專利名稱：香花槐高效組織培養和工廠化繁育的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養及擴大繁殖技術領域，具體涉及ー種香花槐的組織培養方法及工廠化擴大繁殖的方法。
背景技術：
香花槐(Robinia pseudoacacia cv.1daho)又名富貴樹,屬蝶形花科落葉喬木,原產于西班牙。香花槐樹皮褐色，光滑。株高10-12米，葉互生，光滑，鮮綠色。總狀花序腋生，作下垂狀，長8-12厘米，花紅色，芳香，在北方毎年5月和7月開兩次花，在南方每年開3-4次花。花期在五月份是30天左右、七月份20天左右、八月份15天左右、九月份10天左右，具有花朵大、花形美、花量多、花期長等特點。花不育，無莢果，不結種子。香花槐性耐寒，能抗零下25度至零下28度低溫。耐干旱、耐瘠薄、耐鹽堿，對土壌要求不嚴，酸性土，中性土及輕鹽堿土均能生長。根系十分發達，萌芽性強，生長快。香花槐葉體厚，具有較強的抗污染能力，對城市不良環境有耐性。香花槐為稀有的香花樹種，集綠化、香化、美化于一身。她的花色艷麗，芳香濃郁，且花量多，花期長，一年開兩次花；樹形蒼勁，姿態優美，可以廣泛用于園林及行道緑化，香花槐對鉛蒸汽的吸收和粉塵吸附能力強，對環境保護與空氣凈化的功能顯著，香花槐被譽為21世紀黃金樹，為園林緑化首推速生觀賞樹種。利用香花槐抗早、耐寒、速生、根系發達特點，可與其它樹種配合在風沙、干旱地區大面積造林,對防風固沙，改善生態環境具有突出的作用。由于香花槐不結莢果，無種子可供繁殖，現有技術是靠埋根繁殖、枝條扦插、嫁接繁殖和組培繁殖等無性繁殖方法繁育。上述四種無性繁殖方法，無論從繁殖速度還是繁育成本最低的方法是組織培養法。有關香花槐的組織培養研究的報道較多，研究的重點是對誘導培養基、增值培養基和生根培養基的改進，以提高繁殖系數和生根率。由于香花槐具有廣泛的應用價值和美好的發展前景，進ー步開展對香花槐組織培養的研究，提高其繁殖系數及成活率有著重要的意義
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種規模化的香花槐高效組織培養和エ廠化繁育的方法，應用該方法可使香花槐的繼代繁殖達到15倍以上，使組培苗從組培室到溫室的移栽成活率達到95%以上。本發明的目的是通過如下技術方案實現的。一種香花槐高效組織培養和エ廠化繁育的方法，包括以下步驟:
(I)誘導培養
1)按MS + 6-BA 0.6-0.8 mg/L + KT 0.02-0.05 mg/L + IAA 0.05-0.1 mg/L 培養基配方配制成誘導培養基母液；
2)取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%-0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調配為PH6，在培養瓶中裝入20±3 ml培養基，制成固體誘導培養基；3)取香花槐當年生枝條，消毒后取0.5mm大小的莖尖部分，接種到誘導培養基上，每培養瓶接種I個莖尖；
4)將接種好的培養瓶放到光照強度1500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養28天，得香花槐愈傷組織塊，備用。(2)愈傷組織培養
I)按MS + 6-BA 0.3-0.5 mg/L + KT 0.05-0.08 mg/L + IM 0.1-0.15 mg/L + NM
0.08-0.1 mg/L +硼酸6.8-7.0mg/L培養基配方配制成愈傷組織培養基母液；
2)取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%_0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調配為PH6，在培養瓶中裝入20±3 ml培養基，制成固體愈傷組織培養基;
3)將誘導培養得到的香花槐愈傷組織塊在無菌環境下切成0.4-0.6 cm的小塊，接種到愈傷組織培養基上，每培養瓶接種6-8塊； 4)將接種好的培養瓶放到光照強度2500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養25天，得香花槐愈傷組織分化苗，備用。(3)繼代培養
I)按MS + 6-BA 0.2-0.3 mg/L + KT 0.05-0.08 mg/L + IAA 0.05 mg/L + GA3 1-1.2mg/L +硼酸6.8-7.0mg/L +鹿糖5 g/L培養基配方配制成繼代培養基母液；
2)取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%_0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調為PH6，在培養瓶中裝入20±3 ml培養基，制成固體繼代培養基；
3)將愈傷組織培養得到的愈傷組織分化苗在無菌環境下按一芽ー節切段，接種到繼代培養基上，每培養瓶接種8-10節段；
4)將接種好的培養瓶放到光照強度2500-3500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養25天，得香花槐繼代培養苗，備用。(4)生根培養
1)按MS+ IBA 1.0-1.2 mg/L +NAA 0.01-0.02 mg/L + GA3 10.2-10.3 mg/L + 多效唑2.0-2.2 mg/L培養基配方配制成生根培養基母液；
2)取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%_0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調為PH6，在培養瓶中裝入20±3 ml培養基，制成固體生根培養基；
3)將繼代培養得到的培養苗在無菌環境下按兩芽ー節切段，接種到生根培養基上，每培養瓶接種9-10節段；
4)將接種好的培養瓶放到光照強度2000-2500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養15天，得香花槐生根苗，備用。(5)組織培養生根苗馴化
I)將裝有組織培養生根苗的培養瓶移到大棚中，不開瓶馴化，馴化條件是:光照強度2000-40001x, 18-300C ，馴化 72h ；
2)將培養瓶打開瓶蓋馴化，馴化條件是:光照強度2000-40001x，18-30°C，培養瓶內的相対濕度在90%以上，馴化48h。(6)組織培養生根苗移栽
I)把草炭土爆曬后過篩，將草炭土、蛭石、和細砂按體積比4:1:1的比例混合，用0.2%的高錳酸鉀噴灑拌均，然后用塑料膜覆蓋24h以上進行消毒，得到栽植基質，將栽植基質裝入營養缽，備用；
2)將馴化好的組織培養生根苗從培養瓶中取出，洗掉培養基，栽入裝有栽植基質的營養缽，做到根尖朝下、莖直立、淺埋、輕壓、抹平；
3)將栽好苗的營養缽排放在大棚中，大棚環境條件控制在18-30°C、相対濕度70%-90%、光照強度2000-10000LX，開始7天內通風時間要短、通風頻率要高，7天后逐漸加大通風量，組織培養生根苗在大棚中馴化23-25天。本發明的有益效果(I)采用本發明的誘導培養基，并在光照強度1500LX、23-28°C的條件下、每天光照14h誘導培養培養28天，然后采用本發明的愈傷組織培養基，在光照強度2500Lx、23-28°C的條件下、每天光照14h愈傷組織培養25天，再采用本發明的繼代培養基，在光照強度2500-3500Lx、23-28°C的條件下、每天光照14h繼代培養25天后，組培苗的增值達到了 15.2倍，比現有技術文獻報道的組培苗增值6倍提高了 2.5倍；(2)采用本發明的生根培養基，首先在光照強度2000-2500Lx、23-28°C的條件下、每天光照14h，生根培養15天，平均單株生根達到3條，然后按本發明的條件對組織培養瓶苗進行馴化，最后將組織培養瓶苗移栽到本發明的草炭土、蛭石、和細砂按體積比4:1:1的比例、消過毒的栽植基質上，按照本發明的組織培養瓶苗移栽條件進行規范化管理，移栽到大田營養缽苗的成活率達到了 95%以上，較現有技術報道的90%提高了 5個百分點；(3)經過兩年多繁殖500多萬株香花槐種苗生產的比較，采用本發明的方法較改進前的組織培養基、培養條件以及馴化方法降低生產成本6.7%。實施例1
(I)培養基的制備將培養瓶洗浄，再用純凈水沖洗，將瓊脂、培養基混合，加水定容，取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%-0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調為PH6，每個培養瓶裝入20±3 ml，然后將培養瓶裝入滅菌鍋，在121_122°C條件下滅菌20-22min，冷卻后，培養瓶出鍋時做好相關標記。各種功能的培養基的配方分別是:
A 誘導培養基配方:MS + 6-BA 0.6 mg/L + KT 0.05 mg/L + IAA 0.05 mg/L ；
B 愈傷組織培養基配方:MS + 6-BA 0.5 mg/L + KT 0.05 mg/L + IAA 0.15 mg/L +NAA 0.08 mg/L + 砸酸 6.8 mg/L ；
C 繼代培養基配方:MS + 6-BA 0.2 mg/L + KT 0.08 mg/L + IAA 0.05 mg/L + GA3
1.2 mg/L + 硼酸 7.0 mg/L + 鹿糖 5 g/L ；
D 生根培養基配方:MS + IBA 1.2 mg/L +NAA 0.01 mg/L + GA3 10.3 mg/L + 多效唑
2.0 mg/Lo(2)莖尖培養在5月份取健壯的香花槐當年生枝條，剪去葉片，自來水沖洗IOmin,取飽滿芽，依次用飽和洗衣粉水加吐溫80刷洗、自來水沖洗干凈、用75%的酒精、
0.1%升萊浸泡lOmin、無菌水沖洗5次,放入無菌培養皿內。在無菌條件下，在解剖鏡下切取0.5 mm大小的莖尖部分，接種到誘導培養基上，每培養瓶接種I個莖尖。將接種好的培養瓶放到光照強度1500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養28天，得香花槐愈傷組織塊。

(3)愈傷組織培養將誘導培養得到的愈傷組織塊在無菌環境下切成0.4-0.6 cm的小塊，接種到愈傷組織培養基上，每培養瓶接種6-8塊，將接種好的培養瓶放到光照強度2500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養25天，得到香花槐愈傷組織分化苗。(4)繼代培養將愈傷組織培養得到的愈傷組織分化苗在無菌環境下按一芽一節切段，接種到繼代培養基上，每培養瓶接種8-10節段，將接種好的培養瓶放到光照強度2500-3500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養25天，得香花槐繼代培養苗。(5)生根培養將繼代培養得到的培養苗在無菌環境下按兩芽ー節切段，接種到生根培養基上，每培養瓶接種9-10節段，將接種好的培養瓶放到光照強度2000-2500LX、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養15天，得香花槐生根苗。(6)組織培養生根苗馴化首先將裝有組織培養生根苗的培養瓶移到大棚中，不開瓶馴化，馴化條件是:光照強度2000-40001X，18-30°C，馴化72h ;然后將培養瓶打開瓶蓋馴化，馴化條件是:光照強度2000-40001x，18-300C，培養瓶內的相対濕度在90%以上，馴化48h。(7)組織培養生根苗移栽把草炭土爆曬后過篩，將草炭土、蛭石、和細砂按體積比4:1:1的比例混合，用0.2%的高錳酸鉀噴灑拌均，然后用塑料膜覆蓋24h以上進行消毒，得到栽植基質，將栽植基質裝入營養缽；將馴化好的組織培養生根苗從培養瓶中取出，洗掉培養基，栽入裝有栽植基質的營養缽，做到根尖朝下、莖直立、淺埋、輕壓、抹平；將栽好苗的營養缽排放在大棚中，大棚環境條件控制在18-30°C、相対濕度70%-90%、光照強度2000-10000Lx,開始7天內通風時間要短、通風頻率要高，7天后逐漸加大通風量，組織培養生根苗在大棚中馴化23-25天，成活率達到95%以上，然后即可栽植到大田。實施例2
(I)培養基的制備培養基的制備方法同實施例1，各種功能的培養基的配方分別
是:
A 誘導培養基配方:MS + 6-BA 0.8 mg/L + KT 0.02 mg/L + IAA 0.1 mg/L ；
B 愈傷組織培養基配方:MS + 6-BA 0.3 mg/L + KT 0.08 mg/L + IAA 0.1 mg/L + NM
0.1 mg/L + 硼酸 7.0mg/L ；
C 繼代培養基配方:MS + 6-BA 0.3 mg/L + KT 0.05 mg/L + IAA 0.05 mg/L + GA3lmg/L + 硼酸 6.8 mg/L+ 鹿糖 5 g/L ；
D 生根培養基配方:MS + IBA 1.0 mg/L +NAA 0.02 mg/L + GA3 10.2 mg/L + 多效唑
2.2 mg/し (2)莖尖培養、愈傷組織培養、繼代培養、生根培養、組織培養瓶苗馴化、組織培養瓶苗移栽方法及條件同實施例1。
權利要求
1.一種香花槐高效組織培養和工廠化繁育的方法，包括以下步驟: (1)誘導培養1)按MS + 6-BA 0.6-0.8 mg/L + KT 0.02-0.05 mg/L + IAA 0.05-0.1 mg/L 培養基配方配制成誘導培養基母液； 2)取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%-0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調配為PH6，在培養瓶中裝入20±3 ml培養基，制成固體誘導培養基； 3)取香花槐當年生枝條，消毒后取0.5mm大小的莖尖部分，接種到誘導培養基上，每培養瓶接種I個莖尖； 4)將接種好的培養瓶放到光照強度1500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養28天，得香花槐愈傷組織塊，備用； (2)愈傷組織培養 I)按MS + 6-BA 0.3-0.5 mg/L + KT 0.05-0.08 mg/L + IAA 0.1-0.15 mg/L + NM.0.08-0.1 mg/L +硼酸6.8-7.0mg/L培養基配方配制成愈傷組織培養基母液；2)取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%_0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調配為PH6，在培養瓶中裝入20±3 ml培養基，制成固體愈傷組織培養基; 3)將誘導培養得到的香花槐愈傷組織塊在無菌環境下切成0.4-0.6 cm的小塊，接種到愈傷組織培養基上，每培養瓶接種6-8塊； 4)將接種好的培養瓶放到光照強度2500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養25天，得香花槐愈傷組織分化苗，備用； (3)繼代培養I)按MS + 6-BA 0.2-0.3 mg/L + KT 0.05-0.08 mg/L + IAA 0.05 mg/L + GA3 1-1.2mg/L +硼酸6.8-7.0mg/L +鹿糖5 g/L培養基配方配制成繼代培養基母液；2)取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%_0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調為PH6，在培養瓶中裝入20±3 ml培養基，制成固體繼代培養基； 3)將愈傷組織培養得到的愈傷組織分化苗在無菌環境下按一芽ー節切段，接種到繼代培養基上，每培養瓶接種8-10節段； 4)將接種好的培養瓶放到光照強度2500-3500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養25天，得香花槐繼代培養苗，備用； (4)生根培養I)按MS + IBA 1.0-1.2 mg/L +NM 0.01-0.02 mg/L + GA3 10.2-10.3 mg/L + 多效唑2.0-2.2 mg/L培養基配方配制成生根培養基母液；2)取MS培養基配方質量0.65%-0.75%的瓊脂、0.09%_0.10%的椰子汁與培養基母液混合均勻，將培養基調為PH6，在培養瓶中裝入20±3 ml培養基，制成固體生根培養基； 3)將繼代培養得到的培養苗在無菌環境下按兩芽ー節切段，接種到生根培養基上，每培養瓶接種9-10節段； 4)將接種好的培養瓶放到光照強度2000-2500Lx、23-28°C的條件下，每天光照14h，培養15天，得香花槐生根苗，備用； (5)組織培養生根苗馴化I)將裝有組織培養生根苗的培養瓶移到大棚中，不開瓶馴化，馴化條件是:光照強度2000-40001x, 18-30°C，馴化 72h ； 2)將培養瓶打開瓶蓋馴化，馴化條件是:光照強度2000-40001x，18-30°C，培養瓶內的相対濕度在90%以上，馴化48h ； (6)組織培養生根苗移栽 1)把草炭土爆曬后過篩，將草炭土、蛭石、和細砂按體積比4:1:1的比例混合，用0.2%的高錳酸鉀噴灑拌均，然后用塑料膜覆蓋24h以上進行消毒，得到栽植基質，將栽植基質裝入營養缽，備用； 2)將馴化好的組織培養生根苗從培養瓶中取出，洗掉培養基，栽入裝有栽植基質的營養缽，做到根尖朝下、莖直立、淺埋、輕壓、抹平； 3)將栽好苗的營養缽排放在大棚中，大棚環境條件控制在18-30°C、相対濕度70%-90%、光照強度2000-10000LX，開始7天內通風時間要短、通風頻率要高，7天后逐漸加大通風量，組織培養生根苗 在大棚中馴化23-25天。
全文摘要
香花槐高效組織培養和工廠化繁育的方法，取香花槐當年生枝條，消毒后取莖尖接種到誘導培養基，培養得香花槐愈傷組織塊；將愈傷組織塊切成小塊接種到愈傷組織培養基，培養得香花槐愈傷組織分化苗；將分化苗接種到繼代培養基，培養得香花槐繼代培養苗；將繼代培養苗接種到生根培養基，培養得香花槐生根苗；將裝有生根苗的培養瓶移到大棚中，先不開瓶馴化，再打開瓶蓋馴化；把草炭土、蛭石、和細砂按一定比例混合，噴灑高錳酸鉀和塑料膜覆蓋消毒后，作為栽植基質裝入營養缽；將馴化好的生根苗栽入營養缽，在大棚中馴化一段時間即可向大田移栽。采用本發明方法組培苗的增值達到了15.2倍，移栽到大田營養缽苗的成活率達到了95%以上，降低生產成本6.7%。
文檔編號A01H4/00GK103081805SQ20131001070
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月13日 優先權日2013年1月13日
發明者王宇, 劉偉, 武時春, 喬晉萍, 翟春雷, 滕躍中, 蘇彩霞, 牛鑒, 牛清 申請人:山西金貝植物科技開發有限責任公司