專利名稱：一種利用多基因轉(zhuǎn)化培育淀粉含量提高轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用多基因轉(zhuǎn)化培育淀粉含量提高轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
1977年Ackermann等首先用Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞獲得再生植株，開創(chuàng)了植物轉(zhuǎn)基因的歷史。此后，有多種技術(shù)被發(fā)明并應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、原生質(zhì)體法和花粉管通道法，另外還有病毒介導(dǎo)法、電擊法、顯微注射法、超聲波導(dǎo)入法、吸漲法、花粉攜帶法、脂質(zhì)體法、激光微束穿刺法、離子束法等，應(yīng)用這些方法，已有大量的植物物種被轉(zhuǎn)化成功并產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植株。這些轉(zhuǎn)化方法，一般是一次將一個目的基因?qū)胫参锛?xì)胞、并使其穩(wěn)定整合到植物基因組中。為了提高農(nóng)作物的產(chǎn)量或其它農(nóng)藝性狀，常需要將幾個基因?qū)氲绞荏w植物中，采用普通轉(zhuǎn)基因方法只能采用分多次、每次轉(zhuǎn)入一個基因的策略，轉(zhuǎn)化效率較低，因此，產(chǎn)生了一些多基因轉(zhuǎn)化方法，一是在構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體時，將多個基因表達框串聯(lián)到T-DNA區(qū)上，該技術(shù)構(gòu)建載體比較繁瑣，受Ti質(zhì)粒容量的限制無法構(gòu)建包含大于50Kb插入序列的載體；二是將不同外源基因分別構(gòu)建到不同表達載體上的T-DNA區(qū)域，然后將含不同基因的表達載體轉(zhuǎn)入同一農(nóng)桿菌細(xì)胞中，進行多基因轉(zhuǎn)化，但采用這種方法時需要考慮農(nóng)桿菌容納多個質(zhì)粒的能力。此外還可以通過其它策略將多個轉(zhuǎn)基因?qū)胪恢参锊牧现校鐚⒑胁煌D(zhuǎn)基因的植物進行雜交，但這些方法不可避免的需要多個植物生長周期才能實現(xiàn)。很多基因的表達具有組織特異性，某些淀粉合成、谷蛋白合成相關(guān)基因僅在禾谷類作物的種子中特異表達，其產(chǎn)物主要催化各種淀粉和谷蛋白的合成，它們構(gòu)成了胚乳的主要成分，這些基因的組織特異性表達是由其啟動子的特異性決定的，如:小麥高分子量谷蛋白(HMW)啟動子、大麥D組醇溶蛋白(D-hordin)啟動子、大麥B組醇溶蛋白(B-hordin)啟動子、水稻谷蛋白(Gtl)啟動子、大麥異淀粉酶(Isa)啟動子等。在禾谷類作物的種子中，往往大量積累淀粉，與淀粉合成相關(guān)的基因，也在胚乳發(fā)育時期特異的大量表達，其中比較重要的關(guān)鍵酶或限速酶基因有:蔗糖合成酶基因(Shl)；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大、小亞基，分別由Sh2和Bt2基因編碼；顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSSIIa)基因，決定直鏈淀粉的合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，為如下I)或2):1)為將腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因、蔗糖合成酶基因和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因共導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物組織的總淀粉含量高于所述目的植物；
2)為將篩選標(biāo)記蛋白基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因、蔗糖合成酶基因和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因共導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物組織的總淀粉含量高于所述目的植物。上述方法中，所述篩選標(biāo)記蛋白為PPT (它是Bar基因的蛋白表達產(chǎn)物，英文名Phosphinothricin N-acety I transferase,中譯草丁勝N-乙酸轉(zhuǎn)移酶)，其氨基酸序列為序列表中序列6 ； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基為Bt2，其氨基酸序列為序列表中序列
7；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基為Sh2，其氨基酸序列為序列表中序列
8；所述蔗糖合成酶為Shl，其氨基酸序列為序列表中序列9 ；所述顆粒結(jié)合型淀粉合成酶為GBSSIIa，其氨基酸序列為序列表中序列10。所述篩選標(biāo)記蛋白基因具體為Bar，其核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第2036-2584位核苷酸；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因具體為Bt2，其核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第1935-3362位核苷酸；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因具體為Sh2，其核苷酸序列為序列表中序列3自5’末端第1085-2635位核苷酸；所述蔗糖合成酶基因具體為Shl，其核苷酸序列具體為序列表中序列4自5’末端第592-3000位核苷酸；所述顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因具體為GbssIIa，其核苷酸序列具體為序列表中序列5自5’末端第478-2307位核苷酸。上述方法中，所述篩選標(biāo)記蛋白基因以Bar基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述Bar基因表達盒具體包括Ubi啟動子、Bar基因和nos終止子；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因以Bt2基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述Bt2基因表達盒具體包括Gtl啟動子、Bt2基因和35S終止子；所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因以Sh2基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述Sh2基因表達盒具體包括ISA啟動子、Sh2基因和35S終止子；所述蔗糖合成酶基因以Shl基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述Shl基因表達盒具體包括Blhordein啟動子、Shl基因和35S終止子；所述顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因以GbssIIa基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述GbssIIa基因表達盒具體包括HMW-Glutenin啟動子、GbssIIa基因和35S終止子。上述表達盒中的基因的序列均為基因編碼區(qū)序列。上述方法中，所述Bar基因表達盒通過重組表達載體pTRAuxBar導(dǎo)入目的植物中；所述Bt2基因表達盒通過重組表達載體pGtl_Bt2導(dǎo)入目的植物中；所述Sh2基因表達盒通過重組表達載體pISA_Sh2導(dǎo)入目的植物中；所述Shl基因表達盒通過重組表達載體pBlhor-Shl導(dǎo)入目的植物中；所述GbssIIa基因表達盒通過重組表達載體pHMW-GbssIIa導(dǎo)入目的植物中。
上述方法中，所述組織為種子的胚乳；所述目的植物是雙子葉植物或單子葉植物。在本發(fā)明的實施例中采用的單子葉植物為玉米，具體為玉米H99。本發(fā)明的另一個目的是提供一種向目的植物中共轉(zhuǎn)入多個目的基因的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:I)分別制備混合載體和轉(zhuǎn)基因受體:所述混合載體由等摩爾比的多個重組表達載體組成；每個所述重組表達載體含有對應(yīng)的一個所述目的基因的載體；所述轉(zhuǎn)基因受體按照如下方法制備:Ajf目的植物的外植體進行預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)后外植體；B、將所述預(yù)培養(yǎng)后外植體進行高滲預(yù)培養(yǎng)，得到高滲預(yù)培養(yǎng)后外植體，即為轉(zhuǎn)基因受體； 2)將所述混合載體包被金粉，再通過基因槍導(dǎo)入所述轉(zhuǎn)基因受體中，得到轟擊后外植體；3)將所述轟擊后外植體依次進行傳代培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng),即得到轉(zhuǎn)基因植物，實現(xiàn)向目的植物中共轉(zhuǎn)入多個目的基因。上述方法中，步驟I)中，所述預(yù)培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E按照如下方法制備:向N6基本培養(yǎng)基中添加終濃度為2.76g/L脯氨酸、終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為2mg/L2，4-D、終濃度為100mg/L水解酪蛋白、終濃度為25uM硝酸銀、終濃度為30g/L蔗糖和終濃度為2.5g/L植物凝膠，用水補足體積；所述高滲預(yù)培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為N60SM培養(yǎng)基，所述N60SM培養(yǎng)基按照如下方法制備:向N6基本培養(yǎng)基中添加終濃度為0.69g/L脯氨酸、終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為2mg/L2，4-D、終濃度為100mg/L水解酪蛋白、終濃度為36.4g/L山梨醇、終濃度為36.4g/L甘露醇、終濃度為29mg/L硝酸銀、終濃度為30g/L蔗糖和終濃度為2.5g/L植物凝膠，用水補足體積；步驟2)中，所述金粉與所述混合載體的質(zhì)量比為20:1-500:1 ;在本發(fā)明的實施例中為100:1 ；基因槍真空度27 28psi,用650psi和IlOOpsi可裂膜各轟擊一次,可裂膜至革巴點距離:6cm/9cm ；步驟3)中，所述傳代培養(yǎng)為將所述轟擊后外植體進行傳代培養(yǎng)，得到傳代培養(yǎng)外植體；所述傳代培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E ；所述篩選培養(yǎng)為將所述傳代培養(yǎng)外植體進行篩選培養(yǎng)(除草劑篩選)，得到愈傷組織(抗除草劑biolaphos)；所述篩選培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為N6S培養(yǎng)基；所述N6S培養(yǎng)基按照如下方法制備:向N6基本培養(yǎng)基中添加終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為2mg/L2，4-D、終濃度為2mg/LBialaphos(雙丙胺膦)、終濃度為6mg/L硝酸銀、終濃度為30g/L蔗糖和終濃度為2.5g/L植物凝膠，用水補足體積；所述分化培養(yǎng)為將所述愈傷組織進行分化培養(yǎng)，得到帶有幼葉的愈傷組織(包括地上部分幼葉和地下部分的愈傷組織);
所述分化培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為RMI培養(yǎng)基；所述RMI培養(yǎng)基按照如下方法制備:向MS基本培養(yǎng)基中添加終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為3mg/L Bialaphos (雙丙胺膦)、終濃度為60g/L蔗糖和終濃度為3g/L植物凝膠，用水補足體積；所述生根培養(yǎng)為將所述帶有幼葉的愈傷組織進行生根培養(yǎng)，即得到轉(zhuǎn)基因植物；所述生根培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為RMII培養(yǎng)基；所述RMII培養(yǎng)基按照如下方法制備:向MS基本培養(yǎng)基中添加終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為60g/L蔗糖和終濃度為3g/L植物凝膠，用水補足體積。上述方法中，步驟I)中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件為25_28°C、暗培養(yǎng)1_3天；所述預(yù)培養(yǎng)的條件具體為28°C、暗培養(yǎng)3天；所述高滲預(yù)培養(yǎng)的條件為25_28°C、暗培養(yǎng)4_10h ;所述高滲預(yù)培養(yǎng)的條件具體為28°C、暗培養(yǎng)8h ；步驟3)中，所述傳代培養(yǎng)的條件為25_28°C暗培養(yǎng)14_21天；所述傳代培養(yǎng)的條件具體為28°C暗培養(yǎng)14天；每一次所述篩選培養(yǎng)的條件為25_28°C暗培養(yǎng)2_3周，所述篩選次數(shù)為3_6次；所述分化培養(yǎng)的條件為23_25°C、暗培養(yǎng)1_3周；所述分化培養(yǎng)的條件具體為25 °C、暗培養(yǎng)3周；所述生根培養(yǎng)的條件為22-25 °C、16h光/8h暗培養(yǎng)15天、光照強度為4000-80001ux ;所述生根培養(yǎng)的條件具體為25°C、光照強度為40001ux ；在步驟2)和步驟3)之間還包括如下步驟:將所述轟擊后外植體經(jīng)過再次高滲預(yù)培養(yǎng)；所述再次高滲預(yù)培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為N6S0M培養(yǎng)基，所述再次高滲預(yù)培養(yǎng)的條件為25-28°C暗培養(yǎng)12-24h ;所述再次高滲預(yù)培養(yǎng)的條件具體為28°C再次高滲預(yù)培養(yǎng)20h ；所述目的植物為授粉后12天植物。上述方法中，所述目的植物為雙子葉或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米，具體為玉米H99 ;所述外植體為種子的胚(授粉后12天植物種子的幼胚)；所述多個目的基因為篩選標(biāo)記蛋白基因Bar、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因Bt2、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因Sh2、蔗糖合成酶基因Shl和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因GbssIIa共5個基因；所述多個重組表達載體為pTRAuxBar、pGtl_Bt2、pISA_Sh2、pBlhor-Shl 和pHMW-GbssIIa共5個重組表達載體；所述重組表達載體pTRAuxBar為含有Bar基因表達盒的重組載體；所述重組表達載體pGtl_Bt2為含有Bt2基因表達盒的重組載體，為將序列表中序列2自5’末端第34-3362位核苷酸所示的Bt2基因表達盒中的Gtl啟動子和Bt2基因插入pB7RWG2載體(attBl和attB2位點間)得到的載體；具體構(gòu)建方法見實施例1的一的2)得到；
`
所述重組表達載體pISA_Sh2為含有Sh2基因表達盒的重組載體；為將序列表中序列3自5’末端第28-2635位核苷酸所示的Sh2基因表達盒的中的ISA啟動子和Sh2基因編碼區(qū)插入PB7RWG2載體(attBl和attB2位點間);具體構(gòu)建方法見實施例1的一的3)得到；所述重組表達載體pBlhor-Shl為含有Shl基因表達盒的重組載體；為將序列表中序列4自5’末端第28-3000位核苷酸所示的Shl基因表達盒中的Blhordein啟動子和Shl基因編碼區(qū)連入PB7RWG2載體(attBl和attB2位點間)得到的載體；具體構(gòu)建方法見實施例I的一的4)得到；所述重組表達載體pHMW-GbssIIa為含有GbssIIa基因表達盒的重組載體；為將序列表中序列5自5’末端第28-2307位核苷酸所示GbssIIa基因表達盒中的HMW-Glutenin啟動子和GbssIIa基因編碼區(qū)插入pB7RWG2載體(attBl和attB2位點間)得到的載體；具體構(gòu)建方法見實施例1的一的5)得到。所述Bar基因表達盒具體包括Ubi啟動子、Bar基因和nos終止子；所述Bt2基因表達盒具體包括Gtl啟動子、Bt2基因和35S終止子；所述Sh2基因表達盒具體包括ISA啟動子、Sh2基因和35S終止子；所述Shl基因表達盒具體包括Blhordein啟動子、Shl基因和35S終止子；所述GbssIIa基因表達盒具體包括HMW-Glutenin啟動子、GbssIIa基因和35S終止子。所述Bar基因表達盒的核苷酸序列為序列表中的序列I ;所述Bt2基因表達盒的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述Sh2基因表達盒的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述Shl基因表達盒的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；所述GbssIIa基因表達盒的核苷酸序列為序列表中的序列5。用于多基因轉(zhuǎn)化的表達盒組或用于多基因轉(zhuǎn)化的重組表達載體組也是本發(fā)明保護的范圍；或所述表達盒組或所述重組表達載體組在提高植物組織總淀粉含量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；或用于多基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基組也是本發(fā)明保護的范圍；所述表達盒組為如下I)或2):I)由上述方法中的所述Bt2基因表達盒、所述Sh2基因表達盒、所述Shl基因表達盒和所述GbssIIa基因表達盒組成；2)由上述方法中的所述Bar基因表達盒、所述Bt2基因表達盒、所述Sh2基因表達盒、所述Shl基因表達盒和所述GbssIIa基因表達盒組成；所述重組表達載體組為如下a)或b):a)由上述方法中的 pGtl-Bt2、pISA-Sh2、pBlhor-Shl 和 pHMW-GbssIIa 組成；b)由上述方法中的 pTRAuxBar、pGtl-Bt2、pISA-Sh2、pBlhor-Shl 和 pHMW-GbssIIa組成；所述目的植物具體是雙子葉植物或單子葉植物；所述組織具體為種子的胚乳；所述單子葉植物具體為玉米，具體為玉米H99。所述用于多基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基組由上述方法中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E、所述N60SM培養(yǎng)基、所述N6S培養(yǎng)基、所述RMI培養(yǎng)基和所述RMII培養(yǎng)基組成。為了克服以上傳統(tǒng)單基因或多基因轉(zhuǎn)化方法效率低、可共轉(zhuǎn)化基因少的缺陷，本發(fā)明以基因槍法轉(zhuǎn)化技術(shù)為基礎(chǔ)，采用多種質(zhì)粒，其中每種質(zhì)粒含有一個不同的目的基因表達盒，將這些質(zhì)粒等摩爾比例混合 、包被在金粉表面，并用基因槍轟擊、轉(zhuǎn)化受體植物材料，采用優(yōu)化的組織培養(yǎng)體系，經(jīng)過抗除草劑篩選、植物組織培養(yǎng)和植株再生、外源基因整合檢測、外源基因表達檢測和種子淀粉含量檢測等步驟，建立起了高效的多基因共轉(zhuǎn)化體系，并得到可穩(wěn)定遺傳、表達的多基因共轉(zhuǎn)基因聞淀粉植株。本發(fā)明的實驗證明，一方面，采用本發(fā)明的方法，可通過一次基因槍轟擊，一次性同時轉(zhuǎn)入多個基因，得到轉(zhuǎn)化率較高的多基因共轉(zhuǎn)化再生植株；另外一方面，由于同時轉(zhuǎn)入4種與淀粉代謝相關(guān)的基因和I種篩選標(biāo)記基因，使得轉(zhuǎn)基因再生植株的總淀粉含量含量高于野生型植物；總之，本發(fā)明的方法不僅可以將控制某種生物學(xué)性狀的多個基因，甚至可以將一個代謝途徑中的所有基因，都一次性、高效、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入到受體材料中，極大地提高了轉(zhuǎn)基因效率；而且可以得到高 淀粉含量的轉(zhuǎn)基因植物。


圖1為⑶S染色結(jié)果圖2為試紙條檢測結(jié)果圖3為T4代材料的Southern blot檢測圖4為不同轉(zhuǎn)基因株系中5個基因的表達豐度圖5為共轉(zhuǎn)化的T4代種子總淀粉含量和直鏈淀粉含量測定，其中，a,b, c 代表統(tǒng)計學(xué)差異顯著(Ρ〈0.05, Duncan’ s test)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、共同轉(zhuǎn)5個基因的轉(zhuǎn)基因植物的獲得一、5個表達載體的獲得5個轉(zhuǎn)基因所需要的表達載體分別為pTRAuxBar、pGtl_Bt2、pISA_Sh2、pBlhor-Shl、pHMW-GbssIIa ;上述5個表達載體的具體組成部分見表I所示，構(gòu)建上述5個表達載體所需的引物如表2所示。表I為多基因共轉(zhuǎn)化使用的表達載體
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下I)或2): 1)為將腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因、蔗糖合成酶基因和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因共導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物組織的總淀粉含量高于所述目的植物； 2)為將篩選標(biāo)記蛋白基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因、蔗糖合成酶基因和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因共導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物組織的總淀粉含量高于所述目的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述篩選標(biāo)記蛋白為PPT，其氨基酸序列為序列表中序列6 ； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基為Bt2，其氨基酸序列為序列表中序列7 ； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基為Sh2，其氨基酸序列為序列表中序列8 ； 所述蔗糖合成酶為Shl，其氨基酸序列為序列表中序列9 ； 所述顆粒結(jié)合型淀粉合成酶為GBSSIIa，其氨基酸序列為序列表中序列10 ； 所述篩選標(biāo)記蛋白基因具體為Bar，其核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第2036-2584位核苷酸； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因具體為Bt2，其核苷酸序列為序列表中序列2自5’末端第1935-3362位核苷酸； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因具體為Sh2，其核苷酸序列為序列表中序列3自5’末端第1085-2635位核`苷酸； 所述蔗糖合成酶基因具體為Shl，其核苷酸序列為序列表中序列4自5’末端第592-3000位核苷酸； 所述顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因具體為GbssIIa，其核苷酸序列為序列表中序列5自5’末端第478-2307位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述篩選標(biāo)記蛋白基因以Bar基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述Bar基因表達盒具體包括Ubi啟動子、Bar基因和nos終止子； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因以Bt2基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述Bt2基因表達盒具體包括Gtl啟動子、Bt2基因和35S終止子； 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因以Sh2基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述Sh2基因表達盒具體包括ISA啟動子、Sh2基因和35S終止子； 所述蔗糖合成酶基因以Shl基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述Shl基因表達盒具體包括Blhordein啟動子、Shl基因和35S終止子； 所述顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因以GbssIIa基因表達盒的形式導(dǎo)入目的植物；所述GbssIIa基因表達盒具體包括HMW-Glutenin啟動子、GbssIIa基因和35S終止子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 所述Bar基因表達盒通過重組表達載體pTRAuxBar導(dǎo)入目的植物中； 所述Bt2基因表達盒通過重組表達載體pGtl-Bt2導(dǎo)入目的植物中； 所述Sh2基因表達盒通過重組表達載體pISA-Sh2導(dǎo)入目的植物中； 所述Shl基因表達盒通過重組表達載體pBlhor-Shl導(dǎo)入目的植物中；所述GbssIIa基因表達盒通過重組表達載體pHMW-GbssIIa導(dǎo)入目的植物中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述組織為種子的胚乳； 所述目的植物是雙子葉植物或單子葉植物。
6.一種向目的植物中共轉(zhuǎn)入多個目的基因的方法，包括如下步驟: O分別制備混合載體和轉(zhuǎn)基因受體: 所述混合載體由等摩爾比的多個重組表達載體組成；每個所述重組表達載體含有對應(yīng)的一個所述目的基因的載體； 所述轉(zhuǎn)基因受體按照如下方法制備: A、將目的植物的外植體進行預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)后外植體； B、將所述預(yù)培養(yǎng)后外植體進行高滲預(yù)培養(yǎng)，得到高滲預(yù)培養(yǎng)后外植體，即為轉(zhuǎn)基因受體； 2)將所述混合載體包被金粉，再通過基因槍導(dǎo)入所述轉(zhuǎn)基因受體中，得到轟擊后外植體； 3)將所述轟擊后外植體依次進行傳代培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，即得到轉(zhuǎn)基因植物，實現(xiàn)向目的植物中共轉(zhuǎn)入多個目的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述預(yù)培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E按照如下方法制備:向N6基本培養(yǎng)基中添加終濃度為2.76g/L脯氨酸、終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為2mg/L2，4-D、終濃度為100mg/L水解酪蛋白、終濃度為25uM硝酸銀、終濃度為30g/L蔗糖和終濃度為2.5g/L植物凝膠，用水補足體積； 所述高滲預(yù)培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為N60SM培養(yǎng)基，所述N60SM培養(yǎng)基按照如下方法制備:向N6基本培養(yǎng)基中添加終濃度為0.69g/L脯氨酸、終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為2mg/L2，4-D、終濃度為100mg/L水解酪蛋白、終濃度為36.4g/L山梨醇、終濃度為36.4g/L甘露醇、終濃度為29mg/L硝酸銀、終濃度為30g/L蔗糖和終濃度為2.5g/L植物凝膠，用水補足體積； 步驟2)中，所述金粉與所述混合載體的質(zhì)量比為20:1-500:1 ； 步驟3)中，所述傳代培養(yǎng)為將所述轟擊后外植體進行傳代培養(yǎng)，得到傳代培養(yǎng)外植體； 所述傳代培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E ； 所述篩選培養(yǎng)為將所述傳代培養(yǎng)外植體進行篩選培養(yǎng)，得到愈傷組織； 所述篩選培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為N6S培養(yǎng)基；所述N6S培養(yǎng)基按照如下方法制備:向N6基本培養(yǎng)基中添加終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為2mg/L2，4-D、終濃度為2mg/L雙丙胺膦、終濃度為6mg/L硝酸銀、終濃度為30g/L蔗糖和終濃度為2.5g/L植物凝膠，用水補足體積； 所述分化培養(yǎng)為將所述愈傷組織進行分化培養(yǎng)，得到帶有幼葉的愈傷組織； 所述分化培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為RMI培養(yǎng)基；所述RMI培養(yǎng)基按照如下方法制備:向MS基本培養(yǎng)基中添加終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為3mg/L Bialaphos、終濃度為60g/L蔗糖和終濃度為3g/L植物凝膠，用水補足體積； 所述生根培養(yǎng)為將所述帶有幼葉的愈傷組織進行生根培養(yǎng)，即得到轉(zhuǎn)基因植物；所述生根培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為RMII培養(yǎng)基；所述RMII培養(yǎng)基按照如下方法制備:向MS基本培養(yǎng)基中添加終濃度為100mg/L肌醇、終濃度為60g/L蔗糖和終濃度為3g/L植物凝膠，用水補足體積。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件為25-28°C、暗培養(yǎng)1-3天；所述預(yù)培養(yǎng)的條件具體為28 °C、暗培養(yǎng)3天； 所述高滲預(yù)培養(yǎng)的條件為25-28°C、暗培養(yǎng)4-10h ;所述高滲預(yù)培養(yǎng)的條件具體為28°C、暗培養(yǎng)8h ； 步驟3)中，所述傳代培養(yǎng)的條件為25-28°C暗培養(yǎng)14-21天；所述傳代培養(yǎng)的條件具體為28°C暗培養(yǎng)14天； 每一次所述篩選培養(yǎng)的條件為25-28°C暗培養(yǎng)2-3周,所述篩選次數(shù)為3-6次；每一次所述篩選培養(yǎng)的條件具體為28°C暗培養(yǎng)3周，所述篩選次數(shù)為3次； 所述分化培養(yǎng)的條件為23-25°C、暗培養(yǎng)1-3周；所述分化培養(yǎng)的條件具體為25°C、暗培養(yǎng)3周； 所述生根培養(yǎng)的條件為22-25°C、16h光/8h暗培養(yǎng)15天、光照強度為4000-80001ux ；所述生根培養(yǎng)的條件具體為25°C、光照強度為40001UX ； 在步驟2)和步驟3)之間還包括如下步驟:將所述轟擊后外植體經(jīng)過再次高滲預(yù)培養(yǎng)；所述再次高滲預(yù)培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為N6S0M培養(yǎng)基，所述再次高滲預(yù)培養(yǎng)的條件為25-28°C暗培養(yǎng)12-24h ;所述再次高滲預(yù)培養(yǎng)的條件具體為28°C再次高滲預(yù)培養(yǎng)20h ；所述目的植物為授粉后12天植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法,其特征在于: 所述目的植物為雙子葉或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米；所述外植體為種子的胚； 所述多個目的基因為篩選標(biāo)記蛋白基因Bar、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因Bt2、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因Sh2、蔗糖合成酶基因Shl和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因GbssIIa共5個基因； 所述多個重組表達載體為 pTRAuxBar、pGtl_Bt2、pISA_Sh2、pBlhor-Shl 和pHMW-GbssIIa共5個重組表達載體； 所述重組表達載體pTRAuxBar為含有Bar基因表達盒的重組載體； 所述重組表達載體pGtl-Bt2為含有Bt2基因表達盒的重組載體； 所述重組表達載體pISA-Sh2為含有Sh2基因表達盒的重組載體； 所述重組表達載體pBlhor-Shl為含有Shl基因表達盒的重組載體； 所述重組表達載體pHMW-GbssIIa為含有GbssIIa基因表達盒的重組載體； 所述Bar基因表達盒具體包括Ubi啟動子、Bar基因和nos終止子； 所述Bt2基因表達盒具體包括Gtl啟動子、Bt2基因和35S終止子； 所述Sh2基因表達盒具體包括ISA啟動子、Sh2基因和35S終止子； 所述Shl基因表達盒具體包括Blhordein啟動子、Shl基因和35S終止子； 所述GbssIIa基因表達盒具體包括HMW-Glutenin啟動子、GbssIIa基因和35S終止子。
10.用于多基因轉(zhuǎn)化的表達盒組或用于多基因轉(zhuǎn)化的重組表達載體組；或所述表達盒組或所述重組表達載體組在提高植物組織總淀粉含量中的應(yīng)用； 或用于多基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基組； 所述表達盒組為如下I)或2): O由權(quán)利要求3或9所述方法中的所述Bt2基因表達盒、所述Sh2基因表達盒、所述Shl基因表達盒和所述GbssIIa基因表達盒組成； 2)由權(quán)利要求 3或9所述方法中的所述Bar基因表達盒、所述Bt2基因表達盒、所述Sh2基因表達盒、所述Shl基因表達盒和所述GbssIIa基因表達盒組成； 所述重組表達載體組為如下a)或b): a)由權(quán)利要求4 或 9 所述方法中的 pGtl-Bt2、pISA-Sh2、pBlhor-Shl 和 pHMW-GbssIIa組成； b)由權(quán)利要求4 或 9 所述方法中的 pTRAuxBar、pGtl_Bt2、pISA_Sh2、pBlhor-Shl 和pHMW-GbssIIa 組成； 所述目的植物具體是雙子葉植物或單子葉植物；所述組織具體為種子的胚乳； 所述用于多基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基組由權(quán)利要求7-9中任一所述方法中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6E、所述N60SM培養(yǎng)基、所述N6S培養(yǎng)基、所述RMI培養(yǎng)基和所述RMII培養(yǎng)基組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用多基因轉(zhuǎn)化培育淀粉含量提高轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將篩選標(biāo)記基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亞基基因、蔗糖合成酶基因和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因共導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物組織的總淀粉含量高于所述目的植物。本發(fā)明的實驗證明，可通過一次基因槍轟擊一次性轉(zhuǎn)化同時轉(zhuǎn)入多個基因，大大縮短轉(zhuǎn)基因材料培育的周期和工作量，具體同時轉(zhuǎn)入4種與淀粉代謝相關(guān)的基因，使得轉(zhuǎn)基因再生植株的總淀粉含量高于野生型植物。
文檔編號C12N9/12GK103173485SQ20131006934
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者龐勁松, 于曉明, 姜麗麗, 李寧, 于倩, 夏瓊, 劉寶 申請人:東北師范大學(xué)