本發明涉及一種采用微生物發酵法制備S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺的方法，特別是一種單水相系統發酵轉化2,2-二甲基環丙烷甲氰制備S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺，英文名稱：(S)-(+)-2,2-Dimethylcyclopropanecarboxamide，是合成西司他丁的中間體，在西司他丁的合成中有著重要的作用。現有技術中，(S)-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺的合成采取的生產工藝主要是：甘氨酸乙酯鹽酸鹽經重氮化反應制得重氮乙酸乙酯，與異丁烯在自制的手性催化劑—（R,R）-(+)-2,2＇-亞異丙基雙(4-叔丁基-2-噁唑啉)與三氟甲磺酸亞銅的絡合物催化下進行不對稱環丙烷化反應，制得(S)-2,2-二甲基環丙烷甲酸乙酯，堿性條件下水解，再與氯化亞砜反應得到酰氯后氨解制得(S)-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺。該制備方法存在的缺陷是制備成本高、生產周期長、污染環境。為此，尋找一種操作簡單、制備周期短，環境友好的制備(S)-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺的方法，成為現階段該領域研究的熱點。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種采用微生物發酵法制備S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺的方法，以解決現有的化學方法制備S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺中存在的產物收率低且環境污染嚴重的問題。
本發明解決其技術問題采取的技術方案是這樣的。一種采用微生物發酵法制備S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺的方法，包括以下步驟：
（1）菌種繁殖
將赤紅球菌菌種接入種子培養基中培養，菌種繁殖的條件為：將濃度109-1010個/ml的赤紅球菌菌種以0.1%-0.2%的接種量接入裝有種子培養基的培養罐中培養；
（2）發酵培養
待步驟（1）中的菌種培養基OD600為20-30，培養時間36-44小時，
pH5.5-6.0時，以5%-10%的接種量將其接入裝有發酵培養基的發酵罐中培養，培養溫度為25-30℃；
（3）細胞分離
將步驟（2）得到的發酵液進行培養基分離，除去培養基，得到菌體；
（4）轉化原料
將菌體用30-50倍發酵液體積的純水混勻后逐滴加入2,2-二甲基環丙烷甲氰，控制反應溫度25℃-28℃，滴加中維持2,2-二甲基環丙烷甲氰濃度小于10g/L，轉化結束后檢測2,2-二甲基環丙烷甲氰濃度低于0.2g/L，則反應結束，得到S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺和菌體的混合液；
（5）成品提取
用至少2倍量的氯仿或丙酮對上述混合液依次進行萃取、過濾、脫色、蒸餾得到粗品，粗品用至少4倍量的二氯甲烷或氯仿溶解后依次進行萃取、脫色、過濾、蒸餾，然后加入至少2倍量己烷或者甲苯后進行蒸餾結晶得到精制品。
優選的，步驟（1），種子培養基中各組分濃度：葡萄糖 10-15g/L、K2HPO4 0.3-0.6g/L、MgSO4·7H2O 0.3-0.6g/L、磷酸二氫鉀 0.3-0.6g/L、尿素5.0-10g/L、味精 0.05-0.2g/L，酵母膏5-8g/L、種子培養基的pH為6.0-7.0。
優選的，步驟（2），發酵培養基中各組分濃度：葡萄糖 30-40g/L， K2HPO410-15g/L，MgSO4·7H2O 15-20g/L，KH2PO410-15g/L，尿素10-15g/L，味精1.0-3.0g/L，酵母膏5-10g/L，發酵培養基的pH為6.0-7.0。
優選的，步驟（3），細胞分離培養基采用超濾膜，即中空玻璃纖維膜分離，這樣可以連續操作除去培養基，操作時間短，生產效率高，并且保證細胞分離過程中不會被破壞。
本發明取得的有益效果如下：
提高了2,2-二甲基環丙烷甲腈的利用率，發酵底物轉化率達到35%以上。
發酵中采用單水相體系且提取操作中溶媒種類少，用量小，環境污染小，成本低，降低了成品提取的難度，操作簡單，環境友好。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明。需要指出的是，所給出的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例1
制備S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺及煙酰胺的方法，包括如下步驟：
（1）菌種繁殖
將濃度107個/ml的恥垢分枝桿菌菌種以2%的接種量接入裝有種子培養基的培養罐中培養，種子培養基中包括如下濃度的組分：葡萄糖 12g/L、磷酸氫二鉀 0.5g/L、硫酸鎂·7H2O 0.5g/L、磷酸二氫鉀 0.5g/L、尿素8g/L、味精 0.1g/L，酵母膏6g/L、種子培養基的pH為6.0-7.0。
（2）發酵培養
待步驟（1）中的菌種培養基OD600為30時，以10%的接種量將其接入裝有發酵培養基的發酵罐中進行發酵培養；
發酵培養的條件為：溫度25℃，發酵初始pH 6.0，溶氧量40%，培養轉速200rpm，培養周期44h。
（3）細胞分離
采用膜過濾，大約用水量為發酵液量體積的4-5倍體積將培養基除去，得到細胞。
（4）底物轉化
將步驟（3）中得到的菌體與30-50倍體積的純水混勻，而后逐滴加入2,2-二甲基環丙烷甲氰，保證底物濃度低于10 g/L，滴加溫度在25-28℃，滴加完成后檢測2,2-二甲基環丙烷甲氰濃度低于0.1g/L，則反應結束，得到S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺和菌體的混合液。
（5）成品提取
用4-6倍量的氯仿將所述混合液依次進行萃取、脫色、過濾、蒸餾得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次進行脫色、過濾、蒸餾，然后加入4倍量的甲苯后進行蒸餾結晶得到精制品。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為39.0%，最終效價15.6g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量 99.40%。
實施例2
將實施例1中的滴加溫度改為在30℃，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為36.3%，最終效價14.5g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例3
將實施例1發酵罐的接種量改為15%，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為39.3%，最終效價15.7g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例4
將實施例1中將轉化底物的濃度改為20 g/L，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為30.6%，最終效價12.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例5
將實施例1中發酵培養條件中溶氧量更改為20%，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為32.6%，最終效價13g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例6
將實施例1中發酵培養條件中溶氧量更改為30%，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為36.6%，最終效價14.6g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例7
將實施例1中發酵培養條件中溶氧量更改為40%，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為40.6%，最終效價16.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例8
將實施例1中發酵培養條件中pH值更改為5.0-5.5，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為33.6%，最終效價13.4g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例9
將實施例1中發酵培養條件中pH值更改為5.5-6.0，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為40.6%，最終效價16.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例10
將實施例1中發酵培養條件中pH值更改為6.0-6.5，其余操作與實施例1相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為39.6%，最終效價15.8g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例11
將實施例1中發酵培養條件中pH值更改為7.0-8.0，其余操作與實施例2相同。
測試結果：2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為30.6%，最終效價12.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
綜合分析實施例1、實施例5至實施例11，可見發酵培養的合適pH為弱酸性或中性環境；最合適的溶氧控制為30%-40%；最合適的發酵溫度為27-29℃；最合適的發酵接種量10%；轉化底物濃度控制低于10g/L；轉化溫度控制在24-28℃。
實施例12
單水相系統發酵轉化2,2-二甲基環丙烷甲氰，制備S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺的方法，包括如下步驟：
（1）菌種繁殖
將濃度1011個/ml的赤紅球菌菌種以2%的接種量接入裝有種子培養基的培養罐中培養，種子培養基中包括如下濃度的組分：葡萄糖12g/L，酵母膏6.0g/L,味精0.1g/L,尿素0.8g/L,硫酸鎂0.4g/L,磷酸氫二鉀0.4g/L,磷酸二氫鉀0.4g/L, PH值為6.5～7.0；
種子罐培養的條件為：溫度28±0.5℃，發酵初始pH 為7.0，溶氧量40%，培養轉速250rpm，培養周期36h；
（2）發酵培養
待步驟（1）中的菌種培養基OD600為30時，以10%的接種量將其接入裝有發酵培養基的發酵罐中發酵培養；
發酵培養基中包括如下濃度的組分：葡萄糖35g/L，酵母膏9g/L,味精2.6g/L,尿素13g/L,硫酸鎂2g/L,磷酸氫二鉀1.5g/L,磷酸二氫鉀1.5g/L,誘導劑3ppm， PH值為6.5～7.0。
發酵培養的條件為：溫度28℃，發酵初始pH 為7.0，溶氧量30%，培養轉速180rpm，培養周期100h；
（3）細胞分離
將步驟（2）得到的發酵液分理處細胞，具體操作為采用連續膜過濾系統，用4-5倍體積的水洗，除去培養基，得到細胞。
（4）底物轉化
將步驟（3）得到的細胞，與30-50倍體積的純水混勻，而后開始滴加轉化的底物。逐滴加入2,2-二甲基環丙烷甲氰，保證原料濃度低于10 g/L，滴加溫度在25-28℃，滴加完成后，檢測2,2-二甲基環丙烷甲氰濃度低于0.1g/L，反應結束，得到混合溶液。
（5）成品提取
用4-6倍量的氯仿將上述混合溶液依次進行萃取、脫色、過濾、蒸餾得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次進行脫色、過濾、蒸餾，然后加入4倍量的甲苯后進行蒸餾結晶得到精制品。
測試結果： 2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為33.1%，最終效價13.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
實施例13
單水相系統發酵轉化底物制備S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺及煙酰胺的方法，包括如下步驟：
（1）菌種繁殖
將濃度1010個/ml的赤紅球菌菌種以3%的接種量接入裝有種子培養基的培養罐中培養，種子培養基中包括如下濃度的組分：葡萄糖12g/L，酵母膏7.0g/L,味精0.1g/L,尿素0.8g/L,硫酸鎂0.4g/L,磷酸氫二鉀0.4g/L,磷酸二氫鉀0.4g/L, PH值為6.5～7.0；
種子罐培養的條件為：溫度28±0.5℃，發酵初始pH 為6.5，溶氧量45%，培養轉速250rpm，培養周期36h；
（2）發酵培養
待步驟（1）中的菌種培養基OD600為30時，以10%的接種量將其接入裝有發酵培養基的發酵罐中發酵培養；
發酵培養基中包括如下濃度的組分：葡萄糖35g/L，酵母膏9g/L,味精2.6g/L,尿素13g/L,硫酸鎂2g/L,磷酸氫二鉀1.5g/L,磷酸二氫鉀1.5g/L,誘導劑3ppm， PH值為6.5～7.0。
發酵培養的條件為：溫度28℃，發酵初始pH 為7.0，溶氧量30%，培養轉速180rpm，培養周期100h；
（3）細胞分離
將步驟（2）得到的發酵液分理處細胞，具體操作為采用連續膜過濾系統，用4-5倍體積的水洗，除去培養基，得到細胞。
（4）底物轉化
將步驟（3）得到的細胞，與30-50倍體積的純水混勻，而后開始滴加轉化的底物。逐滴加入2,2-二甲基環丙烷甲氰，保證底物濃度低于10 g/L，滴加溫度在25℃-28℃，滴加完成后，檢測2,2-二甲基環丙烷甲氰濃度低于0.1g/L,則反應完全，得到混合溶液。
（5）提取
用4-6倍量的氯仿將所述濾餅溶解后依次進行萃取、脫色、過濾、蒸餾得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次進行脫色、過濾、蒸餾，然后加入4倍量的甲苯后進行蒸餾結晶得到精制品。
測試結果： 2,2-二甲基環丙烷甲氰的轉化率為34.2%，最終效價13.7g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環丙烷甲酰胺含量大于99.0%。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。