑制內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而降低或消除其活性并改良一種或多種性狀。用于產(chǎn)生所述構(gòu)建體的方法參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 5，583，021。特別地，這樣的構(gòu)建體可通過(guò)在基因中引入提前終止(premature)的終止密碼子來(lái)制備。進(jìn)行靶DNA插入的一種方法是通過(guò)利用如W02006/078431中所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA整合機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)是基于可以通過(guò)將整合酶與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)(束縛蛋白)有效偶聯(lián)來(lái)改變逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)座子整合酶整合位點(diǎn)特異性。對(duì)整合酶的改造優(yōu)選在核酸水平上進(jìn)行，通過(guò)利用PCR來(lái)修飾野生型整合酶的編碼序列。這樣，可將整合酶復(fù)合物引導(dǎo)至期望部分或引導(dǎo)其遠(yuǎn)離基因組DNA的不期望部分，從而產(chǎn)生期望的整合位點(diǎn)特性。另一種此類(lèi)技術(shù)是“祀向誘導(dǎo)基因組的局部損傷(Targeting InducedLocalLesions in Genomes) ”,這是一種以祀向方式改變基因功能的非轉(zhuǎn)基因方法。該方法包括用例如甲磺酸乙酯(EMS)使植物突變，然后找出其中特定所需基因已被修飾的個(gè)體。該技術(shù)可參見(jiàn)例如 Slade 和Knauf, Transgenic Res. 2005年4 月；14 (2) :109-15 以及Henikoff,Till 和 Comai，Plant PhysiOl. 2004 年 6 月；135(2) :630-6。消除基因表達(dá)的另一種方法是通過(guò)利用根瘤農(nóng)桿菌的T-DNA插入突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。在產(chǎn)生了插入突變體之后，可對(duì)突變體進(jìn)行篩選以鑒定那些在適當(dāng)基因中包含所述插入的突變體。可將在期望基因處包含單個(gè)轉(zhuǎn)基因插入事件的植物進(jìn)行雜交，以生成針對(duì)該突變的純合植物。
對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)地，還可通過(guò)使用cre-lox系統(tǒng)來(lái)修飾植物性狀。可將植物基因組修飾為包含第一和第二 Iox位點(diǎn)，然后將所述Iox位點(diǎn)與Cre重組酶接觸。倘若所述Iox位點(diǎn)的方向相同，則介于這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA序列將會(huì)被切除。如果所述Iox位點(diǎn)的方向相反，則介于其中的序列會(huì)被倒置。本發(fā)明的多核苷酸和多肽還可在不存在表達(dá)盒的情況下通過(guò)以其它方式操控內(nèi)源基因的活性或表達(dá)水平而表達(dá)于植物中，例如，通過(guò)利用T-DNA激活標(biāo)簽來(lái)異位表達(dá)基因(Ichikawa 等(1997)Nature 390698-701 ;Kakimoto 等(1996)Science 274:982-985)。該方法需要用含有多種轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的基因標(biāo)簽轉(zhuǎn)化植物，并且一旦標(biāo)簽被插入基因組中，兩側(cè)基因編碼序列的表達(dá)就被解除控制。在另一實(shí)施例中，可改進(jìn)植物中的轉(zhuǎn)錄機(jī)器以便提高本發(fā)明多核苷酸的轉(zhuǎn)錄水平(參見(jiàn)，例如PCT公開(kāi)物W096/06166和WO 98/53057，其描述了通過(guò)改變DNA結(jié)合基序中的特定氨基酸來(lái)修飾鋅指蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合特異性)。表達(dá)的反義抑制然而，包含上述核苷酸序列的重組DNA構(gòu)建體尤其可用于表達(dá)的有義和反義抑制，例如，用于下調(diào)特定基因的表達(dá)，從而獲得生長(zhǎng)提高的植物表型。也就是說(shuō)，本發(fā)明的核苷酸序列或其子序列或反義序列可用于阻斷天然存在同源核酸的表達(dá)。傳統(tǒng)的有義和反義技術(shù)的變體是本領(lǐng)域已知的，例如描述于Lichtenstein和Nellen(1997), AntisenseTechnology APractical Approach IRL Press at Oxford University，Oxford，England。反義方法的目的是利用與靶基因互補(bǔ)的序列來(lái)阻斷其表達(dá)，以及建立其中單個(gè)選定蛋白質(zhì)的水平被選擇性降低或消除的突變細(xì)胞系或生物體。

例如，為了得到以生長(zhǎng)提高為特征的植物表型，可通過(guò)引入對(duì)應(yīng)于目的多肽之cDNA的反義構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中基因產(chǎn)物表達(dá)的降低或消除(即“敲除”)。對(duì)于反義抑制，在表達(dá)載體中以相對(duì)于啟動(dòng)子序列而言相反的方向(就編碼序列而言)安排編碼基因產(chǎn)物或其部分的cDNA。所引入的序列不需要是全長(zhǎng)的cDNA或基因，也不需要與待轉(zhuǎn)化植物類(lèi)型中所發(fā)現(xiàn)之cDNA或基因完全一致。通常，反義序列只需要能夠與靶基因或目的RNA雜交即可。因此，在引入序列長(zhǎng)度較短的情況下，為了有效的反義抑制就需要與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子序列具有較高程度的同源性。盡管可應(yīng)用各種長(zhǎng)度的反義序列，但優(yōu)選地，在載體中引入的反義序列長(zhǎng)度范圍是15-30個(gè)核苷酸,例如16-28個(gè)核苷酸、17-26個(gè)核苷酸或18-24個(gè)核苷酸，并且隨著反義序列長(zhǎng)度的增加，通常可觀察到反義抑制的提高。優(yōu)選地，載體中反義序列的長(zhǎng)度應(yīng)大于100個(gè)核苷酸。所述反義構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致產(chǎn)生與轉(zhuǎn)錄自植物細(xì)胞內(nèi)源基因的mRNA分子反向互補(bǔ)的RNA分子。有關(guān)應(yīng)用于植物細(xì)胞中的基因表達(dá)反義調(diào)控的更詳細(xì)描述可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 5，107，065，其內(nèi)容通過(guò)引用以整體并入本文。RNA 干擾由雙鏈RNA引起的基因沉默通常稱(chēng)為RNA干擾或RNAi。RNA干擾是雙鏈核糖核酸(dsRNA)片段干擾與該dsRNA共有同源序列的特定基因表達(dá)的一種分子機(jī)制。這種由與加工microRNA同樣的細(xì)胞機(jī)制介導(dǎo)的加工已知為RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。該加工由核糖核酸酶蛋白Dicer起始，Dicer結(jié)合并切割外源雙鏈RNA分子以產(chǎn)生在各端具有少數(shù)未配對(duì)突出堿基的20-25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈片段。由Dicer產(chǎn)生的短雙鏈片段稱(chēng)為小干擾RNA(siRNA)，它們被分開(kāi)并整合入活性RISC復(fù)合物中。如果RNA轉(zhuǎn)錄物的一部分被RNAi分子或構(gòu)建體靶向，則所述整個(gè)轉(zhuǎn)錄物被下調(diào)。RISC復(fù)合物的催化活性組分在動(dòng)物內(nèi)已知為argonaute蛋白，其為介導(dǎo)siRNA誘導(dǎo)的靶mRNA鏈切割的內(nèi)切核酸酶。因?yàn)镈icer產(chǎn)生的片段是雙鏈的，因此它們?cè)诶碚撋厦織l均可產(chǎn)生有功能的siRNA ;但是,兩條鏈中只有一條(稱(chēng)為“引導(dǎo)鏈(guide strand)”)結(jié)合argonaute蛋白并導(dǎo)致基因沉默。另一條反引導(dǎo)鏈(ant1-guide strand)或過(guò)客鏈(passengerstrand)在RISC活化過(guò)程中被降解成RISC底物。選作引導(dǎo)的鏈通常為5’端更穩(wěn)定的鏈，但鏈的選擇不取決于RISC加入前Dicer切割dsRNA的方向。實(shí)驗(yàn)室中使用的RNA干擾常包括引起mRNA切割的堿基完美配對(duì)的dsRNA分子。在整合入RISC中后，siRNA與其靶mRNA堿基配對(duì)并誘導(dǎo)RISC組分蛋白argonaute切割mRNA，從而阻止其被用作翻譯模板。為了在體外或在體內(nèi)穩(wěn)定，siLNA或siRNA化合物的序列不需要與其靶核酸100%互補(bǔ)。siRNA化合物(以及下述的siLNA化合物)與其靶分子互補(bǔ)并可特異性雜交的事實(shí)僅僅意味著siRNA(或siLNA)化合物與靶分子的結(jié)合足夠強(qiáng)及特異，以提供對(duì)靶標(biāo)正常功能的預(yù)期干擾，而非靶mRNA的功能則不受影響。已知摻入寡聚物中的LNA單體會(huì)引起寡聚物及其可形成之雜交體的RNA樣結(jié)構(gòu)。還顯示LNA殘基會(huì)指導(dǎo)該結(jié)構(gòu)朝LNA摻入的3’端方向加入DNA殘基以及朝向5’端的較少延伸。其后果是有可能通過(guò)DNA單體修飾RNA鏈，并且如果一個(gè)或多個(gè)LNA殘基在DNA單體的兩側(cè)，它們?nèi)詴?huì)形成RNA結(jié)構(gòu)。因此，DNA和LNA可替換RNA單體，除此之外，所述寡聚體仍會(huì)形成大體的RNA樣結(jié)構(gòu)。DNA要比RNA便宜得多，并且更易于合成，對(duì)核酸酶也更穩(wěn)定，因此這樣的修飾將提高siRNA的整體用途和適應(yīng)性。生物體在其細(xì)胞攝取外源dsRNA并將其用于RNAi途徑的能力上是不同的。然而，在植物中，由RNAi引起的基因沉默可在植物中的細(xì)胞之間蔓延，因此RNA干擾的作用在植物中是系統(tǒng)性的且可遺傳的。有關(guān)利用dsRNA轉(zhuǎn)錄在植物中進(jìn)行RNAi基因抑制的詳細(xì)描述參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 6，506, 559、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2002/0168707 Al以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)No. 09/423，143 (參見(jiàn) WO 98/53083)、系列號(hào) No. 09/127，735 (參見(jiàn) Wo 99/53050)和系列號(hào)No. 09/084, 942 (參見(jiàn)Wo 99/61631)，所有這些文獻(xiàn)均通過(guò)引用以整體并入本文。在本發(fā)明舉例說(shuō)明的一些具體實(shí)施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO 18-38、48、49、51-60(例如 SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51_60)的序列。載體的構(gòu)建一般地，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠構(gòu)建本發(fā)明的載體并設(shè)計(jì)適于重組基因表達(dá)的方案。有關(guān)載體制備一般方案的更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)MolecularCloning a Laboratory Manual 第二版，Sambrook 等，1989, Cold SpringHarbor Laboratory Press。用于反義基因的啟動(dòng)子可影響反義抑制的水平、時(shí)間選擇、組織、特異性或可誘導(dǎo)性。此外，反義序列可通過(guò)選擇靶基因的獨(dú)特區(qū)域或者它與其它相關(guān)基因共有同源性的區(qū)域來(lái)操縱其特異性。一般地，通過(guò)RNA干擾抑制 基因可使用重組DNA構(gòu)建體來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述重組DNA構(gòu)建體具有與含有所述基因之基因組DNA或cDNA片段的有義和反義元件的DNA元件有效連接的啟動(dòng)子，所述片段為例如約25個(gè)核苷酸，例如至少30個(gè)、至少40個(gè)、至少50個(gè)、至少75個(gè)、至少100個(gè)、至少200個(gè)、至少300個(gè)、至少400個(gè)、至少500個(gè)或至少750個(gè)核苷酸，或者例如至少lkb,例如至少1. 5kb、至少2kb、至少2. 5kb或例如至少3kb,其中所述有義和反義DNA組分可直接連接內(nèi)含子或人工DNA片段，其可在所轉(zhuǎn)錄RNA雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)形成環(huán)。在本發(fā)明的有關(guān)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體還包含組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性的與所述核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子。核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體的一個(gè)實(shí)例具有驅(qū)動(dòng)來(lái)自靶基因之DNA片段以及隨后的以反相重復(fù)形式出現(xiàn)的較短序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，這一切引發(fā)了靶基因的RNAi應(yīng)答。這樣的構(gòu)建體已描述于Brummel D. A.等 Plant Journal 2003, 33,第 793-800 頁(yè))。在另一實(shí)例中，人工microRNA的構(gòu)建是用啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)模擬microRNA功能的RNA分子表達(dá)，而設(shè)定基因特異性的序列是通過(guò)重組方式引入的(參見(jiàn)Niu等，2006. Expression of artificial microRNAs intransgenic Arabidopsis thaliana confers virusresistance. Science 2006, 24 卷，No. 11 第 1420-1428 頁(yè))。microRNA 可以是天然存在而過(guò)表達(dá)的。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體還包含位于轉(zhuǎn)錄盒之前的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，所述轉(zhuǎn)錄盒由靶基因部分及隨后的植物功能性?xún)?nèi)含子以及再后方向相反的該靶基因部分組成，該轉(zhuǎn)錄盒后面是終止子序列。優(yōu)選的載體是本發(fā)明的核苷酸序列之一以反轉(zhuǎn)重復(fù)方向插入的這種類(lèi)型。在本發(fā)明目前一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體包含SEQ IDNO 47白勺序列ο目前優(yōu)選用于基于RNAi之方法的核酸構(gòu)建體是被稱(chēng)為pK7GWIWG2(I)的載體。該載體描述于Gateway vectors forAgrobacterium-mediated plants transformation,Karimi, M.等，Trends Inplant Sciences,第 7 卷第 5 期，第 193-195 頁(yè)。同一基本類(lèi)型的載體較早描述于 Wesley S. V.等，Construct design for efficient, efiectiveandhigh-throughput gene silencing in plants. Plant Journal 2001,27,第 581-590頁(yè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，作為基因一部分的任何序列或本文提供的相應(yīng)mRNA均可用于下調(diào)所述mRNA的水平。在所提供序列不代表完整mRNA的情況下，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)克隆出完整的mRNA,例如Sambrook等所述的技術(shù)。對(duì)于發(fā)現(xiàn)與楊屬基因之mRNA轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的更多序列尤為重要的新近資源是已公開(kāi)的毛果楊的基因組以及描述于 Tuskan 等 2006 (G. A Tuskan 等，2006. The genome of BlackCottonwood, Populustricocarpa(Torr. &Gray). Science 313 卷 No. 5793,第 1596-1604 頁(yè))中的資源。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括用所述核酸構(gòu)建體或重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物可再生細(xì)胞并從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物的另外步驟。當(dāng)將以上DNA構(gòu)建體或載體引入植物細(xì)胞中時(shí)，必須考慮到本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的某些問(wèn)題。如上所述，待插入的核酸應(yīng)組裝于含有驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄之有效調(diào)控元件的構(gòu)建體內(nèi)。必須有可將構(gòu)建體轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的方法。構(gòu)建體一旦在細(xì)胞內(nèi)，就會(huì)整合或不整合進(jìn)內(nèi)源染色體物質(zhì)。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的轉(zhuǎn)化技術(shù)將DNA構(gòu)建體和載體引入植物細(xì)胞內(nèi)以產(chǎn)生具有改良之植物生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物，尤其是轉(zhuǎn)基因樹(shù)木。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可利用多種宿主細(xì)胞作為本發(fā)明DNA構(gòu)建體和載體的受者。宿主細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括胚胎組織、Ι、Π和III型愈傷組織、下胚軸、分生組織、根組織以及在韌皮部中表達(dá)的組織的細(xì)胞。如上所列舉的，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛用于轉(zhuǎn)化樹(shù)木品種尤其是硬木品種(例如楊樹(shù))的一種方法。產(chǎn)生穩(wěn)定的、可繁育的轉(zhuǎn)基因植物目前在本領(lǐng)域中是常規(guī)的技術(shù)。當(dāng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率低或無(wú)效時(shí)(例如在某些裸子植物品種中)，可使用其它方法，例如微粒或顆粒轟擊、電穿孔、顯微注射、直接的DNA攝取、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取或渦旋混合(vortexing)方法。或者，可采用不同技術(shù)的組合來(lái)提高轉(zhuǎn)化處理的效率，例如用農(nóng)桿菌包被的微粒轟擊或者微粒轟擊引起創(chuàng)傷后與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。應(yīng)當(dāng)理解，轉(zhuǎn)化技術(shù)的具體選擇應(yīng)取決于其轉(zhuǎn)化某植物品種的效率以及本發(fā)明實(shí)施人員對(duì)選擇具體方法的經(jīng)驗(yàn)和偏好。對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，對(duì)用于將核酸引入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體系的具體選擇不是本發(fā)明的本質(zhì)問(wèn)題或?qū)Ρ景l(fā)明產(chǎn)生限制，對(duì)植物再生技術(shù)的選擇也是如此。轉(zhuǎn)化后，優(yōu)選使用摻入轉(zhuǎn)化載體中的顯性選擇標(biāo)記來(lái)選擇轉(zhuǎn)基因植物。通常，這樣的標(biāo)記可使轉(zhuǎn)化植物具有抗生素或除草劑抗性，可通過(guò)將植物暴露于適當(dāng)濃度的抗生素或除草劑中來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的選擇。新型選擇標(biāo)記利用D形(D-form)氨基酸并基于植物只可耐受L形氨基酸的事實(shí)，其提供了一種快速、有效并對(duì)環(huán)境有利的選擇體系。該選擇體系之所以吸引人是因?yàn)樗饶苓x擇又能反選擇(counter-selection)。隨后，如本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)一樣，植物可從例如單個(gè)細(xì)胞、愈傷組織或葉盤(pán)再生。幾乎任何植物都可從植物的細(xì)胞、組織和器官`完全再生。可用的技術(shù)綜述于Vasil等1984，Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants, I, II 和 III 卷，LaboratoryProcedureso在選定轉(zhuǎn)化植物并培養(yǎng)至成熟后，鑒定出那些表現(xiàn)出生長(zhǎng)提高表型的植物。此外，為了證實(shí)所述表型歸因于本文公開(kāi)之多肽或多核苷酸表達(dá)水平或活性的改變，可利用Northern印跡、RT-PCR或微陣列分析mRNA表達(dá)或利用免疫印跡、Western印跡或凝膠遷移測(cè)定分析蛋白質(zhì)表達(dá)來(lái)加以確定。植物品種根據(jù)本發(fā)明，所述方法生成了較其來(lái)源的野生型植物而言生長(zhǎng)有所提高的轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是多年生植物，即存活超過(guò)兩年的植物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述多年生植物是木本植物，其可定義為具有高度木質(zhì)化之莖(或多于一條莖)的維管植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述木本植物是硬木植物，即闊葉樹(shù)或被子植物，其可選自金合歡樹(shù)、桉樹(shù)、角樹(shù)、山毛櫸樹(shù)、桃花心木、胡桃、橡樹(shù)、白蠟樹(shù)、柳樹(shù)、山胡桃樹(shù)、樺樹(shù)、栗樹(shù)、楊樹(shù)、赤楊、楓樹(shù)、懸鈴木、銀杏樹(shù)、棕櫚樹(shù)和香楓。來(lái)自楊柳科的硬木植物(例如柳樹(shù)、楊樹(shù)和山楊)包括其變體是特別令人關(guān)注的，因?yàn)檫@兩種類(lèi)型包括生長(zhǎng)迅速的樹(shù)木品種或者為供暖提供木材和生物燃料而專(zhuān)門(mén)培育的木本灌木。用作生物能源的纖維質(zhì)草類(lèi)(例如柳枝稷和草蘆)也是令人關(guān)注的。在另一些實(shí)施方案中，所述木本植物是軟木或針葉樹(shù)，其可選自柏樹(shù)、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹(shù)、巨杉、云杉和紫杉。
在可用的實(shí)施方案中，所述木本植物是結(jié)果植物，其可選自蘋(píng)果樹(shù)、李子樹(shù)、梨樹(shù)、香蕉樹(shù)、桔樹(shù)、獼猴桃樹(shù)、檸檬樹(shù)、櫻桃樹(shù)、葡萄樹(shù)和無(wú)花果樹(shù)。可用于本發(fā)明方法中的其它木本植物還可選自棉花、竹子和橡膠植物。DNA構(gòu)律體根據(jù)本發(fā)明的另一主要方面，提供了至少包含一個(gè)上述序列的DNA構(gòu)建體(例如重組DNA構(gòu)建體)。具體地，所述重組DNA構(gòu)建體可包含選自以下的核苷酸序列a)包含選自 SEQ ID NO : 1_17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)之序列的核苷酸序列；b) a)之核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列；c)a)或b)之核苷酸序列的子序列或片段；d)與a)、b)和c)中的任一序列至少60% —致的核酸序列；以及e)在嚴(yán)格條件下與a)、b)或c)之核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
在本發(fā)明的一些選定實(shí)施方案中，d)中的核酸序列與a)、b)和c)中的任一序列至少65%—致,例如與a)、b)和c)中的任一序列至少70%—致,至少75%—致,至少80%一致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%—致，至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。在與本發(fā)明該方面相關(guān)的另一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列包含選自SEQ IDNO :18-38、48、49、51-60(例如 SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51_60)的序列或其互補(bǔ)
核苷酸序列。同樣與本發(fā)明的該方面有關(guān)，顯然地，上述c)中的子序列或片段包含至少15個(gè)核苷酸，例如至少16個(gè)核苷酸、至少17個(gè)核苷酸、至少18個(gè)核苷酸、至少19個(gè)核苷酸、至少20個(gè)核苷酸、至少21個(gè)核苷酸、至少22個(gè)核苷酸、至少23個(gè)核苷酸、至少24個(gè)核苷酸、至少25個(gè)核苷酸，例如至少30個(gè)核苷酸、至少35個(gè)核苷酸、至少40個(gè)核苷酸、至少45個(gè)核苷酸、至少50個(gè)核苷酸、至少55個(gè)核苷酸、至少60個(gè)核苷酸、至少65個(gè)核苷酸、至少70個(gè)核苷酸、至少75個(gè)核苷酸、至少80個(gè)核苷酸、至少85個(gè)核苷酸、至少90個(gè)核苷酸、至少95個(gè)核苷酸，或者例如至少100個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，上述c)中的子序列或片段包含至少約 150 個(gè)核酸殘基，例如至少約 200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800個(gè)核苷酸，例如至少約900個(gè)核苷酸，或者例如至少約lkb、1. lkb、1. 2kb、
1.3kb、l. 4kb、l. 5kb、l. 6kb、l. 7kb、l. 8kb、l. 9kb、2kb、2. lkb,2. 2kb、2. 3kb、2. 4kb、2. 5kb、
2.6kb、2. 7kb、2. 8kb、2. 9kb 或例如至少約 3kb。同樣，根據(jù)以上論述，所述核苷酸序列編碼含有a)多肽之保守替換變體的多肽。另外，所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替換。在涉及本發(fā)明該方面的另一些實(shí)施方案中，所述子序列或片段與上述a)中核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域具有至少65%的序列同一性，例如與上述a)中核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域至少70%—致，至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%—致，至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5% —致。在一些具體的實(shí)施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO : 18-38、48、49、51-60(例如 SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51_60)的序列。
在另一些實(shí)施方案中并且根據(jù)以上描述，重組DNA構(gòu)建體還包含與所述核苷酸序列有效連接的組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性的啟動(dòng)子。特別地，所述重組DNA構(gòu)建體還可包含位于轉(zhuǎn)錄盒之前的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，所述轉(zhuǎn)錄盒由靶基因部分及隨后的植物功能性?xún)?nèi)含子以及再后方向相反的上述靶基因部分組成。同樣如上文所解釋地，另一類(lèi)優(yōu)選的重組DNA構(gòu)建體包含驅(qū)動(dòng)來(lái)自靶基因之DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子以及隨后的以反轉(zhuǎn)重復(fù)形式存在的較短序列。在本發(fā)明目前示例的一些實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含SEQID NO :47的序列。轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明的第三方面提供了包含重組多核苷酸(DNA構(gòu)建體)的轉(zhuǎn)基因植物，所述重組多核苷酸包含能改變植物中在木質(zhì)形成階段中特異性表達(dá)的至少一種基因的基因產(chǎn)物水平的核苷酸序列。與上述類(lèi)似地，應(yīng)當(dāng)理解，在某一實(shí)施方案中所述至少一種基因的選擇滿(mǎn)足該基因的RNAi下調(diào)在一組3-8株轉(zhuǎn)基因植物中引起以下效果的標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)比較在18小時(shí)光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/l、K 56g/l的條件下于溫室中培育8周的所述轉(zhuǎn)基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時(shí)，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)中具有5%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)和直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有5%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)中具有18%或更大的差異；和/或

d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)和/或直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有18%或更大的差異；其中最大高度生長(zhǎng)速率定義為以4個(gè)連續(xù)的高度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合的線性函數(shù)的斜率，高度生長(zhǎng)速率值是以逐步的方式針對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)1-4、數(shù)據(jù)點(diǎn)2-5等計(jì)算得到的，而最大高度生長(zhǎng)速率值是最后針對(duì)每株植物從生長(zhǎng)速率值中選擇的。根據(jù)本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案，在木質(zhì)形成階段表達(dá)的基因的選擇滿(mǎn)足該基因的RNAi下調(diào)在一組3-8株轉(zhuǎn)基因植物中引起以下效果的標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)比較在18小時(shí)光周期、22°C /15°C溫度(白天/夜晚)以及每周一次施用N84g/l、P 12g/、K 56g/l的條件下于溫室中培育8周的所述轉(zhuǎn)基因植物組與相同條件下培育的野生型植物組時(shí)，a)在最終高度平均值(AFH)、最終高度最大值(MFH)、最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)中具有8%或更大的差異；和/或b)在最終直徑平均值(AFD)、最終直徑最大值(MFD)、直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)和直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有8%或更大的差異；和/或c)在最終高度平均值(AFH)和/或最終直徑平均值(AFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率平均值(AMHGR)和/或直徑生長(zhǎng)速率平均值(ADGR)中具有22%或更大的差異；和/或d)在最終高度最大值(MFH)和/或最終直徑最大值(MFD)和/或最大高度生長(zhǎng)速率最大值(MMHGR)和/或直徑系數(shù)最大值(MDC)中具有22%或更大的差異；
其中最大高度生長(zhǎng)速率定義為以4個(gè)連續(xù)的高度數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合的線性函數(shù)的斜率，高度生長(zhǎng)速率值是以逐步的方式針對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)1-4、數(shù)據(jù)點(diǎn)2-5等計(jì)算得到的，而最大高度生長(zhǎng)速率值是最后針對(duì)每株植物從生長(zhǎng)速率值中選擇的。根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案，將包含選自以下核苷酸序列的至少一種基因的基因產(chǎn)物水平相對(duì)于各自相應(yīng)野生型植物中所發(fā)現(xiàn)的水平進(jìn)行改變a)選自 SEQ ID NO :1-17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、
16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)的核苷酸序列；b)與選自 SEQ ID NO :1-17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)的核苷酸序列至少60%—致的核苷酸序列；c)a)或b)之核苷酸序列的子序列或片段。根據(jù)本方面的另一實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物包含含有選自以下組中的核苷酸序列的重組多核苷酸(DNA構(gòu)建體)d)包含選自 SEQ ID NO : 1_17、50、51、54_58、60 (例如 SEQ ID NO :1、2、5、6、10、13、15、16、17、50、51、54、55、56、57、58、60)之序列的核苷酸序列；e) d)之核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列；f) d)或e)之核苷酸序列的子序列或片段；g)與d)、e)和f)中的任一序列至少60% —致的核酸序列；以及h)在嚴(yán)格條件下 與d)、e)或f)之核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在本發(fā)明該方面的另一些實(shí)施方案中，C)或g)中的核酸序列與8)、13)、(1)、6)或f)中的任一序列至少65%完全相同，例如與a)、b)、d)、e)或f)中的任一序列至少70%一致，至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%—致，至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。如上所提及地，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到本領(lǐng)域中存在多種方法用于得到本發(fā)明的核酸序列和多核苷酸構(gòu)建體，例如，通過(guò)克隆技術(shù)、將固相合成產(chǎn)生的片段加以組裝來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，技術(shù)人員應(yīng)理解，可從其它物種分離出所述序列的同源物，其非限制性的實(shí)例包括金合歡樹(shù)、桉樹(shù)、角樹(shù)、山毛櫸樹(shù)、桃花心木、胡桃、橡樹(shù)、白蠟樹(shù)、山胡桃樹(shù)、樺樹(shù)、栗樹(shù)、赤楊、楓樹(shù)、懸鈴木、銀杏樹(shù)、棕櫚樹(shù)、香楓、柏樹(shù)、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹(shù)、巨杉、云杉、紫杉、蘋(píng)果樹(shù)、李子樹(shù)、梨樹(shù)、香蕉樹(shù)、桔樹(shù)、稱(chēng)猴桃樹(shù)、梓檬樹(shù)、樓桃樹(shù)、葡萄樹(shù)、無(wú)花果樹(shù)、棉花、竹子、柳枝稷(switch grass)、草蘆(red canary grass)和橡膠植物。所述序列的可用同源物還可從來(lái)自楊柳科的硬木植物中分離，例如來(lái)自柳樹(shù)、楊樹(shù)或山楊。特別地，本發(fā)明的核苷酸序列包含選自SEQ ID NO : 18_38、48、49、51_60 (例如SEQID NO :20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列或其互補(bǔ)核苷酸序列。此外，顯然地，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少15個(gè)核苷酸，例如至少16個(gè)核苷酸、至少17個(gè)核苷酸、至少18個(gè)核苷酸、至少19個(gè)核苷酸、至少20個(gè)核苷酸、至少21個(gè)核苷酸、至少22個(gè)核苷酸、至少23個(gè)核苷酸、至少24個(gè)核苷酸、至少25個(gè)核苷酸，例如至少30個(gè)核苷酸、至少35個(gè)核苷酸、至少40個(gè)核苷酸、至少45個(gè)核苷酸、至少50個(gè)核苷酸、至少55個(gè)核苷酸、至少60個(gè)核苷酸、至少65個(gè)核苷酸、至少70個(gè)核苷酸、至少75個(gè)核苷酸、至少80個(gè)核苷酸、至少85個(gè)核苷酸、至少90個(gè)核苷酸、至少95個(gè)核苷酸或例如至少100個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，上述c)或f)中的子序列或片段包含至少約150個(gè)核酸殘基，例如至少約 200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800個(gè)核苷酸，例如至少約900個(gè)核苷酸，或者例如至少約lkb、1. lkb、1. 2kb、1. 3kb、1. 4kb、
1.5kb、l. 6kb、l. 7kb、l. 8kb、l. 9kb、2kb、2. lkb,2. 2kb、2. 3kb,2. 4kb、2. 5kb、2. 6kb,2. 7kb、
2. 8kb、2. 9kb或例如至少約3kb。特別地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含的核苷酸序列相對(duì)于所述特定序列而言含有只改變編碼多肽中一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的保守變體，這樣的轉(zhuǎn)基因植物也可根據(jù)本發(fā)明提供和使用。因此，提供包含如下重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物是在本發(fā)明范圍內(nèi)的，即該重組DNA構(gòu)建體含有的核苷酸序列編碼包含a)或d)之多肽之保守替換變體的多肽。因此，本發(fā)明還可提供重組DNA構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替換，即，重組DNA構(gòu)建體可包含不改變?cè)摱嗪塑账崴幋a之氨基酸序列的序列變化。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，所述子序列或片段與上述a)或d)中核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域具有至少65%的序列同一性，例如與上述a)或d)中核苷酸序列的保守結(jié)構(gòu)域至少70%—致，至少75%—致，至少80%—致，至少85%—致，至少87%—致，至少90%一致,至少95%—致，至少97%—致，至少98%—致，至少99%—致或至少99. 5%—致。在本發(fā)明示例的具體實(shí)施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ IDNO =18-38,48、49、51-60(例如 SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51_60)的序列。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因植物包含重組多核苷酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體還包含與所述核苷酸序列有效連接的組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性的啟動(dòng)子。在又一些實(shí)施方案中，所述重組多核苷酸構(gòu)建體還包含位于轉(zhuǎn)錄盒之前的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，所述轉(zhuǎn)錄盒由靶基因部分及隨后的植物功能性?xún)?nèi)含子以及再后的方向相反的該靶基因部分組成。同樣如上文所解釋地，另一類(lèi)優(yōu)選的重組多核苷酸構(gòu)建體包含驅(qū)動(dòng)來(lái)自靶基因之DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子以及隨后的以反轉(zhuǎn)重復(fù)形式存在的較短序列。在本發(fā)明示例的一些具體實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物包含重組多核苷酸構(gòu)建體，其中c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO :18-38、48、49、51-60(例如SEQ ID NO :20、29、36、37、38、48、49、51-60)的序列。在本發(fā)明目前優(yōu)選的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物包含含有SEQ ID NO 47之序列的重組DNA構(gòu)建體。植物品種根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因植物可以是多年生植物，優(yōu)選木本植物或木質(zhì)品種。在一個(gè)可用的實(shí)施方案中，所述木本植物是硬木植物，其可選自金合歡樹(shù)、桉樹(shù)、角樹(shù)、山毛櫸樹(shù)、桃花心木、胡桃、橡樹(shù)、白蠟樹(shù)、柳樹(shù)、山胡桃樹(shù)、樺樹(shù)、栗樹(shù)、楊樹(shù)、赤楊、楓樹(shù)、懸鈴木、銀杏樹(shù)、棕櫚樹(shù)和香楓。來(lái)自楊柳科的硬木植物(例如柳樹(shù)、楊樹(shù)和山楊)包括其變體是特別令人關(guān)注的，因?yàn)檫@兩種類(lèi)型包括生長(zhǎng)迅速的樹(shù)木品種或者為供暖提供木材和生物燃料而專(zhuān)門(mén)培育的木本灌木。在另一些實(shí)施方案中，所述木本植物是針葉樹(shù)，其可選自柏樹(shù)、花旗松、冷杉、紅杉、鐵杉、雪松、杜松、落葉松、松樹(shù)、巨杉、云杉和紫杉。在一些可用的實(shí)施方案中，所述木本植物是結(jié)果植物，其可選自蘋(píng)果樹(shù)、李子樹(shù)、梨樹(shù)、香蕉樹(shù)、桔樹(shù)、獼猴桃樹(shù)、檸檬樹(shù)、櫻桃樹(shù)、葡萄樹(shù)和無(wú)花果樹(shù)。 可用于本發(fā)明方法中的其它木本植物還可選自棉花、竹子和橡膠植物。本發(fā)明延伸至通過(guò)本文所述方法獲得的以上轉(zhuǎn)基因植物的任何植物細(xì)胞，以及所有的植物部分，包括植物的可收獲部分、種子及其繁殖體以及植物外植體或植物組織。本發(fā)明還涵蓋包含本發(fā)明DNA構(gòu)建體的植物及其部分、植物細(xì)胞或植物后代。本發(fā)明進(jìn)一步延伸至涵蓋經(jīng)由上述任何方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或完整植物的后代，唯一的要求是該后代需表現(xiàn)出與經(jīng)由本發(fā)明方法產(chǎn)生的親本一樣的基因型和/或表型特征。應(yīng)當(dāng)注意的是，在本發(fā)明各方面之一中所述的實(shí)施方案和特征也適用于本發(fā)明的其它方面。本申請(qǐng)中引用的所有專(zhuān)利和非專(zhuān)利文獻(xiàn)均通過(guò)引用以整體并入本文。現(xiàn)在將在以下非限制性的實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。
實(shí)施例實(shí)施例1鑒定參與木質(zhì)形成和木材生長(zhǎng)的可用基因1.1 介紹為了發(fā)現(xiàn)和闡明參與木質(zhì)形成和木質(zhì)生長(zhǎng)之基因的功能，實(shí)施了廣泛的基因發(fā)掘計(jì)劃(gene mining program),由此鑒定了在木材工業(yè)應(yīng)用中可用的基因。1. 2.材料和方法1.2.1基因選擇為了縮小待檢測(cè)功能之基因的范圍，該基因發(fā)掘方案的第一步是從一個(gè)大的基因集合中選擇某些基因。該基因選擇方法是基于如Hertzberg等(2001)和Schrader等(2004)中所述的基因表達(dá)模式。在Hertzberg等(2001)中描述了對(duì)發(fā)育中的楊樹(shù)次生木質(zhì)部的研究。楊樹(shù)的次生木質(zhì)部是高度組織化的，在不同發(fā)育階段具有易識(shí)別的且獨(dú)特的邊界。木質(zhì)形成開(kāi)始于維管形成層。形成層衍生物通過(guò)分裂、擴(kuò)大、次生壁形成、木質(zhì)化和最終的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程發(fā)育成木質(zhì)部細(xì)胞。利用樹(shù)木維管分生組織的大尺寸通過(guò)切向冷凍切片獲取來(lái)自確定發(fā)育階段的樣品。為了測(cè)定歐洲山楊X美洲山楊(雜交山楊)中個(gè)體發(fā)育的木質(zhì)形成期間特定階段的穩(wěn)定狀態(tài)mRNA水平，采集貫穿木質(zhì)發(fā)育區(qū)的30 μ m厚切片的樣品，并隨后用由來(lái)自雜交山楊的2995個(gè)獨(dú)特EST組成的點(diǎn)樣cDNA微陣列對(duì)樣品進(jìn)行分析(Hertzberg等，2001)。隨后還將這些樣品如Schrader等(2004)中所述與已點(diǎn)樣的微陣列再次雜交。從這些實(shí)驗(yàn)中，在木質(zhì)形成不同階段具有明顯的特異性表達(dá)的基因被挑選出來(lái)(參見(jiàn)圖1)。這是基于基因通常在其表達(dá)部位發(fā)揮其功能的推測(cè)。因此，在不同的木質(zhì)形成階段(例如細(xì)胞分裂、細(xì)胞擴(kuò)大和形成層區(qū)域中細(xì)胞定型)特異性表達(dá)的基因以及在在次生細(xì)胞壁形成期間表達(dá)在成熟區(qū)域內(nèi)的基因(其定義參見(jiàn)Wilson等，1966)比任何隨機(jī)選擇的基因更有可能對(duì)于木質(zhì)形成過(guò)程具有重要性。與其它植物分生組織類(lèi)似，維管形成層(圖1，區(qū)域A)的主要功能是細(xì)胞分裂和起始分化。主要表達(dá)于分生組織和早期細(xì)胞擴(kuò)大區(qū)域(圖1，區(qū)域B)中的序列代表了參與細(xì)胞周期、細(xì)胞擴(kuò)大、纖維尖端生長(zhǎng)和初生細(xì)胞壁生物合成的候選基因。區(qū)域A和B還預(yù)期表達(dá)調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)和細(xì)胞身份的基因。細(xì)胞擴(kuò)大發(fā)生于分生組織(區(qū)域A)中以及區(qū)域B和C中。因此，跨越區(qū)域A、B和C(圖1)表達(dá)的基因可能在細(xì)胞擴(kuò)大中發(fā)揮作用。細(xì)胞擴(kuò)大一完成，次生細(xì)胞壁就沉積于所有木質(zhì)部細(xì)胞內(nèi)(區(qū)域D)。參與次生細(xì)胞壁生物合成的絕大多數(shù)基因預(yù)測(cè)存在于區(qū)域C (維管在此處起始其次生細(xì)胞壁)、D和E(圖1)中。在區(qū)域E(圖1)中顯著上調(diào)的基因包括貫穿細(xì)胞壁形成凹陷(pit)和孔(pore)的最后階段所需的許多壁降解酶，或者與纖維成熟的晚期階段(例如木質(zhì)化和程序性細(xì)胞死亡)相關(guān)的基因。表達(dá)于此區(qū)域內(nèi)的基因還包括參與射線細(xì)胞(ray cell)中新陳代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，所述射線細(xì)胞(與纖維相反)保持存活并維持其代謝活性。選擇在木質(zhì)部發(fā)育不同階段表達(dá)的大量不同基因用于通過(guò)在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植物中的RNAi下調(diào)進(jìn)行功能基因組分析。圖2顯示了選定并測(cè)試其功能之基因的表達(dá)模式的實(shí)例。除了這種選擇之外，還基于Schrader等(2004)中所述的分生組織陣列基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇基因。在該實(shí)驗(yàn)中只有形成層區(qū)域被采樣。但是，樣品更薄，導(dǎo)致了形成層分生組織的更高分辨率，即一個(gè)切片相當(dāng)于形成層區(qū)域的約三層細(xì)胞，這樣，為獲得表達(dá)圖譜提供了接近細(xì)胞特異性的分辨率。從該實(shí)驗(yàn)中，選擇在形成層區(qū)域內(nèi)具有峰值或者在形成層分生組織的表達(dá)中有急劇變化的基因(Schrader等2004)用于通過(guò)在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植物中的RNAi下調(diào)進(jìn)行功能基因組分析。在基于表達(dá)模式進(jìn)行選擇后，基于基因注釋對(duì)基因進(jìn)行篩選，并排除了具有顯然不感興趣之基因注釋的基因(例如核糖體蛋白基因)。為了降低成本和更快地找到感興趣的基因，在直接針對(duì)生長(zhǎng)和木質(zhì)特性的功能基因組方案中仔細(xì)挑選待進(jìn)行功能測(cè)試的基因是非常有益的。盡管選擇用于功能分析的基因是以經(jīng)濟(jì)有效的方式發(fā)現(xiàn)具有對(duì)林木生物技術(shù)而言值得關(guān)注之功能的基因的一個(gè)重要部分，但事實(shí)上檢測(cè)選定基因的基因功能對(duì)于發(fā)現(xiàn)其在工業(yè)應(yīng)用中的用 途而言是關(guān)鍵的步驟。例如在本文中進(jìn)行的基因選擇僅僅對(duì)于為了使定向針對(duì)某些特性/功能之功能性基因組方案(例如，用突變體或轉(zhuǎn)基因植物/生物進(jìn)行大規(guī)模基因測(cè)試)的陽(yáng)性結(jié)果最大化具有重要性。基因選擇的結(jié)果是184種可能的基因，最終對(duì)其中150種進(jìn)行了功能分析，其中的17種基因由于其參與以及可用于改變和/或修飾與生長(zhǎng)和改良的木質(zhì)化學(xué)性質(zhì)有關(guān)的樹(shù)木表型而被進(jìn)一步選擇。來(lái)自184種選定基因的表達(dá)模式的實(shí)例如圖2和圖3所示。1. 2. 2選定基因的克隆隨后利用Gateway技術(shù)(Invitrogen USA)將選定的基因克隆進(jìn)受CaMV 35S啟動(dòng)子控制的RNAi載體(RNA干擾載體，pK7GWIWG2(I))中。使用了兩套主要的克隆引物，一套是與載體和poly-Α尾配對(duì)結(jié)合的通用引物，另一套是基因特異性引物。首先將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入pDONR載體(Invitrogen USA)中，隨后根據(jù)制造商的說(shuō)明(Invitrogen USA)轉(zhuǎn)移入目的載體PK7GWIWG2 (I)中。選定基因的序列、其基因庫(kù)登錄編號(hào)和PCR引物等列于表1.1中。表1.1基因庫(kù)登錄編號(hào)、序列和PCR引物等表1.1a
權(quán)利要求
1.通過(guò)產(chǎn)生與其野生型相比生長(zhǎng)有所提高之轉(zhuǎn)基因植物的方法而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的木材，其中所述方法包括改變植物中來(lái)自SEQ IDNO 15的核苷酸序列所編碼之基因產(chǎn)物的水平，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是木本植物。
2.包含選自以下序列中至少一種序列的DNA構(gòu)建體 a)來(lái)自SEQID NO 15的核苷酸序列；或 b)子序列SEQ ID NO :36 ;或 c)a)或b)之核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用生物信息學(xué)工具、來(lái)自EST測(cè)序和DNA陣列的數(shù)據(jù)從鑒定得到的大批候選基因中選擇具有可商用表型之基因的一種新的應(yīng)用廣泛的分析平臺(tái)。本發(fā)明的一方面提供了與其野生型相比生長(zhǎng)有所提高的轉(zhuǎn)基因植物的生成方法。該方法包括改變植物中在木質(zhì)形成不同階段特異性表達(dá)的至少一種基因的基因產(chǎn)物水平。本發(fā)明另一些方面提供了包含本發(fā)明重組多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞或植物后代。其它一些方面涉及包含本發(fā)明核苷酸序列的DNA構(gòu)建體以及包含所述DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞或植物后代。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103031330SQ20121050647
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2007年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者芒努斯·赫茨貝里, 戈蘭·桑德貝里, 亞爾莫·施拉德?tīng)? 大衛(wèi)·瑟德斯特倫 申請(qǐng)人:瑞典樹(shù)木科技公司