專利名稱：一種牛大力種子直接誘導叢生芽并快速繁育種苗的方法
技術領域：
本發明屬農業生物技術領域，具體是一種牛大力種子直接誘導叢生芽并快速繁育種苗的方法。
背景技術：
牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(Millettia speciosa Champ·),又名大力薯、山蓮藕，始載于《生草藥性備要》，是《廣西中藥材標準》(1990年版)收載的地方藥材。牛大力以根入藥，味甘，平。歸肺、腎經。具有補虛潤肺、強筋活絡的功效，臨床證明其對腰肌勞損、風濕性關節炎、肺虛咳嗽、肺結核、慢性支氣管炎、慢性肝炎等慢性疾病有較好的療效。壯族民間常用于腰腿痛，發旺(風濕骨痛)，肺結核，慢性肝炎，慢性胃炎的治療。現代研究發現，牛大力含有多糖、生物堿、香豆素和多種微量元素等成分，其中牛大力多糖是其主要活性成分，具有調節免疫系統、抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性，尤其是抗腫瘤方面療效明確，目前臨床研究顯示其對鼻咽癌、卵巢癌、肺癌、以及結腸癌具有良好的治療效果。同時牛大力多糖也是理想的免疫增強劑；生物堿和香豆素具有保肝、祛痰、鎮咳、鎮痛、鎮靜、解痙的作用，且對正常細胞均沒有毒副作用，在開發抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等藥物方面有著特殊的優勢，已成為提取企業競相開發的新目標，市場需求量巨大。自20世紀70年代起，作為主要原料被制藥企業加工成壯腰健腎丸、強力健身膠囊、桂龍藥膏、活絡止痛丸、強力追風透骨丸、舒筋健腰丸、益智康腦丸、抗風濕液等中成藥，在全國廣泛應用。近年來，牛大力又成為提取企業競相開發的新目標，提取多糖、高麗槐素等成分。隨著牛大力需求量的不斷增加，野生資源已經枯竭，原材料嚴重供不應求。為了解決供需矛盾，人們嘗試采用人工栽培的方法擴大藥源，目前已發現有一些成功的研究報道。在種子萌發方面，經統計發現國內外有2篇報道(截止2012年11月22日)，黃秋銀等分別進行不同種子處理在同 一光照培養箱中的發芽試驗和不同基質種子發芽試驗，研究結果表明以清水浸種處理后種子發芽效果最佳，平均發芽率達61. 25% ;以河沙處理的種子發芽率最高，且發芽所需要的時問也較短。姚紹嫦等通過測定牛大力種子形態、千粒重和含水量，研究在不同浸種時間、不同光照、不同溫度條件下的發芽率，并進一步比較它們之間的相關性，同時比較在不同發芽床培養下的發芽率、發芽指數、始發芽粒數和發芽天數的差異，結果表明在雙層紙床上，浸種24h，25°C，光照條件，最適宜牛大力種子的萌發。在組織培養方面，經統計發現國內外有5篇報道(截止2012年11月22日)，其中4篇以莖段為外植體，I篇以果莢(種子)為外植體。經比較，以莖段為外植體的污染率比以種子為外植體的高，且成苗經過愈傷組織，組培周期長，容易引起變異。王祝年等以成熟果莢(種子)為外植體進行組織培養快速繁殖牛大力，種子萌發培養基為1/2MS，芽的增殖與繼代培養基為MS+6. BA2. Omg/L(單位下同)+ΝΑΑ0. 5，生根培養基為1/2MS+IBA1. 0，將種子萌發的無菌苗切段接種到增殖培養基上，經過愈傷組織形成不定芽(容易引起變異)，40d平均增殖系數達5. O。生根培養20d，生根率達80%。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足提供一種牛大力種子直接誘導叢生芽并快速繁育種苗的方法。本發明解決上述技術問題的技術方案如下一種牛大力種子直接誘導叢生芽并快速繁育種苗的方法，牛大力種子為外植體直接誘導叢生芽，繁育種苗的方法包括外植體滅菌、初代誘導、繼代增殖、生根、移栽過程1.外植體滅菌過程取牛大力成熟黑色種子，用體積百分濃度為O. 05%洗潔精溶液浸泡lOmin，再經流水沖洗15min。在超凈工作臺上用O. 1% HgCl2溶液滅菌16min，然后用無菌水搖蕩洗滌4次，再用無菌吸水紙將水分吸干后接種至初代誘導培養基。2.初代誘導過程將步驟(I)滅菌好的種子接種至初代誘導培養基MS+3. Omg5mg -L^1KT+O. 2mg -L^NAA+SOOmg -L^PVP上進行種子萌發及叢生芽誘導培養；此過程的培養時間<25d，誘導率可達100%。所述培養基附加30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，pH6. O,配制分裝后，于121°C滅菌20分鐘。培養條件為(26±2)°C、光照強度2000Lx、光照時間10h/d ;
3.繼代增殖過程將步驟(2)初代誘導培養獲得的叢生芽切下含2-3個芽的芽叢轉接到繼代培養基MS+2. Omg · L_16-BA+0. 5mg · L_1KT+0. 2mg · L_1TDZ+0. 2mg · L-1NAA 中進行增殖培養，周期為20-25d，增殖倍數為 9. 68/20d。所述培養基附加30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，pH6. O,配制分裝后，于121°C滅菌20分鐘。培養條件為(26±2)°C、光照強度2000Lx、光照時間10h/d。4.生根過程當繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉接到生根培養基1/2MS+2. 5mg · L^IBA+l. 5mg · T1IAA中誘導生根，培養7d開始長根原基，25d后得到瓶苗，可以開蓋煉苗。所述培養基附加30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，pH6. O,配制分裝后，于121°C滅菌20分鐘。培養條件為(26±2)°C、光照強度2000Lx、光照時間10h/d ;5.移栽過程把步驟(4)生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗4d，然后用鑷子將瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培養基，移栽到細河沙上，移栽后IOd內保持相對濕度95%左右，溫度白天控制在23-25°C，夜間15-181，沒有直射光的條件，移栽成活率84.07(%。移栽15d后即可上杯種植，30d后可進行大田栽培。本發明的優點本發明提供的整套方法操作簡便，生產成本低，增殖速度快，生根移栽成活率高，便于大規模工業化生產應用，可大量、快速、持續獲得高質量的牛大力試管苗，實用性強。該項技術由牛大力種子直接誘導出叢生芽，在初代誘導培養基的作用下，種子萌發和叢生芽誘導同時進行，與已有文獻報道的先誘導種子無菌萌發再切取莖段誘導叢生芽的方法不同，大大縮短了組培的周期，與已有研究報道相比叢生芽獲得更高的增殖倍數，且叢生芽誘導不經過愈傷組織階段，大大減少了變異的可能性，有利于保持種苗的優良性狀。
具體實施例方式下面結合具體實施方法對本發明作進一步描述。一種牛大力種子直接誘導叢生芽并快速繁育種苗的實施方法1.外植體選擇與滅菌過程取牛大力成熟黑色種子，用體積百分濃度為O. 05%洗潔精溶液浸泡lOmin，再經流水沖洗15min。在超凈工作臺上用O.1 % HgCl2溶液滅菌16min，然后用無菌水搖蕩洗滌4次，再用無菌吸水紙將水分吸干后接種至初代誘導培養基。此滅菌方法的污染率為13. 33%，成活率為 100. 00%。若果莢未開裂，取成熟的黑色果莢，用O. 05%洗潔精溶液浸泡lOmin，浸泡過程中用刷子刷洗表面以去除表面柔毛與污垢，再經流水沖洗15min。在超凈工作臺上用O. 1%HgCl2溶液滅菌20min，然后用無菌水搖蕩洗滌3次，再用無菌吸水紙將水分吸干后縱切剖開果莢，取出種子接種至初代誘導培養基。此滅菌方法無污染，成活率為100.00%。2.初代誘導過程將滅菌 好的種子接種至初代誘導培養基MS+3. Omg Γ'θ-ΒΑ+Ι. 5mg Γ'ΚΤ+Ο. 2mg ·Γ'NAA+SOOmg ^r1PVP上進行種子萌發及叢生芽誘導培養，在培養基中附加30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，pH6. 0，配制分裝后，于121°C滅菌20分鐘。培養條件為(26±2) °C、光照強度2000Lx、光照時間10h/d，誘導率100%。培養25d，種子萌發并且同時在下胚軸處誘導出具有4-5個小芽的叢生芽，叢生芽誘導率100%。在該配方的培養基作用下，種子萌發和叢生芽誘導同時進行，與已有文獻報道的先誘導種子無菌萌發再切取莖段誘導叢生芽的方法不同。本方法大大縮短了叢生芽誘導所需的時間，芽生長速度快，無玻璃化現象，且芽不經過愈傷組織過程，大大減少了變異的可能性。此外，培養基中添加了 PVP還解決了種皮褐化的問題，縮短了種子萌發所需的時間和提高了萌發率，添加PVP后種子露白僅需7d左右。3.繼代增殖過程將初代誘導培養獲得的叢生芽切下含2-3個芽的芽叢轉接到繼代培養基MS+2. Omg Ll-BA+O. 5mg LlT+O. 2mg L^TDZ+O. 2mg .L4NM 中進行增殖培養，在培養基中附加 30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，pH6.0，配制分裝后，于121°C滅菌20分鐘。培養條件為(26±2)°C、光照強度2000LX、光照時間10h/d，增殖倍數為9. 68/20d，叢生芽生長快，無玻璃化現象。4.生根過程當繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉接到生根培養基1/2MS+2. 5mg .Ι^ΙΒΑ+Ι. 5mg · T1IAA中誘導生根，培養7d開始長根原基，25d后可以開蓋煉苗。生根率90%以上。5.煉苗移栽過程把生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗4d，然后用鑷子將瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培養基，移栽到細河沙上，移栽后IOd內保持相對濕度95%左右，溫度白天控制在23-25°C，夜間15-181，沒有直射光的條件，移栽成活率84.07%。移栽15d后即可上杯種植，30d后可進行大田栽培。
權利要求
1.一種牛大力種子直接誘導叢生芽并快速繁育種苗的方法，其特征在于，牛大力種子為外植體直接誘導叢生芽，繁育種苗的方法包括外植體滅菌、初代誘導、繼代增殖、生根、移栽過程 (1)外植體滅菌過程 取牛大力成熟黑色種子，用體積百分濃度為O. 05%洗潔精溶液浸泡lOmin，再經流水沖洗15min，在超凈工作臺上用O.1 % HgCl2溶液滅菌16min，然后用無菌水搖蕩洗滌4次，再用無菌吸水紙將水分吸干后接種至初代誘導培養基； (2)初代誘導過程 將步驟(I)滅菌好的種子接種至初代誘導培養基MS+3. Omg Γ'Θ-ΒΑ+Ι. 5mg -L^KT+O. 2mg · L^NAA+SOOmg · T1PVP上進行種子萌發及叢生芽誘導培養，此過程的培養時間<25d ； 所述培養基附加30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，pH6. O,配制分裝后，于121°C滅菌20分鐘，培養條件為26±2°C、光照強度2000Lx、光照時間10h/d ； (3)繼代增殖過程 將步驟(2)初代誘導培養獲得的叢生芽切下含2-3個芽的芽叢轉接到繼代培養基MS+2 Omg Ll-BA+O. 5mg L^KT+O. 2mg L^TDZ+O. 2mg .L4NAA 中進行增殖培養，周期為 20_25d，增殖倍數為9. 68/20d ； 所述培養基附加30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，pH6. O,配制分裝后，于121°C滅菌20分鐘，培養條件為26±2°C、光照強度2000Lx、光照時間10h/d ； (4)生根過程 當繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉接到生根培養基1/2MS+2. 5mg · L^IBA+l. 5mg · T1IAA中誘導生根，培養7d開始長根原基，25d后得到瓶苗，可以開蓋煉苗； 所述培養基附加30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，pH6.0，配制分裝后，于121°C滅菌20分鐘，培養條件為26±2°C、光照強度2000Lx、光照時間10h/d ； (5)移栽過程 把步驟(4)生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗4d，然后用鑷子將瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培養基，移栽到細河沙上，移栽后IOd內保持相對濕度95%左右，溫度白天控制在23-25°C，夜間15-18°C，沒有直射光的條件，移栽成活率84. 07%,移栽15d后即可上杯種植，30d后可進行大田栽培。
全文摘要
本發明公開了一種牛大力種子直接誘導叢生芽并快速繁育種苗的方法。本方法牛大力種子為外植體直接誘導叢生芽，繁育種苗的方法包括外植體滅菌、初代誘導、繼代增殖、生根、移栽過程得到牛大力種苗。本發明的優點本發明提供的整套方法操作簡便，生產成本低，增殖速度快，生根移栽成活率高，便于大規模工業化生產應用，可大量、快速、持續獲得高質量的牛大力試管苗，實用性強。
文檔編號A01H4/00GK103039361SQ20131001086
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月11日 優先權日2013年1月11日
發明者姚紹嫦, 白隆華, 馬小軍 申請人:廣西壯族自治區藥用植物園