本發明涉及一種生物法利用海蓬子制備石斑魚用免疫增強劑的方法，屬于飼料添加劑領域。
背景技術：
石斑魚屬暖水性底棲生活魚類，主要生活在熱帶、亞熱帶海域的巖礁洞穴及近海大陸架的珊湖礁海區，少數生活于溫帶水域，在我國主要分布于南海和東海南部地區。石斑魚多以群居生活，其種類繁多，我國己記錄的有45種。石斑魚個體較大、肉質鮮美，富含多不飽和脂肪酸，其食用價值和保健價值都很高，被認為是一種優良的海洋經濟魚類。目前，石斑魚在東亞、中東和東南亞等國家深受歡迎，市場需求日益增加，隨著自然資源大幅下降，石斑魚養殖成為保障消費者石斑魚需求的重要手段，逐漸發展為我國南方最重要的海水養殖對象之一。近些年來，由于高密度水產養殖業的迅速發展，導致疾病頻發，消毒劑和抗生素的廣泛使用，不僅引起動物的內源性感染或二重感染，而且導致動物出現抗藥性及免疫功能下降。隨著研究的深入，一種新型的綠色添加劑—免疫增強劑得到廣泛研究。免疫增強劑，主要是作用于非特異性免疫因子來達到防病、抗病目的。雖然其不在魚體內產生免疫記憶，但能夠在短時期內顯著提高機體的抗病能力。因此，日益受到國際養殖業的重視，成為水產保護學領域研究的熱點。
為了滿足不斷增長的水產品的需求，解決因水產養殖規模不斷擴大和生長周期縮減而導致的生理機能紊亂、疾病頻發成為水產養殖的重點問題，也是水產飼料產業發展的關鍵。在此背景下，抗生素類飼料添加劑受到熱捧，被廣泛應用于飼料業中，在一定程度上促進了水產養殖業的發展，但是抗生素帶來的高殘留、高污染和抗藥性等問題愈發的嚴重。目前已經陸續開發出微生態制劑、中草藥免疫增強劑等環保型飼料添加劑，但仍存在作用功效不確定、受外界環境影響較大等弊端，特別是對于海水養殖魚類，中草藥免疫增強劑存在適口性差、水污染嚴重等弊端，因此基于海洋或堿性資源開發新型免疫增強劑將有利于進一步推進石斑魚生態養殖業的發展。
海蓬子又稱海蘆筍、海鹿茸、海蟲草、富貴菜等，屬于莉科植物，海蓬子屬，在鹽生植物分類中，屬于莖肉質化真鹽生植物，多見于沼澤地、鹽湖旁和及海灘。海蓬子其干燥植株含纖維素5～20％，蛋白質9.0％，富含人體必需的8種氨基酸、微量元素和維生素，其中胡蘿卜素含量超過普通蔬菜的40倍，還含有天然的植物保健鹽和天然的植物堿(微角皂苷)，具有降低膽固醇、降壓等功效。海蓬子的種植對改善我國鹽堿環境具有重要應用價值，但目前海蓬子的綜合開發利用程度較低，制約著海蓬子加工產業經濟效益，也直接影響了海蓬子的種植推廣，因此，如果將海蓬子進行高值化綜合開發利用，將對環境和經濟做出重要貢獻。
技術實現要素：
本發明的目的在于根據現有技術中存在的上述不足，基于循環經濟的發展理念，采用現代生物技術開發利用陸生鹽堿植物資源海蓬子制備石斑魚用免疫增強劑，可顯著提高石斑魚的機體免疫力、改善動物生長性能，降低飼料系數，減少抗生素大量使用造成的養殖業污染，且原料來源廣，價格低廉，是一種綠色、環保、高效的飼料添加劑，研制開發一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑。
本發明上述目的是通過以下技術方案予以實現的：
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑，其特征在于由以下質量比的原料制成：海蓬子粉30～50份、山藥粉15～20份、杜仲8～12份、絞股藍8～12份、神曲6～8份、金銀花3～5份、川芎6～8份、甘草6～8份、白花蛇舌草3～5份、穿心蓮5～7份、藍莓3～5份。
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑，其特征在于所述原料組成優選為：海蓬子粉40份、山藥粉18份、杜仲10份、絞股藍10份、神曲7份、金銀花4份、川芎7份、甘草7份、白花蛇舌草4份、穿心蓮6份、藍莓4份。
本發明提供一種生物法利用海蓬子制備石斑魚免疫增強劑的工藝，所述海蓬子粉預處理工藝如下：
(1)粉碎浸泡：將去除雜質的海蓬子莖桿粉碎，過100目篩，加入海蓬子質量比5％的海藻，然后加入2倍質量比純凈水浸泡3～5h；
(2)蒸煮：將浸泡后的海蓬子懸浮液蒸煮1～2h，然后在密封條件下降溫至室溫；
(3)分離：將蒸煮液進行固液分離，得海蓬子莖桿粉，分離后的水進入步驟(1)進行循環利用；
(4)自然腐熟：控制海蓬子莖桿粉含水量40～50％，控溫30～50℃，自然腐熟30～50d；
(5)二步發酵酶解：自然腐熟結束后，加入海蓬子質量比2％的纖維素酶和1％的低聚木糖酶，并接種海蓬子質量比2～3％的耐鹽嗜堿芽孢桿菌，在28～35℃條件下發酵3～5d，12小時攪拌一次；發酵結束后即得海蓬子發酵粉。
上述海藻是滸苔、海帶、馬尾藻、鼠尾藻中的一種或幾種的混合物。
本發明提供一種生物法利用海蓬子制備石斑魚免疫增強劑的工藝，其特征在于包括如下步驟：
(1)混合粉碎：將各原料按比例混合，然后粉碎過100目篩；加入原料質量3倍的純凈水；
(2)酶解：加入中草藥原料質量比3～5％的纖維素酶、2～3％的低聚木糖酶，在40～60℃條件下控溫酶解4～8h，每隔0.5h攪拌一次；
(3)過濾分離：過濾酶解液，得到酶解液和酶解殘渣；
(4)超聲波輔助浸提：向酶解殘渣中加入3～5倍的純凈水，在超聲波輔助作用下，100℃條件下回流浸提20～30min，超聲功率400w，頻率25kHz；超聲功率400w，頻率25kHz；
(5)過濾分離：過濾浸提液，得到浸提液和浸提殘渣；
(6)發酵液制備：向步驟(5)中的浸提殘渣中加入5倍質量比的純凈水，并加入殘渣質量比3.0～5.0％葡萄糖、2.0～3.0％酵母膏、0.3～0.5％磷酸二氫鉀、0.02％MgSO4、0.01％CaCl2，pH調至7.0～7.2；
(7)好氧發酵：選用液體發酵罐，裝液量體積比為60～70％，接種地衣芽孢桿菌和產朊假絲酵母菌，接種量分別為2～4％、1～2％，控制發酵溫度28～37℃，轉速150～300rpm；在此發酵條件下發酵12～24h；
(8)厭氧發酵：好氧發酵結束后，接種乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌，接種量均為2～4％，發酵溫度28～37℃，控溫厭氧發酵12～24h；
(9)合并：將步驟(3)中的酶解液、步驟(5)中的浸提液和步驟(8)中的發酵液合并；
(10)低溫濃縮：在低溫條件下將步驟(9)合并后的增強劑溶液進行濃縮；
(11)吸附干燥：濃縮后用1～1.5倍質量比的麩皮吸附，在40～60℃鼓風干燥機中干燥，水分控制在8～10％；
(12)粉碎：將干燥后的產品用粉碎機60目過篩粉碎，即得石斑魚用免疫增強劑。
本發明提供一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑，具有預防、保健、治療和調節免疫等多種功效，是替代抗生素藥物的理想、綠色、環保、安全、新型飼料添加劑。該發明免疫增強劑一是可以高效調理石斑魚腸道健康，標本兼治，固本培元，保持腸道微生態平衡和最佳免疫狀態，提高營養物質的消化吸收率，提高動物機體免疫力；二是可抑制和阻止病原大腸菌、梭狀芽孢桿菌、沙門氏菌等有害菌的發生，增加腸道益生菌，維持健康的腸道菌群；三是增強免疫作用，通過刺激腸道內免疫系細胞，增加局部抗體的形成，增加巨噬細胞活性；四是免疫增強劑進入腸內抵制有害菌，降低惡臭及有害成分形成，使排出的糞便消除惡臭，在保護養殖環境的同時提高石斑魚肉質品質。
本發明提供一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑，所述石斑魚用免疫增強劑產品在水產飼料全價料中使用的質量比例為0.1～0.5％：或所述的飼料添加劑在預混料、濃縮料以全價料中所需的比例添加使用。
本發明提供一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑，其優勢在于：一是按照中草藥君臣佐使的配伍原則，以陸生鹽堿植物海蓬子為君藥，輔以山藥粉、杜仲、絞股藍為臣藥，以神曲、金銀花、川芎、白花蛇舌草、穿心蓮、藍莓為佐藥，以甘草為使藥，共行相輔相成之功效；尤其是海蓬子富含天然的植物保健鹽和天然的植物堿(微角皂苷)，對海水養殖魚類較傳統中草藥保健功效更佳；二是免疫增強劑制備過程中采用了“酶解提取+超聲波輔助浸提+多菌種好氧厭氧發酵二步發酵”的生產工藝，與現有的中草藥飼料添加劑產品相比作用效果更顯著；三是免疫增強劑具有海蓬子、中草藥和益生菌等的多重優點，可以高效調理石斑魚腸道健康，標本兼治，固本培元，保持腸道微生態平衡和最佳免疫狀態，提高營養物質的消化吸收率，提高動物機體免疫力，提高養殖收益，降低養殖風險；四是該產品可替代抗生素使用，對石斑魚無不良影響，使用安全，不存在藥物殘留和耐藥性等問題，有著廣闊的市場前景。
具體實施方式
實施例1：
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑，具體制備步驟如下：
(1)粉碎浸泡：將去除雜質的海蓬子莖桿粉碎，過100目篩，加入海蓬子質量比5％的滸苔，然后加入2倍質量比純凈水浸泡4h；
(2)蒸煮：將浸泡后的海蓬子懸浮液蒸煮1.5h，然后在密封條件下降溫至室溫；
(3)分離：將蒸煮液進行固液分離，得海蓬子莖桿粉，分離后的水進入步驟(1)進行循環利用；
(4)自然腐熟：控制海蓬子莖桿粉含水量40～50％，控溫30～50℃，自然腐熟40d；
(5)二步發酵酶解：自然腐熟結束后，加入海蓬子質量比2％的纖維素酶和1％的低聚木糖酶，并接種海蓬子質量比2.5％的耐鹽嗜堿芽孢桿菌，在28～35℃條件下發酵4d，12小時攪拌一次；發酵結束后即得海蓬子發酵粉；
(6)混合粉碎：將各原料按海海蓬子粉40份、山藥粉18份、杜仲10份、絞股藍10份、神曲7份、金銀花4份、川芎7份、甘草7份、白花蛇舌草4份、穿心蓮6份、藍莓4份比例混合，然后粉碎過100目篩；加入原料質量3倍的純凈水；
(7)酶解：加入中草藥原料質量比4％的纖維素酶、2.5％的低聚木糖酶，在40～60℃條件下控溫酶解6h，每隔0.5h攪拌一次；
(8)過濾分離：過濾酶解液，得到酶解液和酶解殘渣；
(9)超聲波輔助浸提：向酶解殘渣中加入4倍的純凈水，在超聲波輔助作用下，100℃條件下回流浸提25min，超聲功率400w，頻率25kHz；超聲功率400w，頻率25kHz；
(10)過濾分離：過濾浸提液，得到浸提液和浸提殘渣；
(11)發酵液制備：向步驟(10)中的浸提殘渣中加入5倍質量比的純凈水，并加入殘渣質量比4.0％葡萄糖、2.5％酵母膏、0.4％磷酸二氫鉀、0.02％MgSO4、0.01％CaCl2，pH調至7.0～7.2；
(12)好氧發酵：選用液體發酵罐，裝液量體積比為60～70％，接種地衣芽孢桿菌和產朊假絲酵母菌，接種量分別為3％、1.5％，控制發酵溫度28～37℃，轉速150～300rpm；在此發酵條件下發酵18h；
(13)厭氧發酵：好氧發酵結束后，接種乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌，接種量均為3％，發酵溫度28～37℃，控溫厭氧發酵18h；
(14)合并：將步驟(8)中的酶解液、步驟(10)中的浸提液和步驟(13)中的發酵液合并；
(15)低溫濃縮：在低溫條件下將步驟(14)合并后的增強劑溶液進行濃縮；
(16)吸附干燥：濃縮后用1～1.5倍質量比的麩皮吸附，在40～60℃鼓風干燥機中干燥，水分控制在8～10％；
(17)粉碎：將干燥后的產品用粉碎機60目過篩粉碎，即得石斑魚用免疫增強劑。
實施例2：
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑，具體制備步驟如下：
(1)粉碎浸泡：將去除雜質的海蓬子莖桿粉碎，過100目篩，加入海蓬子質量比5％的海帶，然后加入2倍質量比純凈水浸泡5h；
(2)蒸煮：將浸泡后的海蓬子懸浮液蒸煮2h，然后在密封條件下降溫至室溫；
(3)分離：將蒸煮液進行固液分離，得海蓬子莖桿粉，分離后的水進入步驟(1)進行循環利用；
(4)自然腐熟：控制海蓬子莖桿粉含水量40～50％，控溫30～50℃，自然腐熟30d；
(5)二步發酵酶解：自然腐熟結束后，加入海蓬子質量比2％的纖維素酶和1％的低聚木糖酶，并接種海蓬子質量比3％的耐鹽嗜堿芽孢桿菌，在28～35℃條件下發酵5d，12小時攪拌一次；發酵結束后即得海蓬子發酵粉；
(6)混合粉碎：將各原料按海蓬子粉50份、山藥粉15份、杜仲12份、絞股藍8份、神曲8份、金銀花3份、川芎8份、甘草6份、白花蛇舌草5份、穿心蓮5份、藍莓5份比例混合，然后粉碎過100目篩；加入原料質量3倍的純凈水；
(7)酶解：加入中草藥原料質量比5％的纖維素酶、3％的低聚木糖酶，在40～60℃條件下控溫酶解4h，每隔0.5h攪拌一次；
(8)過濾分離：過濾酶解液，得到酶解液和酶解殘渣；
(9)超聲波輔助浸提：向酶解殘渣中加入5倍的純凈水，在超聲波輔助作用下，100℃條件下回流浸提20min，超聲功率400w，頻率25kHz；超聲功率400w，頻率25kHz；
(10)過濾分離：過濾浸提液，得到浸提液和浸提殘渣；
(11)發酵液制備：向步驟(10)中的浸提殘渣中加入5倍質量比的純凈水，并加入殘渣質量比5.0％葡萄糖、2.0％酵母膏、0.5％磷酸二氫鉀、0.02％MgSO4、0.01％CaCl2，pH調至7.0～7.2；
(12)好氧發酵：選用液體發酵罐，裝液量體積比為60～70％，接種地衣芽孢桿菌和產朊假絲酵母菌，接種量分別為4％、2％，控制發酵溫度28～37℃，轉速150～300rpm；在此發酵條件下發酵12h；
(13)厭氧發酵：好氧發酵結束后，接種乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌，接種量均為4％，發酵溫度28～37℃，控溫厭氧發酵12h；
(14)合并：將步驟(8)中的酶解液、步驟(10)中的浸提液和步驟(13)中的發酵液合并；
(15)低溫濃縮：在低溫條件下將步驟(14)合并后的增強劑溶液進行濃縮；
(16)吸附干燥：濃縮后用1～1.5倍質量比的麩皮吸附，在40～60℃鼓風干燥機中干燥，水分控制在8～10％；
(17)粉碎：將干燥后的產品用粉碎機60目過篩粉碎，即得石斑魚用免疫增強劑。
實施例3：
一種生物法利用海蓬子制備的石斑魚用免疫增強劑，具體制備步驟如下：
(1)粉碎浸泡：將去除雜質的海蓬子莖桿粉碎，過100目篩，加入海蓬子質量比5％的馬尾藻，然后加入2倍質量比純凈水浸泡3h；
(2)蒸煮：將浸泡后的海蓬子懸浮液蒸煮1h，然后在密封條件下降溫至室溫；
(3)分離：將蒸煮液進行固液分離，得海蓬子莖桿粉，分離后的水進入步驟(1)進行循環利用；
(4)自然腐熟：控制海蓬子莖桿粉含水量40～50％，控溫30～50℃，自然腐熟50d；
(5)二步發酵酶解：自然腐熟結束后，加入海蓬子質量比2％的纖維素酶和1％的低聚木糖酶，并接種海蓬子質量比2％的耐鹽嗜堿芽孢桿菌，在28～35℃條件下發酵5d，12小時攪拌一次；發酵結束后即得海蓬子發酵粉；
(6)混合粉碎：將各原料按海蓬子粉30份、山藥粉20份、杜仲8份、絞股藍12份、神曲6份、金銀花5份、川芎6份、甘草8份、白花蛇舌草3份、穿心蓮7份、藍莓3份比例混合，然后粉碎過100目篩；加入原料質量3倍的純凈水；
(7)酶解：加入中草藥原料質量比3％的纖維素酶、2％的低聚木糖酶，在40～60℃條件下控溫酶解8h，每隔0.5h攪拌一次；
(8)過濾分離：過濾酶解液，得到酶解液和酶解殘渣；
(9)超聲波輔助浸提：向酶解殘渣中加入3倍的純凈水，在超聲波輔助作用下，100℃條件下回流浸提30min，超聲功率400w，頻率25kHz；超聲功率400w，頻率25kHz；
(10)過濾分離：過濾浸提液，得到浸提液和浸提殘渣；
(11)發酵液制備：向步驟(10)中的浸提殘渣中加入5倍質量比的純凈水，并加入殘渣質量比3.0％葡萄糖、3.0％酵母膏、0.3％磷酸二氫鉀、0.02％MgSO4、0.01％CaCl2，pH調至7.0～7.2；
(12)好氧發酵：選用液體發酵罐，裝液量體積比為60～70％，接種地衣芽孢桿菌和產朊假絲酵母菌，接種量分別為2％、1％，控制發酵溫度28～37℃，轉速150～300rpm；在此發酵條件下發酵24h；
(13)厭氧發酵：好氧發酵結束后，接種乳酸桿菌和兩歧雙歧桿菌，接種量均為2％，發酵溫度28～37℃，控溫厭氧發酵24h；
(14)合并：將步驟(8)中的酶解液、步驟(10)中的浸提液和步驟(13)中的發酵液合并；
(15)低溫濃縮：在低溫條件下將步驟(14)合并后的增強劑溶液進行濃縮；
(16)吸附干燥：濃縮后用1～1.5倍質量比的麩皮吸附，在40～60℃鼓風干燥機中干燥，水分控制在8～10％；
(17)粉碎：將干燥后的產品用粉碎機60目過篩粉碎，即得石斑魚用免疫增強劑。
以下以驗證試驗說明本申請取得的技術效果：
表1試驗分組表
表2試驗結果
上述試驗結果表明，本申請免疫增強劑取得了顯著的技術效果，較現有市售中草藥免疫增強劑差異顯著(P<0.01),且試驗結果表明改變原料組成會顯著降低產品效果(P<0.01)。
以上實施例僅用于說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對被發明進行了詳細的說明，但對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而對這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。